不同SSR標記檢測技術(shù)在蕓豆品種的遺傳多樣分析中的應(yīng)用

楊義杰 ，王穎 ，，張東杰 ，沈琰 ，張桂芳 ，趙雅楠

（1.黑龍江八一農(nóng)墾大學(xué)食品學(xué)院，大慶 163319；2.國家雜糧工程技術(shù)研究中心）

不同SSR標記檢測技術(shù)在蕓豆品種的遺傳多樣分析中的應(yīng)用

楊義杰1，王穎1，2，張東杰1，沈琰1，張桂芳2，趙雅楠1

（1.黑龍江八一農(nóng)墾大學(xué)食品學(xué)院，大慶 163319；2.國家雜糧工程技術(shù)研究中心）

以黑龍江省20份蕓豆品種為材料，分別應(yīng)用銀染法和熒光檢測法檢測8對SSR引物的擴增產(chǎn)物。聚類分析表明，兩種方法均能將供試品種鑒別開，熒光檢測法的等位變異及PIC較聚丙烯酰胺凝膠電泳檢測更多更高，熒光檢測法檢測出的遺傳多樣性指數(shù)略高于銀染法。結(jié)果表明熒光檢測法較銀染法靈敏度更高、檢測結(jié)果更準確，更適于用于遺傳多樣性分析。

蕓豆；SSR；銀染法；熒光檢測法；遺傳多樣性

目前檢測SSR-PCR產(chǎn)物的方法主要包括3種：（1）瓊脂糖凝膠電泳（AGE），在電泳操作中，需用溴化乙錠（EB）做染料，EB具有強致癌性，對身體有害，且分辨率低，常用于產(chǎn)物的初步檢測。（2）聚丙烯酰胺凝膠電泳（PAGE），分辨率較高（測序膠可檢測到1 bp的核苷酸差異），但操作過程復(fù)雜，檢測耗時耗力。（3）熒光標記-毛細管電泳檢測法，檢測擴增產(chǎn)物以峰的形式表現(xiàn)，顯示擴增片段的大小，具有高分辨率、高通量及分析過程自動化等優(yōu)點[1-3]。利用SSR熒光標記檢測技術(shù)已經(jīng)在小麥、水稻、玉米等多種作物種質(zhì)資源的評價和遺傳多樣性分析等方面均有應(yīng)用[4-6]。在對蕓豆的研究中還未見報道。為促進SSR熒光標記技術(shù)在蕓豆中的應(yīng)用，研究對SSR標記銀染法和熒光檢測法2種檢測方法進行比較，分別應(yīng)用PAGE-銀染法和熒光檢測法對黑龍江省部分種質(zhì)進行遺傳多樣性分析，為SSR檢測技術(shù)的選擇提供參考。

1 材料與方法

1.1 材料

供試材料來源于黑龍江省代表性且栽培面積大的20份蕓豆品種（表1）。引物為前期篩選8對核心引物，具體信息見表2。

表1 20份供試材料Table 1 20 cultivars of kidney bean for SSR analysis

表2 8對引物序列Table 2 8 pairs of primer sequences

1.2 實驗方法

1.2.1 基因組提取

20個蕓豆品種基因組提取取新鮮菜豆葉片約0.2 g于研缽中，加入液氮迅速研磨成粉末。提取總DNA方法為采用改良的2%的CTAB法[7-9]，用瓊脂糖凝膠電泳和分光光度計檢測總DNA后稀釋成100 ng·μL-1，儲存于-20℃?zhèn)溆谩?/p>

1.2.2 熒光引物與普通引物的PCR擴增

基于非變性聚丙烯酰胺結(jié)合銀染技術(shù)的PCR擴增反應(yīng)體系配置（表3）：

表3 SSR標記20 μL體積擴增反應(yīng)體系Table 3 The reaction of SSR markers in the 20 μL volume

PCR擴增程序：94℃預(yù)變性2 min；94℃變性15 s，依據(jù)各引物退火溫度復(fù)性15 s，72℃延伸30 s，共35個循環(huán)；最終72℃延伸10 min。

基于毛細管電泳的熒光電泳檢測技術(shù)的PCR擴增反應(yīng)體系配置見表4。

表4 SSR標記20 μL體積擴增反應(yīng)體系Table 4 The reaction of SSR markers in the 20 μL volume

PCR擴增程序：94℃預(yù)變性2 min；94℃變性15 s，依據(jù)各引物退火溫度復(fù)性15 s，72℃延伸30 s，共35個循環(huán)；最終72℃延伸10 min。

1.2.3 不同檢測方法檢測擴增產(chǎn)物

（1）聚丙烯酰胺凝膠電泳檢測

擴增產(chǎn)物采用8%非變性聚丙烯酰胺凝膠電泳檢測，電泳在Sequi-Gen GT核酸電泳系統(tǒng) （Bio-Rad，USA）中進行。然后通過改良的銀染方法進行染色：固定液（含50%乙醇和2%的醋酸）固定3 min；倒掉固定液，蒸餾水洗1次，時間30 s，加入染色液（0.2%的硝酸銀）染色5 min；倒掉染色液，蒸餾水洗2次，每次時間30 s，加入顯色液（3%NaOH和0.5%甲醛），至譜帶清晰為止，拍照統(tǒng)計位點[10]。

（2）毛細管電泳檢測

首先，利用瓊脂糖凝膠電泳對所有擴增產(chǎn)物檢測，每個樣品取5 μL產(chǎn)物，電泳90 V電壓約1 h。若結(jié)果良好則進行毛細管電泳檢測。

將甲酰胺與分子量內(nèi)標按100∶1的體積比混勻后，取15 μL加入上樣板中，再加入1 μL稀釋10倍的PCR產(chǎn)物。然后使用3730XL測序儀進行毛細管電泳，利用Genemarker中的Fragment（Plant）片段分析軟件對測序儀得到的原始數(shù)據(jù)進行分析，將各泳道內(nèi)分子量內(nèi)標的位置與各樣品峰值的位置做比較分析，得到片段大小[11-13]。

1.2.4 數(shù)據(jù)統(tǒng)計與分析

聚丙烯酰胺凝膠電泳檢測數(shù)據(jù)記錄在相同遷移位置，有帶記作1，無帶記作0；將熒光檢測法得到峰圖同樣轉(zhuǎn)化成0、1字符串，有效峰記為1，無效記為0。將兩個檢測方法所得到的數(shù)據(jù)均利用NTSYS-pc 2.10e軟件計算供試材料的遺傳距離，采用類平均法UPGMA聚類分析；利用Popgene version 1.32軟件計算Nei基因多樣性指數(shù)H和Shannon信息指數(shù)I。

2 結(jié)果與分析

2.1 熒光檢測法與銀染法的比較

應(yīng)用8對具多態(tài)性且特異性好的引物對黑龍江省20個蕓豆品種進行擴增，經(jīng)聚丙烯酰胺凝膠電泳-銀染法進行電泳檢測，8個SSR標記共檢測出40個等位基因，每個位點檢測出的等位基因數(shù)為4~7個，平均每個位點5個，多態(tài)性信息指數(shù)PIC范圍為0.568 8~0.801 4，平均0.685 0；通過毛細管電泳檢測共檢測到61個等位基因，每個位點檢測出的等位基因數(shù)為6~11個，平均7.62個多態(tài)性信息指數(shù)PIC范圍為 0.678 9~0.820 5，平均 0.759 7（表 5）。

表5 2種方法檢測出的等位變異的對比Table 5 Comparison of allelic variations obtained by the two detection methods

毛細管電泳技術(shù)在每個位點平均檢測到的等位變異比PAGE-銀染法多2個，且PIC含量要高于PAGE檢測的PIC，表明熒光檢測法具有更高的靈敏性，更適于做遺傳遺傳多樣性分析。

2.2 兩種檢測技術(shù)對黑龍江省蕓豆的遺傳多樣性分析

2.2.1 銀染法檢測分析蕓豆遺傳多樣性

根據(jù)PAGE-銀染對蕓豆的檢測數(shù)據(jù)來看，8對引物能夠?qū)?0個品種完全區(qū)分，品種間遺傳相似系數(shù)為0.38~0.95之間，聚類圖顯示在遺傳相似系數(shù)0.47處將20份蕓豆品種分為2個類群，如圖1所示，第Ⅰ類即奶花蕓豆、紅花蕓豆與小黑蕓豆共3個品種，其余17個品種為第Ⅱ類。在遺傳相似系數(shù)0.65處將20份蕓豆品種分為4個類群，第Ⅰ類包括奶花蕓豆、紅花蕓豆與小黑蕓豆；第Ⅱ類包括白花腰豆；第Ⅲ類包括兔子腿、黑花蕓豆、窩朗豆、60天還家、花臉豆2號、特大莢、花蕓豆、黃蕓豆；第Ⅳ類包括雜花豆1號、矮飯豆、花腰豆、紫白花豆、大馬掌、花臉豆1號、雙色蕓豆、雜花蕓豆。

利用POPGENE軟件進行多樣性分析，結(jié)果表明，反映蕓豆品種遺傳多樣性Shannon信息指數(shù)I為1.149 1~1.821 7，Nei基因多樣性指數(shù)H為0.617 3~0.825 0（表 6）。

圖1 20個蕓豆品種聚類分析圖（PAGE）Fig.1 UPGMA dendrogram of 20 common bean cultivars（PAGE）

表6 2種方法檢測出的遺傳多樣指數(shù)的對比Table 6 Comparison of genetic diversity index by the two detection methods

2.2.2 熒光檢測法分析蕓豆遺傳多樣性

熒光檢測法數(shù)據(jù)顯示，8對引物能夠?qū)?0個品種完全區(qū)分開，品種間遺傳相似系數(shù)為0.52~0.92。聚類圖顯示在遺傳相似系數(shù)0.64處將20份蕓豆品種分為2個類群，第Ⅰ類群為小黑蕓豆，第Ⅱ類為其余19個品種。在遺傳相似系數(shù)0.67出將將20份蕓豆品種分為3個亞類群，第一亞類群為小黑蕓豆，第二亞類群兔子腿、白花腰豆、雜花蕓豆、大馬掌、黃蕓豆、紫白花豆及花臉豆，第三亞類群為雜花豆1號、花腰豆、紅花蕓豆、花臉豆、矮飯豆、60天還家、窩朗豆、奶花蕓豆、特大莢、花蕓豆（YD8）、黑花蕓豆、雙色蕓豆。

同樣利用POPGENE軟件進行多樣性分析，結(jié)果顯示，Shannon信息指數(shù) I為 1.467 0~1.993 9，Nei基因多樣性指數(shù)H為0.723 7~0.826 5（表6）。

圖2 20個蕓豆品種聚類分析圖（毛細管電泳）Fig.2 UPGMA dendrogram of 20 common bean cultivars（CE）

2.2.3 2種檢測法分析蕓豆品種遺傳多樣性的差異

PAGE-銀染與熒光檢測法檢測分析的結(jié)果均顯示出，黑龍江省蕓豆品種遺傳多樣性較高。銀染法相似系數(shù)0.38~0.95，小黑蕓豆與雙色蕓豆之間相似系數(shù)最小為0.38，而熒光檢測法的相似系數(shù)是0.52~0.92，小黑蕓豆與雙色蕓豆之間相似系數(shù)最小0.52。兩者檢測方法均表明二者親緣關(guān)系較遠。而銀染法相似系數(shù)最大的是60天還家與花臉豆（YD17），熒光檢測法的相似系數(shù)最大的是紅花蕓豆與花腰豆，兩者檢測的結(jié)果不同。

熒光檢測法檢測出的遺傳多樣性指數(shù)略高于銀染法，可能是由于熒光檢測法檢出一些等位變異，在銀染中未檢測出（例如引物BM160銀染法檢測出7個等位變異，熒光檢測出11個），而這些等位變異可能體現(xiàn)了品種間遺傳背景的不同，銀染法卻無法檢測出這些等位基因，即一些信息被掩蓋了。

3 結(jié)論與討論

研究對常規(guī)銀染法和熒光檢測法2種檢測SSR-PCR產(chǎn)物的方法進行了比較，選取8對多態(tài)性及特異性較好的引物，分別用銀染法和熒光檢測法對20個黑龍江省20個品種進行遺傳多樣性分析。兩種方法均能將供試品種鑒別開，但由于熒光檢測法可檢測到的等位變異數(shù)量較銀染法更多、更精確，可將具有相似遺傳背景的品種有效區(qū)分。因此，熒光檢測法反映的品種間的遺傳多樣性較銀染法略高。

熒光檢測法得到的等位基因差異最小為2 bp，PAGE-銀染測法得到的等位基因差異最小為4 bp。毛細管電泳熒光檢測法檢測樣品時含有分子量內(nèi)標，DNA片段大小與其泳道內(nèi)分子量內(nèi)標相比就可精確獲得。而變性PAGE銀染法檢測的不同樣品DNA片段大小，所得片段大小只能用肉眼與分子量標準（Marker）相比較估測得出，且離Marker泳道較遠的泳道的數(shù)據(jù)準確性也會受到一些影響。銀染法數(shù)據(jù)收集依賴于人工讀帶，會有人為誤差。而熒光標記技術(shù)自動智能化，在數(shù)據(jù)收集、處理上采用軟件分析，工作效率大大提高，數(shù)據(jù)更加準確。

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Application of Different SSR Markers Detection Technology on Genetic Diversity Analysis of Common Bean Varieties

Yang Yijie1，Wang Ying1,2，Zhang Dongjie1，Shen Yan1，Zhang Guifang2，Zhao Yanan1
（1.College of Food，Heilongjiang Bayi Agricultural University，Daqing 163319；2.National Coarse Cereals Engineering Research Center）

20 kidney bean cultivars from Heilongjiang Province as materials，silver staining and fluorescence detection were applied to detect 8 pairs of SSR primers amplified products.Cluster analysis showed that both two methods could identify the tested varieties，compared with polyacrylamide gel electrophoresis detection，equipotential variation and PIC of fluorescence detection method could detect much more and higher，the genetic diversity index by fluorescence detection method was higher than that of silver staining method.The results showed that the fluorescence detection method was more sensitive and accurate than the silver staining method，and it was more suitable for the analysis of genetic diversity.

Common bean（Phaseolus vulgaris）；SSR；silver-staining；fluorescence detection；genetic diversity

S529

A

1002-2090（2017）06-0001-05

10.3969/j.issn.1002-2090.2017.06.001

2016-06-22

黑龍江省應(yīng)用技術(shù)與開發(fā)重大項目（GA14B104）；“十二五”農(nóng)村領(lǐng)域國家科技計劃項目（2012BAD34B02）。

楊義杰（1989－），女，黑龍江八一農(nóng)墾大學(xué)食品學(xué)院2013級碩士研究生。

張東杰，男，教授，博士研究生導(dǎo)師，E-mail：zdj_66@126.com。