低溫乳酸菌系馴化及其在玉米秸稈與馬鈴薯渣混合發(fā)酵中的接種效果

賈軍 ，曹文悅 ，晏磊 ，高亞梅 ，王彥杰 ，曲永利 ，王偉東

（1.黑龍江八一農(nóng)墾大學生命科學技術學院，大慶 163319；2.黑龍江八一農(nóng)墾大學動物科技學院）

低溫乳酸菌系馴化及其在玉米秸稈與馬鈴薯渣混合發(fā)酵中的接種效果

賈軍1，曹文悅1，晏磊1，高亞梅1，王彥杰1，曲永利2，王偉東1

（1.黑龍江八一農(nóng)墾大學生命科學技術學院，大慶 163319；2.黑龍江八一農(nóng)墾大學動物科技學院）

為了構建一種在低溫條件下使玉米秸稈與馬鈴薯渣混合飼料良好發(fā)酵的復合菌系，通過連續(xù)限制性培養(yǎng)的方法，在10℃條件下靜止培養(yǎng)，以pH值作為指標，獲得一組使玉米秸稈與馬鈴薯渣混合飼料發(fā)酵的低溫復合菌系。結果表明，在接種后7 d，低溫乳酸菌復合系的pH可以下降到4以下。通過高通量測序結果表明，低溫乳酸菌復合系的細菌組成在屬的水平上主要為乳桿菌屬（lactobacillus，72.8%），Candidatus Solibacter，2.2%，嗜酸棲熱菌屬（Acidothermus，0.8%）。接種乳酸菌復合菌系處理的發(fā)酵物有強烈的芳香氣味，發(fā)酵15 d后，在發(fā)酵液中檢測到大量乳酸和甘油。說明接種低溫乳酸菌復合菌系可以明顯改善玉米秸稈與馬鈴薯渣混合發(fā)酵飼料的品質(zhì)。

低溫；乳酸復合菌系；玉米秸稈；馬鈴薯渣；飼料

玉米秸稈是最豐富的農(nóng)作物資源之一，中國玉米秸稈年產(chǎn)量約7億t，占全國秸稈年產(chǎn)量56.6%[1]。世界第四大糧食作物是馬鈴薯，僅次于小麥、水稻和玉米[2]。據(jù)聯(lián)合國糧農(nóng)組織統(tǒng)計，我國的馬鈴薯種植面積超過530多萬hm2，年產(chǎn)量已突破8 000萬t，馬鈴薯種植面積和總產(chǎn)量均躍居世界前列[3]。我國每年資源化利用的秸稈量約1.82 t[4]。秸稈焚燒造成嚴重的環(huán)境污染和巨大的資源浪費。同時，加工1 t馬鈴薯會產(chǎn)生9 t馬鈴薯淀粉渣，2010年我國馬鈴薯加工產(chǎn)業(yè)消耗馬鈴薯300萬t，生產(chǎn)淀粉產(chǎn)生的馬鈴薯淀粉渣約為2 700萬t[5-6]，基本沒有無害化處理而丟棄，造成嚴重的環(huán)境污染。因此，開發(fā)出能夠把秸稈和馬鈴薯渣資源化利用的技術，對于治理環(huán)境污染，促進相關產(chǎn)業(yè)發(fā)展意義重大。利用馬鈴薯渣和玉米秸稈混合發(fā)酵生產(chǎn)動物飼料，是可行的技術途徑之一。

在我國北方，玉米收獲、馬鈴薯收獲和加工都是在9月以后，此時環(huán)境平均溫度已經(jīng)下降到10℃以下。在北方玉米秸稈和馬鈴薯渣混合發(fā)酵生產(chǎn)飼料的主要限制因素有：收獲后的玉米秸稈與馬鈴薯渣的儲運問題，發(fā)酵溫度低的問題[7]，發(fā)酵方式和發(fā)酵配方合理性問題等。一些研究者就上述問題開展過相關研究，如，惠文森[8]在室溫條件下用酵母菌對玉米秸稈成功的進行發(fā)酵試驗，發(fā)現(xiàn)在一定程度上提高粗蛋白和粗脂肪的含量。王彥杰[9]通過連續(xù)限制性培養(yǎng)的方法在低溫下獲得了低溫乳酸菌復合菌系，接種于干秸稈中可促進低溫微貯進程，提高飼料品質(zhì)。李娟[10]以馬鈴薯渣和玉米秸稈為主要原料，多菌種混合固態(tài)發(fā)酵生產(chǎn)蛋白飼料，顯著提高了發(fā)酵物中的粗蛋白質(zhì)和純蛋白質(zhì)含量。但是，針對于收獲后玉米秸稈和馬鈴薯渣混合發(fā)酵用低溫發(fā)酵菌劑及其應用效果的研究鮮有報道。

試驗以玉米秸稈和馬鈴薯渣為主要處理對象，篩選富集了一組10℃低溫乳酸菌復合系，分析了菌系的微生物多樣性，并研究了接種低溫乳酸菌復合菌系對于玉米秸稈和馬鈴薯渣混合發(fā)酵的影響。以期為寒區(qū)秸稈和馬鈴薯渣等農(nóng)業(yè)廢棄物的資源化利用行的技術途徑和技術支持。

1 材料與方法

1.1 低溫乳酸菌復合菌系的馴化

試驗樣品采自黑龍江省克山農(nóng)場的奶牛小區(qū)的玉米青貯窖，從新鮮的青貯料中取樣200 g，用無菌封口袋保存，現(xiàn)場取樣后放在4℃冷藏待用。

乳酸菌的限制性培養(yǎng)采用MRS培養(yǎng)基（蛋白胨10 g，牛肉膏 10 g，酵母提取物 5 g，K2HPO42 g，檸檬酸氫二銨 2 g，乙酸鈉 5 g，葡萄糖 20 g，吐溫 801 mL，Mg－SO4·7H2O 0.5 g，MnSO4·4H2O 0.25 g，蒸餾水1 L），調(diào)節(jié)pH為6.2，121℃滅菌20 min，冷卻后4℃保存待用。

取45 mL MRS培養(yǎng)基裝入50 mL螺口離心管中，加入2 g玉米秸稈青貯原料，作為原代，10℃靜置培養(yǎng)。培養(yǎng)24 h后，按1%（體積分數(shù)比）的接種量，接入已滅菌的裝有50 mL培養(yǎng)基的螺口試管中，在10℃條件下靜置培養(yǎng)，連續(xù)培養(yǎng)7 d，每天定時檢測培養(yǎng)液的pH值變化，連續(xù)繼代培養(yǎng)20代，獲得pH值下降基本穩(wěn)定和菌種組成穩(wěn)定的培養(yǎng)物。

1.2 低溫乳酸菌復合系指標檢測

1.2.1 低溫乳酸菌復合系pH的測定

在培養(yǎng)的當天，第 1、2、3、4、5 d 時，用移液器在無菌操作臺內(nèi)取樣200 μL，用HORIBA-212型酸度計測定培養(yǎng)液的pH。

1.2.2 低溫乳酸菌復合系微生物量的測定

在培養(yǎng)的當天，1、2、3、4、5 d 時，取培養(yǎng)液于 2 mL離心管中，12 000 rpm離心10 min，棄上清，在波長為600 nm條件下測定吸光值，以不接菌的MRS培養(yǎng)基作為對照，測定復合菌系在生長過程中的微生物量。

1.2.3 低溫乳酸菌復合系有機酸和醇含量測定

在復合菌系發(fā)酵的第5 d取發(fā)酵液2 mL，經(jīng)12 000 rpm離心10 min后，取上清用0.45 μm的濾膜過濾，用高效液相色方法測定乳酸，乙酸，丙酸，甘油等成分含量。色譜條件：色譜柱：美國安捷倫1 200（300 mm×7.8 mm，5 μm），氫型色譜柱，流動相：2.5 mmol·L-1硫酸水溶液，流動相比例始終不變，流速：0.55 mL·min-1，柱溫：室溫，檢測波長：210 nm，檢測器為示差折光檢測器。

1.2.4 低溫乳酸菌復合菌系組成多樣性分析

復合系在MRS培養(yǎng)基中培養(yǎng)24 h時，取6 mL發(fā)酵液12 000 rpm離心10 min，棄上清，用氯化芐法提取其總DNA[11]。

提取樣品總DNA后，根據(jù)細菌V3+V4區(qū)設計得到引物，合并引物接頭，進行PCR擴增并對其產(chǎn)物進行純化、定量和均一化形成測序文庫，建好的文庫先進行文庫質(zhì)檢，質(zhì)檢合格的文庫用Illumina MiSeq PE300進行測序。對序列進行聚類，將97%相似性的序列聚類成為 OTUs（Operational Taxonomic Units）。按眾數(shù)原則對序列進行注釋，對序列進行物種注釋，統(tǒng)計每個樣品中在屬和種分類水平上的菌群做聚類，用相同顏色表示該屬類所含的OTU序列豐度的相對高低。

1.3 低溫乳酸菌復合菌系的接種效果及指標測定

1.3.1 發(fā)酵產(chǎn)物pH的測定

將玉米秸稈和馬鈴薯渣粉碎，玉米秸稈過65目篩。按照玉米秸稈與馬鈴薯渣重量比為3∶1的比例添加，并且添加麩皮1%，玉米面1%，尿素2%，將低溫乳酸菌復合系均勻噴灑在發(fā)酵物表面，接種量為1%，含水率調(diào)節(jié)為70%，裝于100 mL螺口瓶壓實，用封口膜封口。10℃條件下發(fā)酵。以等量滅菌的MRS培養(yǎng)基處理作對照，每個處理重復三次，設置6次處理，在發(fā)酵的當天，2、5、7、10、15 d 時進行 pH 分析測定[12]。

1.3.2 發(fā)酵產(chǎn)物干物質(zhì)、ADF和NDF的測定

稱取發(fā)酵15 d后樣品，105℃烘干8 h后，測定干物質(zhì)含量，后粉碎，過40目篩，稱取粉碎后樣品1 g，利用纖維素分析儀測定酸性洗滌纖維ADF和中性洗滌纖維NDF[13]。

1.3.3 發(fā)酵產(chǎn)物有機酸和醇含量測定

取發(fā)酵15 d后的發(fā)酵液2 mL，經(jīng)12 000 rpm離心10 min后，取上清用0.45 μm的濾膜過濾，用高效液相色方法測定乳酸，乙酸，丙酸，甘油等成分含量。色譜條件：色譜柱：美國安捷倫1 200（300 mm×7.8 mm，5 μm），氫型色譜柱，流動相：2.5 mmol·L 硫酸水溶液，流動相比例始終不變，流速：0.55 mL·min-1，柱溫：室溫，檢測波長：210 nm，檢測器為示差折光檢測器[14]。

2 結果

2.1 低溫乳酸菌復合菌系的馴化及指標

2.1.1 低溫乳酸菌復合系的馴化

將青貯原料接種到MRS培養(yǎng)液，進行連續(xù)繼代培養(yǎng)獲得了一組功能和組成穩(wěn)定的復合系。篩選過程中，第2、4、6、8和10代菌群發(fā)酵液的pH值如表1所示。在10℃條件下培養(yǎng)，培養(yǎng)到第3 d時，pH可迅速下降到4.2左右，之后pH下降緩慢，直到發(fā)酵的第5 d，pH穩(wěn)定在3.6左右，各代pH變化趨勢相差不大。從pH指標衡量，復合菌系性質(zhì)已經(jīng)穩(wěn)定。

2.1.2 低溫乳酸菌復合菌系生長曲線

取第20代的低溫乳酸菌復合系進行微生物量的測定，從接種后的第0 d開始，每天定時取樣，測定其在600 nm下的吸光值，以監(jiān)測其生長過程中微生物量的變化，結果，如圖1所示。由中可以看出，從整體上來說，微生物量隨著培養(yǎng)的進行而不斷增大。在培養(yǎng)的前3 d里，微生物量直線上升，由接種初期的0.582增加到3.498，從第4 d開始，微生物量增加緩慢，到第7 d時，微生物量趨于穩(wěn)定，穩(wěn)定在3.433~3.498之間。

表1 復合菌系在MRS培養(yǎng)基中發(fā)酵過程中的pH變化Table 1 Change of pH of bacterial community in MRS culture medium during fermentation

圖1 復合菌系在MRS培養(yǎng)基中生長過程中微生物量的變化Fig.1 Dynamic trends of OD value of bacterial community in MRS culture medium

2.1.3 低溫乳酸菌復合菌系發(fā)酵過程中的產(chǎn)物分析

利用高效液相色譜法測定培養(yǎng)液中有機酸等含量成分，其乳酸、乙酸、乙醇含量分別為1.19 g·L-1，0.3 g·L-1，0.15 g·L-1，未檢測到丁酸（圖 2）?？梢娫趶秃暇蹬囵B(yǎng)5 d時，復合菌系培養(yǎng)液中含量最多的有機酸為乳酸。這表明此復合系可以接種于玉米秸稈與馬鈴薯渣混合發(fā)酵飼料中，并且有利于提高混合發(fā)酵飼料的品質(zhì)。

圖2 復合菌系發(fā)酵產(chǎn)物含量Fig.2 The organic acids concentration in the products of composite bacterial community

2.1.4 低溫乳酸菌復合菌系組成多樣性分析

采用細菌16SrDNA高通量測序技術一共得到優(yōu)化序列78 937條，平均長度462 bp，GC（%）含量為54.2%（表2），測序深度超過99.9%，理論上測序數(shù)據(jù)已經(jīng)覆蓋了樣本中的全部序列。對序列隨機抽樣，統(tǒng)計抽樣樣本的序列數(shù)及其OUT數(shù)目，繪制稀釋性曲線（圖3）?？梢钥吹角€已經(jīng)近平臺期，說明更大的測序量不會引起OUT數(shù)目的顯著增加，基于現(xiàn)有的數(shù)據(jù)量分析結果是準確可靠的。

表2 樣品測序數(shù)據(jù)處理結果統(tǒng)計Table 2 Sample sequence data processing and statistics

圖3 樣品稀釋曲線Fig.3 Dilution curve of samples

按相似度97%進行聚類分析，一共獲得1 148個OUTs（表3），對樣本的OUT多樣性進行分析，發(fā)現(xiàn)Simpson指數(shù)為 0.295 307，Shannon指數(shù)為2.860 409。對序列進行隨機抽樣，統(tǒng)計抽樣樣本的序列數(shù)和shannon指數(shù)，發(fā)現(xiàn)曲線已經(jīng)到達平臺期（圖4），說明更多的測序量已經(jīng)不會引起物種多樣性的增加，基于現(xiàn)有的數(shù)據(jù)量分析結果準確可靠。

表3 細菌組成豐度和多樣性指數(shù)Table 3 Richness and diversity index of bacterial community

圖4 多樣性指數(shù)Fig.4 Relationship between Shannon-Wiener index

以OUT的物種分類結果為依據(jù)，分別在屬和種兩個分類級別上對樣本中細菌的種類和相對豐度進行分析。在屬的分類水平上分析可見，復合系主要由乳桿菌屬（lactobacillus，72.8%），Candidatus Solibacter，2.2%，嗜酸棲熱菌屬（Acidothermus，0.8%），芽孢桿菌屬（Bacillus，0.7%）構成，進一步在種水平上分析可知，復合系主要由副干酪乳桿菌（Lactobacillus paracasei，52.4%），乳酸腸球菌（Enterococcus faecium，0.6%），食烷菌（Alcanivorax dieselolei，0.5%）組成（圖 5）。

圖5 物種的種屬分布圖Fig.5 Distribution of genera

2.2 低溫乳酸菌復合菌系的接種效果

2.2.1 發(fā)酵產(chǎn)物pH的測定

利用復合系對重量比為3∶1的玉米秸稈馬鈴薯渣混合飼料進行發(fā)酵，發(fā)酵過程中發(fā)現(xiàn)，隨著培養(yǎng)時間的延長，接種復合菌的發(fā)酵物從第2 d開始有微芳香味，之后芳香味越來越濃，到第7 d味道達到最大。pH變化情況如表4所示，可知接種復合系的第2 d，pH從6.6迅速降到5，而對照組pH從6.6降到5.7。接種復合系的發(fā)酵物質(zhì)的pH第5 d就可以降到4.1左右，而對照組的pH第5 d才降到4.5。由此可以判斷，接種復合系不僅促進了pH的快速降低，創(chuàng)造了酸性環(huán)境，還可以抑制有害微生物的增長。

表4 接種復合菌系的玉米秸稈與馬鈴薯渣混合發(fā)酵過程pH的變化Table 4 Change of pH during mixed fermentation of corn stalk and potato residue after inoculated treatments

2.2.2 發(fā)酵產(chǎn)物干物質(zhì)、ADF和NDF的測定

由圖6結果可見，將接種復合系處理的混合發(fā)酵飼料和不接菌處理的混合發(fā)酵飼料的干物質(zhì)進行了比較。二者的干物質(zhì)變化整體趨勢相同，均為先升高后降低。接種復合系的混合發(fā)酵飼料和不接菌混合發(fā)酵飼料的干物質(zhì)發(fā)酵15 d后，分別達到了47%和48.3%。接種復合系處理的試驗組與不接菌處理的對照組相比干物質(zhì)減少了1.3%，差異不顯著。

圖6 接種復合系干物質(zhì)含量的變化Fig.6 Dry matter change of composite bacterial community after inoculated treatments

由圖7圖8可知，接種復合系處理的混合發(fā)酵飼料和不接菌處理的混合發(fā)酵飼料的中性洗滌纖維和酸性洗滌纖維均成下降趨勢。發(fā)酵15 d后，接種復合系處理組的酸性洗滌纖維可降低到40.5%，而不接復合系處理的對照組的酸性洗滌纖維只減少到49.2%。接種復合系處理組的中性洗滌纖維可降低到71.4%，而不接復合系處理的對照組的中性洗滌纖維只減少到73.1%。結果表明，在馬鈴薯渣與玉米秸稈混合發(fā)酵飼料中接種此復合菌系可以降低中性洗滌纖維與酸性洗滌纖維含量，與對照組相比差異顯著。

2.2.3 發(fā)酵產(chǎn)物有機酸和醇的測定

使用高效液相方法檢測接種低溫乳酸菌復合系的玉米秸稈和馬鈴薯渣混合發(fā)酵飼料的發(fā)酵液有機酸含量（圖9），使用峰面積外標法對產(chǎn)物進行定量分析，與對照組相比，接種處理的乳酸和乙醇含量都要高于對照組，接種處理組的乳酸含量達到1.11 g·L-1，而對照組的乳酸含量只有0.57 g·L-1。接種處理組在發(fā)酵的第15 d甘油含量為0.11 g·L-1，而對照組沒有檢測到甘油（表5）。說明此復合可以促進發(fā)酵過程并且產(chǎn)生大量乳酸和甘油，有利于提高玉米秸稈與馬鈴薯渣混合發(fā)酵飼料的品質(zhì)。

圖7 接種復合系酸性洗滌纖維含量的變化Fig.7 ADF change of composite bacterial community after inoculated treatments

圖8 接種復合系對中性洗滌纖維含量的變化Fig.8 NDF change of composite bacterial community after inoculated treatments

圖9 接種發(fā)酵15 d后發(fā)酵液有機酸含量Fig.9 The organic acid in inoculation of composite bacterial community after 15 days

表5 接種復合系發(fā)酵15 d后有機酸含量（g·L-1）Table 5 The organic acid in inoculation after 15 days

3 討論與結論

關于利用微生物來發(fā)酵處理粗飼料到目前已經(jīng)有很多報道，大多是依靠一種菌或者兩種菌的簡單組合來完成。研究表明，在飼料發(fā)酵中，利用復合系發(fā)酵的飼料產(chǎn)乳酸量要高于單一菌種或幾種菌的人工組合，并且接種復合系發(fā)酵效的飼料營養(yǎng)價值要優(yōu)于單一菌種或幾種菌的人工組合[15-16]。利用復合系為飼料的接菌劑已經(jīng)成為飼料業(yè)發(fā)展的必然趨勢。

目前，由于研究目的和應用技術的不同，對利用乳酸菌復合系發(fā)酵的研究領域和深度也有不同的觀點。大多數(shù)的研究主要是幾種在常溫乳酸菌復合菌系的研究，高麗娟[16]等將篩選的常溫乳酸菌復合系接種于水稻、玉米、小麥秸稈，發(fā)現(xiàn)接種復合系的秸稈發(fā)酵產(chǎn)物中乳酸含量非常高，為18.53 g·kg-1，并檢測到可以提高飼料風味的甘油、乙醇等物質(zhì)。賴玉嬌[17]等以紫花苜蓿為原料，添加不同乳酸菌劑，在常溫條件下發(fā)酵發(fā)現(xiàn)，乳酸菌劑能在一定程度上通過保護真蛋白含量和提高快速降解碳水化合物組分及非結構性碳水化合物含量，從而提高苜蓿青貯營養(yǎng)價值。綜合所述，發(fā)酵通常在常溫下進行，對于在低溫下向秸稈中接種微生物菌劑進行發(fā)酵的研究較少。

針對東北寒區(qū)秋季秸稈與馬鈴薯收獲后，環(huán)境溫度低的特點，試驗以玉米秸稈青貯飼料中的自然菌為基礎，通過長期限制培養(yǎng)和定向馴化，篩選到一組能在10℃條件下快速生長，使pH快速降低的低溫乳酸菌復合菌系，復合菌系培養(yǎng)液中檢測到乳酸、乙酸和甘油，其中以乳酸含量最為豐富。此復合菌系可在低溫條件下使玉米秸稈與馬鈴薯渣的混合發(fā)酵飼料的pH值快速下降，隨著發(fā)酵時間的進行，中性洗滌纖維和酸性洗滌纖維含量也明顯降低。通過高效液相結果可看出，接種復合菌系的發(fā)酵產(chǎn)物中乳酸含量比對照組多，并且檢測到甘油，而對照組沒有。結果表明接種此低溫復合系可以改善飼料風味并且提高飼料的適口性和風味，有效降低玉米秸稈與馬鈴薯淀粉渣混合飼料的pH值，抑制腐敗菌的繁殖，提高秸稈飼料的營養(yǎng)價值。因此，低溫復合系在東北寒區(qū)的飼料業(yè)具有很好的應用潛力和發(fā)展前景。

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Domestication of Lactic Acid Bacterial Community at Low Temperature and the Effect of Inoculation on Mixed Fermentation Fodder with Corn Stalks and Potato Residues

Jia Jun1，Cao Wenyue1，Yan Lei1，Gao Yamei1，Wang Yanjie1，Qu Yongli2，Wang Weidong1
（1.College of Life Science and Technology，Heilongjiang Bayi Agricultural University，Daqing 163319；2.College of Animal Science and Technology，Heilongjiang Bayi Agricultural University）

In order to get a composite microbial system used for fermenting mixing stalks of corn and potato residue to produce feeds at low temperature，the limited cultivation method and stable cultivating were carried out at 10 ℃ and pH value was used as the indicator of fermentation effect.The results showed that a composite microbial system capable of high lactic acid production was screened.After first 7 days of inoculation，the pH of microbial composite system could drops below 4.The results of high-throughput sequencing showed that mainly microbial in the genus classification levels was lactobacillus 72.8%，Candidatus Solibacter 2.2%and Acidothermus 0.8%.After 15 days of inoculation，the strong fragrant smell was emitted from feed of inoculated treatment.At the same time，a large number of lactic acid and glycerol were detected in the inoculated treatment.Therefore，the feed quality of mixed fermentation with corn stalk and potato residues could be improved by inoculation of the bacteria community.

low temperature；lactic acid bacteria community；corn stalk；potato residues；fodder

Q89

A

1002-2090（2017）06-0033-07

10.3969/j.issn.1002-2090.2017.06.009

2016-09-12

“十二五”國家科技攻關計劃項目（2012BAD12B05-3）；黑龍江農(nóng)墾總局科技攻關項目（HNK125B-11-11A，HNK135-04-08）。

賈軍（1991-），女，黑龍江八一農(nóng)墾大學生命科學技術學院2014級碩士研究生。

王偉東，男，教授，博士研究生導師，E-mail：wwdcyy@126.com。