肺痿論治干預(yù)肺纖維化大鼠肺功能的實驗研究

康荻 李彧 朱曼 唐磊 申萌萌 常立國 黃春芳 王繼峰 牛建昭 李亞東

摘要 目的：比較麥門冬湯和甘草干姜湯在肺纖維化階段對大鼠模型肺功能的干預(yù)作用。方法：用博萊霉素造模14 d的SD大鼠，灌胃麥門冬湯（7.5 g/kg、15 g/kg、30 g/kg）和甘草干姜湯組（3.75 g/kg、7.5 g/kg、15 g/kg），模型組和正常組大鼠灌胃等體積飲用水。中藥灌胃14 d后檢測用力肺活量（FVC）、肺動態(tài)順應(yīng)性（Cdyn）、0.4秒率（FEV0.4/FVC%）、呼氣峰值流速（PEF）、最大呼氣中期流速（MMF）等指標(biāo)，檢測血氣變化，稱量臟器質(zhì)量、計算臟器系數(shù)，HE染色觀察肺組織病理。結(jié)果：麥門冬湯高劑量組能夠降低模型動物肺臟質(zhì)量、肺臟系數(shù)（P<0.05），提高肺順應(yīng)性、FVC和質(zhì)量FVC（P<0.05）；甘草干姜湯高劑量能夠改善肺順應(yīng)性和FVC（P<0.05）；甘草干姜湯中劑量能夠改善質(zhì)量FVC、降低0.4秒率（P<0.05），保護非纖維化區(qū)肺泡結(jié)構(gòu)；甘草干姜湯能夠提高肺纖維化大鼠的PO2和SO2（P<0.05）。結(jié)論：麥門冬湯和甘草干姜湯對博萊霉素所致肺纖維化大鼠肺臟功能均具有改善作用，前者主要是改善氣道周圍纖維化區(qū)的間質(zhì)增生，后者主要是保護非纖維化區(qū)的肺泡結(jié)構(gòu)和功能。

關(guān)鍵詞 甘草干姜湯；麥門冬湯；質(zhì)量FVC；血氣分析；肺順應(yīng)性

Abstract Objective：To observe different effects of Maimendong Decotion and Gancao GanjiangDecotionin on pulmonary fibrosis rat in the stage of fibrotic phase.Methods：After 14 days of establishing rat model by intratracheal injection of bleomycin，Maimendong decotion（7.5 g/kg，15 g/kg，30 g/kg） and Gancao Ganjiang decotion（3.75 g/kg，7.5 g/kg，15 g/kg） were given by gavage once a day for 2 week.Meanwhile，the model group and the normal group were administered with distilled water of same quantity.After gavage of decotion for 14 days，the forced vital capacity （FVC），the indexes of lung dynamic compliance（Cdyn），the ratio of FEV 0.4 to forced vital capacity（FEV0.4/FVC%），peak expiratory flow rate （PEF），maximal mid-expiratory flow rate （MMF） and the blood gas changes were recorded，then the organ coefficients were calculated，lung tissue and airway pathologic changes were observed by HE staining.Results：Compared with the model group，the high dose group of Maimendong decotion reduced the lung weight and lung index significantly（P<0.05），and increased Cdyn，F(xiàn)VC and FVC/lung weight significantly（P<0.05）.The Cdyn and FVC of high dose group of Gancao Ganjiang decotion were higher than the model group（P<0.05）.The intermediate-dose Gancao Ganjiang decotion improved FVC/lung weight （P<0.05） and reduced the rate of FEV0.4/FVC% significantly （P<0.05） compared with the model group.Gancao Ganjiang decoction improved PO2 and SO2 significantly compared to model group（P<0.05）.Conclusion：Both Maimendong decotion and Gancao Ganjiang decotion are better for the rat model of bleomycin induced pulmonary fibrosis.The former can reduce the interstitial hyperplasia around the airway in fibrosis area，and the latter protect the structure and function of the alveolar in non-fibrosis area.

Key Words Gancao Ganjiang Decotion； Maimendong Decotion； FVC/lung weight； Blood gas analysis； Dynamic compliance

中圖分類號：R285.5文獻標(biāo)識碼：Adoi：10.3969/j.issn.1673-7202.2017.02.038

肺痿一詞出自張仲景《金匱要略·肺痿肺癰咳嗽上氣病脈證治第七》，屬于中醫(yī)病名，結(jié)合歷代醫(yī)家論述及現(xiàn)代臨床觀察發(fā)現(xiàn)中醫(yī)所論肺痿與肺纖維化疾病相關(guān)[1]，并有多位中醫(yī)專家提出了從肺痿論治肺纖維化的思路[2-3]?！督饏T》論治虛熱肺痿，“止逆下氣”用麥門冬湯；論治虛寒肺痿，溫扶陽氣用甘草干姜湯[4]。甕恒[5]等通過臨床觀察發(fā)現(xiàn)麥門冬湯能夠改善特發(fā)性肺纖維化患者的肺功能；陸國輝等[6]則發(fā)現(xiàn)甘草干姜湯能夠減輕博萊霉素導(dǎo)致的大鼠模型肺纖維化程度，可見肺痿論治的2組中藥方劑具有一定抗肺纖維化效果，但未見比較二者的生物藥效機制。而臨床肺纖維化患者病因病機紛繁復(fù)雜，證候輾轉(zhuǎn)，博萊霉素所致肺纖維大鼠模型化進展明確、病理穩(wěn)定[7]，是國際上使用最廣泛的鼠類肺纖維化造模方法[8]。我們擬通過灌胃麥門冬湯和甘草干姜湯比較肺痿論治的2組方劑在該模型肺纖維化階段的干預(yù)效果。

1 材料與方法

1.1 動物 SPF級雄性SD大鼠54只，12～13周齡，購于北京維通利華實驗動物技術(shù)有限公司（動物合格證號為11400700093856），動物許可證號為SCXK（京）2012-0001。

1.2 試劑 中藥飲片由河北美威藥業(yè)股份有限公司提供，注射用鹽酸博萊霉素15 mg/瓶（日本化藥株式會社產(chǎn)品，批號：650472）。

1.3 儀器 動物肺功能儀（北京貝蘭博科技有限公司生產(chǎn)，AniRes 2005）；i-STAT200便攜式血氣分析儀及血氣測試芯片EG3+（雅培，美國）；數(shù)字切片掃描儀（由日本濱松光子學(xué)株式會社生產(chǎn)，NanoZoomer-SQ）；電子天平（梅特勒-托利多儀器（上海）有限公司，AL204）。

1.4 方法

1.4.1 中藥湯劑制備 麥門冬湯（麥冬42 g，甘草6 g，生曬參9 g，梗米10 g，半夏6 g，大棗20 g）和甘草干姜湯（炙甘草12 g，干姜6 g）按照人民衛(wèi)生出版社《方劑學(xué)》第七版組方，均采用水煎提取2次，合并濾液濃縮至生藥濃度麥門冬湯4 g/mL，甘草干姜湯2 g/mL，置于4 ℃冰箱保存?zhèn)溆谩?/p>

1.4.2 模型制備與分組 在符合清潔級標(biāo)準(zhǔn)的實驗室（溫度22～25 ℃，濕度50%～70%）適應(yīng)飼養(yǎng)2周后，隨機分為8組：正常組、模型組、麥低組、麥中組、麥高組、甘低組、甘中組、甘高組。正常組不加任何干預(yù)，其他各組大鼠于14周齡進行氣管內(nèi)注射博萊霉素（5 mg/kg），建立肺纖維模型。造模后第14天麥低組、麥中組、麥高組分別按7.5 g/kg、15 g/kg、30 g/kg的濃度灌胃麥門冬湯水煎液，甘低組、甘中組、甘高組分別按3.75 g/kg、7.5 g/kg、15 g/kg的濃度灌胃甘草干姜湯水煎液，模型組灌胃等量飲用水，連續(xù)給藥14 d。

1.4.3 檢測指標(biāo)與方法

1.4.3.1 肺功能檢測 按設(shè)備提供的實驗技術(shù)指導(dǎo)調(diào)試儀器確認系統(tǒng)正常。1%戊巴比妥鈉按（70 mg/kg）腹腔內(nèi)注射進行麻醉。行氣管切開術(shù)后插管，將插管與氣管結(jié)扎固定，以仰臥位將大鼠置于體描箱內(nèi)，啟動呼吸機，設(shè)置呼吸比20∶10，呼吸頻率75次/min。以壓力控制方式（30 cmH2O）檢測用力肺活量（FVC）、肺動態(tài)順應(yīng)性（Cdyn）、0.4秒率（FEV0.4/FVC%）、呼氣峰值流速（PEF）、最大呼氣中期流速（MMF）等功能指標(biāo)。

1.4.3.2 臟器系數(shù)的計算 肺功能檢測完成后，腹主動脈放血處死動物，取出肺臟，去除肺外支氣管；取脾臟，剔除白色脂肪組織及系膜；取腎臟，剝除臟膜。電子天平稱重，根據(jù)臟器系數(shù)計算公式：臟器系數(shù)=臟器質(zhì)量（g）/動物體重（g）×100%。

1.4.3.3 病理觀察 取左肺，4%甲醛溶液固定，石蠟包埋，冠狀面切片，行HE染色。用數(shù)字切片掃描儀獲取切片圖像進行肺組織病理觀察。

1.4.3.4 血氣分析 肺功能檢測結(jié)束后迅速打開腹腔，腹主動脈取血0.5 mL進行血氣分析。測定酸堿度（pH）、氧分壓（PO2）、二氧化碳分壓（PCO2）、氧飽和度（SO2）等。

1.5 統(tǒng)計學(xué)方法 應(yīng)用SPSS 17.0軟件對數(shù)據(jù)進行統(tǒng)計分析：計量資料用均數(shù)±標(biāo)準(zhǔn)差（±s）表示。符合正態(tài)分布的計量資料采用單因素ANOVA進行檢驗；對于不符合正態(tài)分布的計量資料，采用秩和檢驗。以雙側(cè)P<0.05為差異有統(tǒng)計學(xué)意義。

2 結(jié)果

2.1 臟器質(zhì)量和臟器系數(shù)

氣管內(nèi)注射博萊霉素造成模型大鼠肺纖維化，模型組體重相對于正常組下降顯著（P<0.05），由于氣管內(nèi)注射容易受麻醉狀態(tài)和個體差異影響造成體重標(biāo)準(zhǔn)差較正常組增加；與模型組相比灌胃2種方劑體重比較，差異無統(tǒng)計學(xué)意義；模型組大鼠由于炎性反應(yīng)和間質(zhì)增生造成肺臟質(zhì)量、肺臟系數(shù)增加顯著（P<0.05），麥高組能夠降低病變肺臟的質(zhì)量和肺臟系數(shù)（P<0.05）。見表1。

2.2 氣道阻力及肺順應(yīng)性

與正常組相比所有致纖維化組均出現(xiàn)呼氣相氣道阻力（Re）升高（P<0.05），結(jié)合這些致纖維化組相對正常組動態(tài)順應(yīng)性（Cydn）下降（P<0.05），提示病變可能由氣道障礙和（或）肺間質(zhì)增生導(dǎo)致氣腔張力增加所致；其中麥高組和甘高組相對模型組Cydn顯著升高（P<0.05）。見表2。

2.3 肺功能檢測結(jié)果

模型組與正常組大鼠相比PEF和MMF均降低（P<0.05），提示存在氣道阻礙；結(jié)合FVC比正常組顯著降低（P<0.05），降幅超過80%（參考臨床），而0.4秒率（FEV0.4/FVC%）升高（P<0.05），提示博萊霉素所致肺纖維為限制性伴阻塞性（或限閉性）肺功能障礙。麥高組能夠提高模型動物FVC（P<0.05），甘中組則降低模型動物的0.4秒率（P<0.05），同時改善氣道阻力（P<0.05）。見表3。

2.4 質(zhì)量FVC

質(zhì)量FVC是FVC/肺質(zhì)量的比值，由圖1可見博萊霉素能夠引起模型組動物質(zhì)量FVC顯著下降，而灌胃麥門冬湯中、高劑量和甘草干姜湯中、高組劑量均能升高病變動物的質(zhì)量FVC（P<0.05）。

2.5 血氣分析

模型組動物腹主動脈血氧分壓（PO2）和血氧飽和度（SO2）相對于正常組下降（P<0.05）。2種方劑各劑量組的血氣結(jié)果差異無統(tǒng)計學(xué)意義，故將各組結(jié)果合并比較發(fā)現(xiàn)：相對于模型組，甘草干姜湯能夠提高PO2和SO2（P<0.05），麥門冬湯只能單純升高PO2，SO2差異無統(tǒng)計學(xué)意義。見表4。

2.6 病理觀察

模型大鼠肺組織病理可分為纖維化區(qū)和非纖維化區(qū)，纖維化區(qū)由于肺泡被填充或間質(zhì)增生塌陷，已喪失氣體交換能力，因此考慮觀察非纖維化區(qū)的肺泡結(jié)構(gòu)來分析氣血功能。正常組肺泡壁自然回彈，肺泡上皮細胞間距離縮短、排列整齊；毛細血管床豐富，可見紅細胞分布。模型組可見肺泡間質(zhì)內(nèi)成纖維細胞增生，肥厚的肺泡壁回彈受阻，肺泡腔增大；毛細血管床受壓、血流受阻，可見紅細胞分布減少。麥中組肺間質(zhì)也明顯可見成纖維細胞填充，紅細胞分布減少。甘中組肺間質(zhì)較少受累于成纖維細胞，可見豐富的毛細血管床和大量紅細胞分布。見圖2。

3 討論

質(zhì)量FVC（FVC/肺質(zhì)量單位）是課題組在實驗中摸索的一個用于反應(yīng)纖維化過程中肺組織結(jié)構(gòu)與功能關(guān)系的指標(biāo)。隨著肺纖維化進展，肺臟質(zhì)量增加，而FVC下降（受到增生的肺間質(zhì)限制和或正常肺泡區(qū)域占比減少）。FVC/肺質(zhì)量相對更加全面評價纖維化的病變程度，能夠避免病理切片由于取材部位不均和個體差異的影響。從實驗結(jié)果來看：質(zhì)量FVC能夠靈敏的反應(yīng)出用藥組與模型組間的差異，而單純肺臟質(zhì)量、肺臟系數(shù)以及肺功能的各項指標(biāo)均未能靈敏地反映出用藥組的變化。

李瑞琴[9]等曾探討麥門冬湯對肺纖維化早期炎性反應(yīng)的影響，楊美鳳[10]等則研究了麥門冬湯對肺纖維化形成階段的影響。本研究認為中醫(yī)肺痿已遠離早期炎性反應(yīng)，多已進入肺纖維化進展階段，故將給藥時間窗調(diào)整到造模14 d開始，此時已進入纖維化期[7]。結(jié)果發(fā)現(xiàn)灌胃麥門冬湯高劑量能夠改善病理，與楊美鳳等[10]一致；此外還能夠降低肺臟質(zhì)量、肺臟系數(shù)，提示纖維化大鼠的炎性反應(yīng)或ECM沉積得到改善；結(jié)合肺順應(yīng)性、FVC和質(zhì)量FVC同時升高，明確高劑量麥門冬湯確實能夠改善肺功能。但0.4秒率卻未見好轉(zhuǎn)，結(jié)合仍存在氣道功能障礙以及病理可見博萊霉素所致肺纖維化為氣道中心性病變，提示高劑量麥門冬湯對于肺功能的改善可能得益于對氣道周圍纖維化區(qū)的緩解。

甘草干姜湯高劑量對于肺功能的影響與灌胃麥門冬湯高劑量十分類似，但肺質(zhì)量和肺臟系數(shù)未見改善，提示甘草干姜湯高劑量組對于肺功能的改善可能不在纖維化區(qū)，而是對非纖維化區(qū)肺泡功能的改善，中劑量組0.4秒率明顯改善也進一步證明了這一點。病理結(jié)果可見甘草干姜湯中劑量組能夠抑制正常肺泡區(qū)間質(zhì)增生，保持肺泡正常結(jié)構(gòu)，延緩纖維化進展。其分子機制可能與陸國輝等[6]報道甘草干姜湯能夠下調(diào)TGF-β1、Smad3和SIRT1蛋白表達，并上調(diào)Smad7蛋白表達有關(guān)。血氣分析結(jié)果則顯示甘草干姜湯能夠升高纖維化大鼠動脈血的PO2和SO2，也進一步證實甘草干姜湯能夠改善肺泡的氣體交換功能。孫成成等[11]報道1/10的肺纖維化住院患者使用了復(fù)方甘草，覃冬云等[12]發(fā)現(xiàn)甘草酸對血清和組胺誘發(fā)的大鼠氣道平滑肌細胞的增生具有抑制作用；營大禮[13]報道干姜能夠改善局部血液循環(huán)，進一步提示甘草干姜湯的藥效作用可能在于保護和改善肺泡功能。

最新的肺纖維化診斷共識強調(diào)肺纖維化患者肺功能主要表現(xiàn)為限制性通氣功能障礙、彌散量降低伴低氧血癥或Ⅰ型呼吸衰竭[14]。而麥門冬湯和甘草干姜湯對于博萊霉素所致肺纖維化大鼠模型的肺功能均具有改善作用，前者主要是改善氣道周圍纖維化區(qū)的間質(zhì)增生，后者主要是保護非纖維化區(qū)肺泡結(jié)構(gòu)和改善氣體交換功能，提示臨床用藥是否也存在相似機制，根據(jù)2組方劑的作用特點是可否通過交替服用改善肺纖維化患者肺功能值得思考。

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