• <tr id="yyy80"></tr>
  • <sup id="yyy80"></sup>
  • <tfoot id="yyy80"><noscript id="yyy80"></noscript></tfoot>
  • 99热精品在线国产_美女午夜性视频免费_国产精品国产高清国产av_av欧美777_自拍偷自拍亚洲精品老妇_亚洲熟女精品中文字幕_www日本黄色视频网_国产精品野战在线观看 ?

    JAK2-STAT3信號通路在樹鼩腦缺血后適應(yīng)中的作用機(jī)制*

    2017-12-22 09:09:18李樹清
    中國病理生理雜志 2017年12期
    關(guān)鍵詞:皮層腦缺血磷酸化

    李 霞, 李樹清

    (昆明醫(yī)科大學(xué)病理生理學(xué)教研室, 云南 昆明 650500)

    JAK2-STAT3信號通路在樹鼩腦缺血后適應(yīng)中的作用機(jī)制*

    李 霞, 李樹清△

    (昆明醫(yī)科大學(xué)病理生理學(xué)教研室, 云南 昆明 650500)

    目的觀察JAK2-STAT3信號轉(zhuǎn)導(dǎo)通路在樹鼩缺血后適應(yīng)(ischemic postconditioning,IPoC)神經(jīng)保護(hù)中的調(diào)控作用,探討阻斷JAK2-STAT3通路后腦損傷加重的機(jī)制。方法通過光化學(xué)反應(yīng)建立樹鼩血栓性腦缺血模型;于缺血后4 h夾閉患側(cè)頸總動脈3次(每次5 min)實施IPoC。于IPoC前10 min側(cè)腦室注射AG490(JAK2抑制劑)后,采用TTC染色觀察樹鼩腦梗死面積的變化,通過HE染色和電鏡觀察腦皮層神經(jīng)元形態(tài)改變及超微結(jié)構(gòu)變化,應(yīng)用Western blot檢測IPoC及AG490處理后皮層t-STAT3和p-STAT3蛋白水平的變化。結(jié)果缺血24 h,皮層神經(jīng)元固縮,線粒體腫脹,嵴溶解;腦梗死面積占半腦面積的(24.78±3.30)%;此時皮層神經(jīng)元STAT3磷酸化水平明顯增高(P<0.01)。IPoC后皮層神經(jīng)元損傷減輕,線粒體腫脹改善,腦梗死面積占半腦面積的百分比減小為(17.67±1.83)%(P<0.01),STAT3磷酸化水平進(jìn)一步增高(P<0.01)。然而,給予AG490處理后,皮層神經(jīng)元損傷加重,腦梗死面積再次增大為(23.85±2.77)%(P<0.05),STAT3磷酸化水平則明顯降低(P<0.05)。結(jié)論IPoC可能通過調(diào)控STAT3的磷酸化而減輕樹鼩缺血性腦損傷,抑制JAK2-STAT3信號通路可抵消IPoC的保護(hù)效應(yīng)而加重腦損傷。

    光化學(xué)反應(yīng); 缺血后適應(yīng); JAK2-STAT3信號通路; 神經(jīng)保護(hù); 樹鼩

    缺血性腦卒中是人類致殘、致死的常見多發(fā)病,有關(guān)腦缺血治療的研究多集中在神經(jīng)保護(hù)藥物的評估與開發(fā)上,盡管這些研究對當(dāng)前和將來均具有重要意義[1],但腦缺血的死亡率一直居高不下,腦保護(hù)研究依然是國內(nèi)外缺血性腦血管病治療的重要領(lǐng)域。業(yè)已證明,通過反復(fù)3次夾閉頸總動脈實施非藥物干預(yù),即缺血后適應(yīng)(ischemic postconditioning,IPoC),可使局部腦血流(regional cerebral blood flow,rCBF)在不輸液或用藥的前提下逐步回升至正常rCBF的56%以上[2]。IPoC可以激活機(jī)體內(nèi)源性保護(hù)機(jī)制,減輕腦缺血再灌注損傷[2],與缺血預(yù)適應(yīng)(ischemic preconditioning,IPC)相比,IPoC具有明顯的可預(yù)見性,且易于操作,因而更具臨床應(yīng)用價值,是近年腦保護(hù)策略由神經(jīng)保護(hù)向細(xì)胞保護(hù)轉(zhuǎn)變的重要轉(zhuǎn)折。IPoC的神經(jīng)保護(hù)機(jī)制較為復(fù)雜,涉及多條細(xì)胞內(nèi)信號轉(zhuǎn)導(dǎo)通路的活化,目前國內(nèi)外對IPoC腦保護(hù)機(jī)制的研究主要涉及絲裂原活化蛋白激酶(mitogen-activated protein kinase,MAPK)[3]、磷脂酰肌醇3-激酶(phosphatidylinositol 3-kinase,PI3K)/Akt[4]以及蛋白激酶C(protein kinase C,PKC)通路[5]等,對其它信號通路的探索正在進(jìn)行中。研究發(fā)現(xiàn),Janus激酶2/信號轉(zhuǎn)導(dǎo)和轉(zhuǎn)錄激活蛋白3(Janus kinase 2/signal transducer and activator of transcription 3,JAK2/STAT3)是一條重要的信號通路,參與多種生理和病理過程,包括細(xì)胞生長、分化、增殖、凋亡和炎癥等[6-7]。在心肌IPoC的研究中發(fā)現(xiàn),JAK2/STAT3信號通路也參與了保護(hù)作用,其作為生存活化因子增強(qiáng)通路(survivor activating factor enhancement,SAFE)的一部分,在IPoC的心肌保護(hù)中具有抗凋亡效應(yīng)[8]。新近研究證實,STAT1活性抑制劑和DNA合成抑制劑在腦缺血的早期階段就表現(xiàn)出了神經(jīng)保護(hù)作用,其潛在的機(jī)制則與神經(jīng)細(xì)胞中STAT3的磷酸化有關(guān)[1]??梢姡沂維TAT3相關(guān)通路的激活因子,闡明其神經(jīng)保護(hù)作用的分子機(jī)制具有重要意義。而有關(guān)JAK2/STAT3信號通路是否也參與了樹鼩腦IPoC的神經(jīng)保護(hù)作用迄今未見報道,其信號通路在IPoC中的分子機(jī)制也尚未闡明。因此,本實驗通過觀察IPoC對JAK2/STAT3信號通路的影響,并應(yīng)用JAK2特異性抑制劑AG490抑制其信號通路,檢測腦缺血損傷時總STAT3(total STAT3,t-STAT3)與磷酸化STAT3(phosphorylated STAT3,p-STAT3)蛋白表達(dá)的消長變化,探討IPoC調(diào)控JAK2/STAT3信號通路的分子機(jī)制,為腦缺血的臨床治療提供新的實驗依據(jù)。

    材 料 和 方 法

    1 材料

    1.1實驗動物與分組 健康成年樹鼩60只,雌雄不限,體重(150±20) g,由中科院昆明動物所實驗中心提供 [動物合格證為SYXK(滇)K2012-0003],實驗前在清潔、安靜的環(huán)境下飼養(yǎng)。將動物隨機(jī)分為5組:假手術(shù)對照(control)組、腦缺血(ischemia)組、IPoC組、溶劑對照(IPoC+DMSO)組和AG490處理(DMSO+AG490+IPoC)組,每組5只。

    1.2主要儀器和試劑 本室研制的SQ-Ⅲ型腦血栓形成裝置(專利號:ZL201420068737.2) ,光源中心波長(λ) 560 nm,帶寬 (Δλ) 60 nm,光強(qiáng)度1.0 W/cm2,用時間繼電器控制照射時間;DSC-T30 數(shù)碼相機(jī)(SONY); JEM-100CX 型電子顯微鏡(Hitachi)。孟加拉紅(rose bengal)購自Fluka;2,3,5-三苯基氯化四氮唑(2,3,5-triphenyl tetrazolium chloride,TTC)系國藥集團(tuán)化學(xué)試劑有限公司分裝;AG490購自Abcam,用DMSO(<0.01%)溶解后配成1 mmol/L的儲存液,保存于-20 ℃;抗p-STAT3 (Thr705)和t-STAT3抗體購自CST;辣根過氧化物酶標(biāo)記的 II 抗購自ABMART;抗β-actin抗體購自Abcam。

    2 方法

    2.1樹鼩局灶性腦缺血及缺血后適應(yīng)模型的建立 采用本室研制的SQ-Ⅲ型腦血栓形成裝置復(fù)制腦缺血模型[2, 4]。以1%硫噴妥鈉溶液5 mL/kg腹腔注射麻醉動物,仰臥位固定,經(jīng)舌下靜脈注射(1.5 g/L)孟加拉玫瑰紅(rose bengal)生理鹽水溶液(1.33 mL/kg),循環(huán)10 min后,將動物改為俯臥位固定,消毒右側(cè)顳頂部皮膚,在右耳屏與右眼外眥連線中點(diǎn)做一長約1 cm切口,分離部分顳肌,暴露顱骨,此時透過顱骨可見顱內(nèi)血管,于切口處嵌入一外徑為1 cm × 2.5 cm 的消毒鋁片,其中心有一直徑為 0.5 cm 的窗孔,光束可通過該窗孔照射于顱骨表面,鋁片以外的組織用避光紙遮蓋。將動物置于腦血栓形成裝置下,照射血管15 min(時間由繼電器控制),照射期間維持顱骨表面溫度在(36±1)℃。術(shù)后取出鋁片,消毒并逐層縫合切口,保溫待動物蘇醒后放入飼養(yǎng)籠內(nèi)觀察。假手術(shù)組注射等量孟加拉玫瑰紅但不予以光照。在上述局部性腦缺血模型基礎(chǔ)上建立腦IPoC 模型[2, 4],于缺血4 h 前40 min 再次麻醉動物,仰臥位固定,消毒皮膚,做頸正中縱行切口,逐層分離皮下組織及頸闊肌,分離缺血側(cè)頸總動脈,注意保護(hù)迷走神經(jīng),以無創(chuàng)動脈夾在甲狀軟骨上緣平面夾閉頸總動脈5 min后,再灌注5 min,重復(fù)3個循環(huán),復(fù)制IPoC模型,術(shù)后消毒并逐層縫合切口,保暖回籠,見圖1。

    Figure 1. The schematic diagram of the experimental design. FC: first time clipping; SC: second time clipping; TC: third time clipping.

    圖1實驗設(shè)計示意圖

    2.2JAK2抑制劑AG490側(cè)腦室給藥 將AG490用50%的DMSO溶解后,配成1 mmol/L的儲存液,保存于-20 ℃。使用時用含50% DMSO的PBS緩沖液稀釋成50 nmol/L工作液,于缺血后適應(yīng)前10 min進(jìn)行側(cè)腦室注射。將動物俯臥位固定于腦立體定位儀上,備皮,消毒頂部皮膚,沿頂部正中線切開皮膚,暴露顱骨,在患側(cè)側(cè)腦室給予50 nmol/L的AG490溶液5 μL,注射完畢后消毒并縫合切口,保暖回籠。溶劑對照組給予等量的含50% DMSO的PBS溶液作為對照。

    2.3TTC染色及腦梗死面積測定 各組動物于腦缺血24 h后麻醉,迅速斷頭取腦,放入2% TTC 溶液中,37 ℃溫育30 min。正常腦組織經(jīng)TTC 染色呈現(xiàn)均勻紅色,而梗死區(qū)呈蒼白色,界限清楚。采用CAD 2007制圖軟件測定梗死面積占半腦面積的百分比。

    2.4HE染色及光鏡觀察腦皮層組織結(jié)構(gòu)變化 各組動物于既定時點(diǎn)再次麻醉,快速開胸并剪開心包,自心尖部插入一根聚乙烯管,使其進(jìn)入升主動脈,扎閉主動脈根部以防回流,剪開右心耳,用4℃預(yù)冷的生理鹽水(100 mL)進(jìn)行灌注,待肝臟變白后,在120 mmHg壓力下緩慢滴注4%甲醛(200 mL)內(nèi)固定2 h。固定完畢后開顱取腦,浸泡于新配制的4%甲醛中后固定24 h。常規(guī)脫水、透明、浸蠟,石蠟包埋制作蠟塊標(biāo)本,進(jìn)行HE染色,在光鏡下觀察腦皮層組織結(jié)構(gòu)及神經(jīng)元的變化。

    2.5透射電鏡觀察腦皮層神經(jīng)元超微結(jié)構(gòu)變化 各組動物于既定時點(diǎn)進(jìn)行深度麻醉后,迅速斷頭,打開顱骨,暴露缺血側(cè)皮層,在冰盤上快速切取梗死灶周圍皮層組織塊,置于3.5%戊二醛4℃預(yù)固定保存,用PBS緩沖液沖洗后,置于1%四氧鋨酸中固定24 h,再用乙醇-丙酮酸逐級脫水,Epon-618環(huán)氧丙烷滲透、包埋,經(jīng) LKBS 型超薄切片機(jī)半薄切片定位后,再進(jìn)行檸檬酸鉛-醋酸鈾雙染色,在JEM-1011 型透射電子顯微鏡下觀察皮層超微結(jié)構(gòu)。

    2.6Western blot檢測皮層t-STAT3和p-STAT3的蛋白水平 于既定時點(diǎn)麻醉動物,迅速斷頭,將大腦置于冰盤上,參照本室取材方法[17]快速切取相應(yīng)皮層組織,按每100 mg組織重量加入1 mL裂解液提取總蛋白,用BCA法測定蛋白濃度,蛋白變性后進(jìn)行SDS-PAGE, 100 V、80 min分離蛋白質(zhì),并以100 mA、55 min半干轉(zhuǎn)印到PVDF 膜上。用5% 脫脂牛奶室溫振搖封閉1 h,將抗鼠t-STAT3單克隆抗體(1∶1 000)、抗鼠p-STAT3單克隆抗體(1∶2 000)和抗鼠β-actin多克隆抗體(1∶5 000)室溫振搖2 h 后,4 ℃冰箱中孵育過夜,將辣根過氧化物酶標(biāo)記的Ⅱ抗(1∶5 000)室溫振搖,孵育2 h。ECL化學(xué)發(fā)光試劑盒進(jìn)行反應(yīng),Bio-Rad化學(xué)發(fā)光凝膠成像儀進(jìn)行顯色、成像,ImageJ 圖像分析軟件分析處理,計算目標(biāo)條帶的吸光度(A)。

    3 統(tǒng)計學(xué)處理

    實驗數(shù)據(jù)以均數(shù)±標(biāo)準(zhǔn)差(mean±SD)表示,用GraphPad Prism 5 統(tǒng)計軟件行方差齊性檢驗和單因素方差分析(one-way ANOVA),樣本均數(shù)間的兩兩比較用SNK-q檢驗。以P<0.05為差異有統(tǒng)計學(xué)意義。

    結(jié) 果

    1 IPoC及AG490 對樹鼩腦梗死面積的影響

    TTC染色后,樹鼩腦皮層光照區(qū)梗死灶明顯,呈蒼白色,邊界清楚。Ischemia組腦缺血24 h可見明顯的梗死灶,梗死面積占半腦面積的(24.78±3.3)%;實施IPoC處理后,皮層梗死面積明顯減小為(17.67±1.83)%(P<0.01),與DMSO組無明顯差異;而AG490處理后,梗死面積再次增大(23.85±2.77)%(P<0.05),見圖2。

    Figure 2. The effects of IPoC and AG490 on the infarct size 24 h after cerebral ischemia in tree shrews. Mean±SD.n=5.**P<0.01vsischemia group;△P<0.05vsIPoC group.

    圖2IPoC及AG490對樹鼩腦缺血24h梗死面積的影響

    2 IPoC及AG490 對樹鼩腦皮層神經(jīng)元組織病理學(xué)改變的影響

    光鏡下對照組樹鼩大腦皮層神經(jīng)元形態(tài)正常,見圖3A、B。腦缺血24 h后,皮層缺血中心區(qū)可見液化壞死灶,組織結(jié)構(gòu)疏松、染色變淺,神經(jīng)細(xì)胞壞死、脫失,神經(jīng)元數(shù)量減少;壞死灶周圍神經(jīng)元胞體縮小變形,核固縮,胞質(zhì)尼氏小體消失,見圖3C。IPoC處理后,皮層神經(jīng)元損傷減輕,正常神經(jīng)元增多,見圖3D。DMSO溶劑對照組皮層神經(jīng)元變化與缺血后適應(yīng)組相似,見圖3E。AG490處理組皮層神經(jīng)元損傷又有所加重,神經(jīng)元壞死增多,數(shù)量減少,見圖3F。

    Figure 3. The effects of IPoC and AG490 on the cortical neuronal changes 24 h after cerebral ischemia in tree shrews (HE staining, ×200 in A and ×400 in others). A and B: control group; C: ischemia group; D: IPoC group; E: IPoC+DMSO group; F: IPoC+AG490 group.

    圖3IPoC及AG490對樹鼩腦缺血24h后皮層神經(jīng)元改變的影響

    3 IPoC及AG490對樹鼩皮層神經(jīng)元超微結(jié)構(gòu)改變的影響

    電鏡下觀察顯示,對照組樹鼩腦皮層神經(jīng)元形態(tài)正常,邊界清楚,雙層核膜清晰可見,常染色質(zhì)豐富;線粒體形態(tài)正常,內(nèi)質(zhì)網(wǎng)排列規(guī)則,高爾基體結(jié)構(gòu)正常,見圖4A、B。腦缺血24 h后,皮層神經(jīng)元壞死,細(xì)胞水腫明顯,神經(jīng)細(xì)胞核膜邊界不清,核內(nèi)異染色質(zhì)增多;線粒體腫脹,嵴溶解、消失,或形成空泡;內(nèi)質(zhì)網(wǎng)腫脹、擴(kuò)張,見圖4C。缺血后適應(yīng)24 h,神經(jīng)元損傷減輕,細(xì)胞水腫及線粒體腫脹減輕,見圖4D。DMSO溶劑對照組皮層神經(jīng)元損傷與后適應(yīng)組變化基本相似,見圖4E。AG490處理組皮層神經(jīng)元損傷加重,核膜不清,線粒體固縮及空泡增多,見圖4F。

    Figure 4. The effects of IPoC and AG490 on the ultrastructure of cortical neurons 24 h after cerebral ischemia in tree shrews (×10 000 in A and ×25 000 in others). A and B: control group; C: ischemia group; D: IPoC group; E: IPoC+DMSO group; F: IPoC+AG490 group.

    圖4IPoC及AG490對樹鼩腦缺血24h皮層神經(jīng)元超微結(jié)構(gòu)改變的影響

    4 IPoC及AG490對樹鼩皮層t-STAT3和p-STAT3蛋白表達(dá)的影響

    Western blot 檢測結(jié)果顯示,各組皮層t-STAT3的差異無統(tǒng)計學(xué)顯著性。對照組皮層p-STAT3較少(0.04±0.01),ischemia組STAT3蛋白的磷酸化水平明顯上調(diào)(0.45±0.17,P<0.01),IPoC組STAT3的磷酸化水平較缺血組升高(0.83±0.15,P<0.01)。DMSO組STAT3的磷酸化水平與后適應(yīng)24 h組差異無統(tǒng)計學(xué)顯著性,而AG490處理24 h后STAT3的磷酸化水平明顯下降(0.36±0.05,P<0.05),見圖5。

    討 論

    資料顯示,樹鼩腦部結(jié)構(gòu)發(fā)育和顱腦血管分布與人腦較為接近,其大部分的皮層內(nèi)動脈呈直線分布,并具有密集的毛細(xì)血管網(wǎng),與人類的腦血管分布相似,因此用樹鼩作為人類腦血管疾病實驗?zāi)P鸵褌涫荜P(guān)注[9-11]。加之樹鼩的顱骨薄而透明(厚度僅為大鼠的1/3),透光性好,有利于特殊光束透過顱骨進(jìn)行光化學(xué)反應(yīng);后者選擇性損傷血管內(nèi)皮細(xì)胞,誘導(dǎo)血小板黏附、集聚而形成血栓;由于該模型不需開顱,無腦脊液外漏,樹鼩感染率低而便于長期觀察,因此與臨床缺血性腦血管疾病發(fā)生發(fā)展的病理過程十分吻合。研究證實,JAK2激酶活化后募集胞漿中以單體形式存在的STAT3分子,使與受體結(jié)合的STAT3分子磷酸化后,STAT3形成同源或異源二聚體而從受體上被釋放出來,進(jìn)入細(xì)胞核與特定的靶基因調(diào)控區(qū) DNA 結(jié)合,通過調(diào)節(jié)靶基因的表達(dá)而發(fā)揮多種生物學(xué)效應(yīng)。近年研究發(fā)現(xiàn),STAT3激活后可以減少神經(jīng)細(xì)胞凋亡、減輕氧化應(yīng)激、抑制中樞炎癥反應(yīng)和促進(jìn)血管生成[1]。隨著JAK2/STAT3信號通路在缺血性細(xì)胞損傷研究的不斷深入[12],揭示腦缺血時JAK2/STAT3表達(dá)的消長變化,尤其是IPoC調(diào)控其信號通路分子機(jī)制的探索也廣受重視。

    業(yè)已證明,梗死面積測量是反映缺血性損傷程度的重要指標(biāo)。TTC為一種光敏化合物,其與乳酸脫氫酶反應(yīng)可使正常腦組織染成紅色,而缺血性腦組織則為白色[13]。本研究的TTC染色結(jié)果顯示,腦缺血24 h后,皮層梗死灶明顯,此時神經(jīng)元的p-STAT3蛋白明顯增高,提示JAK2/STAT3信號通路已被激活,STAT3的磷酸化反應(yīng)既是缺血缺氧的原因,又是缺血耐受抗損傷的主要結(jié)果;還可能與缺血導(dǎo)致的神經(jīng)元過度興奮以及中樞炎癥反應(yīng)有關(guān)[14]。已證明,腦缺血可激活星形膠質(zhì)細(xì)胞和小膠質(zhì)細(xì)胞,并釋放細(xì)胞因子、趨化因子和生長因子而導(dǎo)致膠質(zhì)細(xì)胞與神經(jīng)元以及血管內(nèi)皮細(xì)胞之間復(fù)雜的相互作用[15],JAK2/STAT3信號通路在缺血性腦損傷中可能與調(diào)控促炎和抗炎因子之間的失衡有關(guān)[16]。研究證實,STAT蛋白主要通過JAK而直接磷酸化,經(jīng)典的JAK2/STAT3途徑如同激素信號一樣參與多種細(xì)胞因子的信號途徑[1]。大鼠腦缺血/再灌注研究發(fā)現(xiàn),JAKs聚合后又可通過自動或轉(zhuǎn)磷酸化反應(yīng)而自我激活,IPoC可以通過JAK2/STAT3信號通路減少神經(jīng)細(xì)胞凋亡,減輕炎癥反應(yīng)從而發(fā)揮腦保護(hù)作用[12]。腦缺血時,細(xì)胞ATP生成減少,STAT3的磷酸化反應(yīng)在一定的程度上可補(bǔ)償細(xì)胞能量的不足,而IPoC又可促進(jìn)JAK2/STAT3活化,使p-STAT3增多,既可緩解神經(jīng)元的能量需求,又能增強(qiáng)細(xì)胞的缺血耐受,二者共同作用可能是減輕皮質(zhì)神經(jīng)元損傷,縮小梗死面積的機(jī)制所在。此結(jié)果與我們先前關(guān)于IPoC使樹鼩缺血神經(jīng)元Akt Ser473和Thr308位點(diǎn)磷酸化的結(jié)果一致[4],且與Cheng等[13]報道的IPoC可提高大腦半暗區(qū)的細(xì)胞存活能力的結(jié)果相吻合。然而,經(jīng)STAT3抑制劑AG490處理后,神經(jīng)元STAT3磷酸化水平明顯降低,神經(jīng)元超微結(jié)構(gòu)可見核膜不清,線粒體固縮及空泡增多,缺血性損傷又有所加重;由于IPoC的保護(hù)作用因抑制劑的應(yīng)用而明顯削弱,腦梗死面積因此而擴(kuò)大。以上結(jié)果可概括為兩方面:一是IPoC可以通過激活JAK2/STAT3信號通路,減輕神經(jīng)元損傷而發(fā)揮腦保護(hù)作用;二是抑制JAK2/STAT3通路則可干擾STAT3的磷酸化而消除IPoC介導(dǎo)的腦保護(hù)效應(yīng)。IPoC不僅可改善樹鼩缺血區(qū)局部腦血流,促進(jìn)緊密連接蛋白o(hù)ccludin/ZO-1蛋白表達(dá),進(jìn)而減輕腦水腫[17];還可抑制腦組織Toll樣受體4 mRNA及髓過氧化物酶的表達(dá),減輕腦內(nèi)炎癥反應(yīng)[18];而肢體缺血后適應(yīng)也可促進(jìn)缺血腦區(qū)熱休克蛋白70表達(dá),抑制小鼠的腦缺血再灌注損傷[19]。而某些藥物如七氟醚后處理也可通過JAK2/STAT3信號通路減少線粒體ROS的產(chǎn)生而增加線粒體ATP含量,進(jìn)而減少細(xì)胞凋亡和梗塞面積[20]。事實上,IPoC介導(dǎo)的“機(jī)械信號轉(zhuǎn)導(dǎo)”及其對“JAK2/STAT3”等信號通路的調(diào)控可能在增強(qiáng)機(jī)體內(nèi)部抗損傷能力,抑制神經(jīng)元繼發(fā)性損傷中起著重要作用[17,21]。盡管JAK2/STAT3信號通路在IPoC的保護(hù)中發(fā)揮著重要作用,但目前對STAT3的上游和下游信號轉(zhuǎn)導(dǎo)及其與其它信號通路間的相互關(guān)系仍有待進(jìn)一步研究。

    Figure 5. Representative images and quantitative analysis of Western blot for determining the protein levels of t-STAT3 and p-STAT3 in ischemic cortex in tree shrews 24 h after IPoC and AG490 treatment. Mean±SD.n=5.**P<0.01vscontrol group;△△P<0.01vsischemia group;▲P<0.05vsIPoC group.

    圖5Westernblot檢測IPoC及AG490處理后皮層t-STAT3和p-STAT3蛋白水平的變化

    [1] Liang Z, Wu G, Fan C, et al. The emerging role of signal transducer and activator of transcription 3 in cerebral ischemic and hemorrhagic stroke[J]. Prog Neurobiol, 2016, 137:1-16.

    [2] 李樹清, 羅海蕓. 缺血后適應(yīng)對樹鼩海馬區(qū)腦血流及星形膠質(zhì)細(xì)胞活化的影響及可能機(jī)制[J]. 中國病理生理雜志, 2008, 24(6):1090-1095.

    [3] Gao X, Zhang H, Takahashi T, et al. The Akt signaling pathway contributes to postconditioning’s protection against stroke; the protection is associated with the MAPK and PKC pathway[J]. J Neurochem, 2008, 105(3):943-955.

    [4] 湯 諹, 李樹清, 李 凡, 等. 缺血后適應(yīng)對樹鼩海馬區(qū)神經(jīng)元信號轉(zhuǎn)導(dǎo)調(diào)控機(jī)制的研究[J]. 中國病理生理雜志, 2011, 27(3):560-565.

    [5] Shimohata T, Zhao H, Steinberg GK. PKC may contribute to the protective effect of hypothermia in a rat focal cerebral ischemia model[J]. Stroke, 2007, 38(2):375-380.

    [6] Shi X, Franko B, Frantz C, et al. JSI-124 (cucurbitacin I) inhibits Janus kinase-3/signal transducer and activator of transcription-3 signalling,downregulates nucleophosmin-anaplastic lymphoma kinase (ALK),and induces apoptosis in ALK-positive anaplastic large cell lymphoma cells[J]. Br J Haematol, 2006, 135(1):26-32.

    [7] 宗林飛, 向曉輝, 夏時海. STAT3信號轉(zhuǎn)導(dǎo)在胰腺炎發(fā)病機(jī)制中的作用[J]. 中國病理生理雜志, 2016, 32(3):558-563.

    [8] Tian Y, Zhang W, Xia D, et al. Postconditioning inhibits myocardial apoptosis during prolonged reperfusion via a JAK2-STAT3-Bcl-2 pathway[J]. J Biomed Sci, 2011, 18:53.

    [9] Reina-De La Torre F, Rodriguez-Baeza A, Sahuquillo-Barris J. Morphological characteristics and distribution pattern of the arterial vessels in human cerebral cortex: a scanning electron microscope study[J]. Anat Rec, 1998, 251(1):87-96.

    [10] Wolfrom-Gabel R, Maillot C. Vascular networks of the nucleus lentiformis[J]. Surg Radial Anat, 1994, 16(4):373-377.

    [11] Rieke GK, Bowers DE Jr, Penn P. Vascular supply pattern to rat caudatoputamen and globus pallidus: scanning electronmicroscopic study of vascular endocasts of stroke-prone vessels[J]. Stroke, 1981, 12(6):840-847.

    [12] 趙彥瑞, 劉 洋, 王 東, 等. PI3K/Akt和JAK2/STAT3信號轉(zhuǎn)導(dǎo)通路在SO2抗大鼠肢體缺血再灌注至急性肺損傷中的作用[J]. 中國病理生理雜志, 2015, 31(11): 2076-2082.

    [13] Cheng Z, Li L, Mo X, et al. Non-invasive remote limb ischemic postconditioning protects rats against focal cerebral ischemia by upregulating STAT3 and reducing apoptosis[J]. Int J Mol Med, 2014, 34(4):957-966.

    [14] Jang SS, Choi JH, Im DS, et al. The phosphorylation of STAT6 during ischemic reperfusion in rat cerebral cortex[J]. Neuroreport, 2014, 25(1):18-22.

    [15] Chen Z, Trapp BD. Microglia and neuroprotection[J]. J Neurochem, 2016, 136(Suppl 1):10-17.

    [16] Shrivastava K, Llovera G, Recasens M, et al. Temporal expression of cytokines and signal transducer and activator of transcription factor 3 activation after neonatal hypoxia/ischemia in mice[J]. Dev Neurosci, 2013, 35(2-3):212-225.

    [17] 李樹清, 李 凡, 何 亮, 等. 缺血后適應(yīng)促進(jìn)樹鼩血栓性腦缺血時緊密連接occludin /ZO-1蛋白表達(dá)及抑制腦水腫的機(jī)制[J]. 中國病理生理雜志, 2016, 32(3):477-484.

    [18] Feng R, Li S, Li F. Toll-like receptor 4 is involved in ischemic tolerance of postconditioning 6 in hippocampus of tree shrews to thrombotic cerebral ischemia[J]. Brain Res, 2011, 1384(15):118-127.

    [19] 趙 瑾, 李 楊, 黃 磊, 等. 肢體缺血后適應(yīng)對小鼠腦缺血再灌注損傷的影響及機(jī)制[J]. 中國病理生理雜志, 2010, 26(6):1096-1101.

    [20] Wu J, Yu J, Xie P, et al. Sevoflurane postconditioning protects the myocardium against ischemia reperfusion injury via activation of the JAK2-STAT3 pathway[J]. PeerJ, 2017, 5:e3196.

    [21] Lin J, Wang T, Li Y, et al. N-acetylcysteine restores sevoflurane postconditioning cardioprotection against myocardial ischemia-reperfusion injury in diabetic rats[J]. J Diabetes Res, 2016, 2016:9213034.

    Mechanism of JAK2-STAT3 signaling pathway in ischemic postconditio-ning neuroprotection after cerebral ischemia in tree shrews

    LI Xia, LI Shu-qing

    (DepartmentofPathophysiology,KunmingMedicalUniversity,Kunming650500,China.E-mail:shuqing28@hotmail.com)

    AIM: To investigate the regulatory effect of JAK2-STAT3 signaling pathway on the neuroprotection of ischemic postconditioning (IPoC) in tree shrews, and to explore the mechanisms of cerebral injury deterioration after inhibiting the JAK2-STAT3 pathway.METHODSThe model of thrombotic cerebral ischemia was induced by photochemical reaction in tree shrews and the IPoC was established at 4 h after ischemia followed by clipping ipsilateral common carotid artery on the ischemia side for 5 min (3 times). After IPoC and intracerebroventricular injection of AG490 (JAK2 inhibitor), the changes of cerebral infarction area were detected by TTC staining, and the histological and ultrastructural changes of cortical neurons were observed under light and electron microscopes, respectively. The protein levels of t-STAT3 and p-STAT3 in the cortical tissue were determined by Western blot.RESULTSThe neuronal pycnosis, mitochondrial swelling and vanish of the mitochondrial cristae were found in cortical cortex, and the infarction area was (24.78±3.30)% at 24 h after cerebral ischemia. Meanwhile, the phosphorylation level of STAT3 protein in the cortical tissue was significantly increased (P<0.01). The cortical neuronal damage and mitochondrial swelling were decreased after IPoC, the area of cerebral infarction was significantly reduced to (17.67±1.83)% (P<0.01), and the phosphorylation level of STAT3 protein was further increased (P<0.01). However, the neuronal damage was aggravated, the infarction area was expanded to (23.85±2.77)%(P<0.05) after treatment with AG490, and the phosphorylation level of STAT3 protein was also significantly reduced (P<0.05).CONCLUSIONIPoC may reduce cerebral injury by regulating the phosphorylation of STAT3 protein, and inhibition of JAK2-STAT3 signaling pathway may counteract the cerebral protective effect of IPoC and aggravate brain injury.

    Photochemistry reaction; Ischemic postconditioning; JAK2-STAT3 signaling pathway; Neuroprotection; Tree shrews

    1000- 4718(2017)12- 2121- 07

    2017- 08- 18

    2017- 10- 20

    國家科技支撐計劃項目(No.2014BAI01B01);國家自然科學(xué)基金資助項目(No.30971171);云南省教育廳科研基金資助項目(No.2014C042Y)

    △通訊作者Tel: 0871-65922858; E-mail: shuqing28@hotmail.com

    R743.3; R363.2

    A

    10.3969/j.issn.1000- 4718.2017.12.002

    (責(zé)任編輯: 盧 萍, 羅 森)

    猜你喜歡
    皮層腦缺血磷酸化
    急性皮層腦梗死的MRI表現(xiàn)及其對川芎嗪注射液用藥指征的指導(dǎo)作用研究
    ITSN1蛋白磷酸化的研究進(jìn)展
    基于復(fù)雜網(wǎng)絡(luò)的磁刺激內(nèi)關(guān)穴腦皮層功能連接分析
    基底節(jié)腦梗死和皮層腦梗死血管性認(rèn)知功能的對比
    原花青素對腦缺血再灌注損傷后腸道功能的保護(hù)作用
    血必凈對大鼠腦缺血再灌注損傷的保護(hù)作用及其機(jī)制
    MAPK抑制因子對HSC中Smad2/3磷酸化及Smad4核轉(zhuǎn)位的影響
    細(xì)胞外組蛋白與腦缺血再灌注損傷關(guān)系的初探
    組蛋白磷酸化修飾與精子發(fā)生
    遺傳(2014年3期)2014-02-28 20:59:01
    模擬初級視皮層注意機(jī)制的運(yùn)動對象檢測模型
    av.在线天堂| 国产亚洲精品久久久com| 99热这里只有是精品50| 久久久久九九精品影院| 久久久精品欧美日韩精品| 午夜日本视频在线| 亚洲经典国产精华液单| 男人狂女人下面高潮的视频| 精品一区二区三区视频在线| 超碰av人人做人人爽久久| 欧美日韩在线观看h| 亚洲av二区三区四区| 国内精品美女久久久久久| 九九久久精品国产亚洲av麻豆| 精品免费久久久久久久清纯| 精品无人区乱码1区二区| 联通29元200g的流量卡| 精品一区二区三区人妻视频| 在线免费观看的www视频| 性插视频无遮挡在线免费观看| 亚洲一区高清亚洲精品| 一个人看视频在线观看www免费| 汤姆久久久久久久影院中文字幕 | av国产免费在线观看| 久久久精品欧美日韩精品| 日韩 亚洲 欧美在线| 国产成人a区在线观看| 国产熟女欧美一区二区| 国产成人精品婷婷| 久久精品夜色国产| 高清视频免费观看一区二区 | 国产一区亚洲一区在线观看| 欧美色视频一区免费| 又黄又爽又刺激的免费视频.| 欧美区成人在线视频| 免费av毛片视频| 亚洲五月天丁香| 精品久久久久久成人av| 99视频精品全部免费 在线| 九九久久精品国产亚洲av麻豆| 国产精品久久久久久av不卡| 国产亚洲av片在线观看秒播厂 | 中文字幕av成人在线电影| 国产一区二区在线av高清观看| 国产精品熟女久久久久浪| 乱码一卡2卡4卡精品| av天堂中文字幕网| 国产一区亚洲一区在线观看| 少妇人妻精品综合一区二区| a级一级毛片免费在线观看| 日韩欧美 国产精品| 亚洲熟妇中文字幕五十中出| 国产麻豆成人av免费视频| 国产欧美日韩精品一区二区| 亚洲真实伦在线观看| 国产视频首页在线观看| 国产精品伦人一区二区| 欧美日韩综合久久久久久| 国产精品久久久久久精品电影| 美女内射精品一级片tv| 精品人妻一区二区三区麻豆| 国产精品一区二区性色av| 日本爱情动作片www.在线观看| 日本黄色片子视频| 久久久久免费精品人妻一区二区| 亚洲精品成人久久久久久| 亚洲欧美日韩卡通动漫| 尤物成人国产欧美一区二区三区| 身体一侧抽搐| 欧美性感艳星| 亚洲人成网站在线播| 免费无遮挡裸体视频| 久久这里只有精品中国| 1024手机看黄色片| 中文资源天堂在线| 亚洲av成人精品一二三区| 毛片一级片免费看久久久久| 乱码一卡2卡4卡精品| 亚洲国产高清在线一区二区三| av免费在线看不卡| 亚洲欧美中文字幕日韩二区| 国产精品99久久久久久久久| 婷婷色综合大香蕉| 性色avwww在线观看| 国产又黄又爽又无遮挡在线| ponron亚洲| 成人特级av手机在线观看| 51国产日韩欧美| 国产又色又爽无遮挡免| 最新中文字幕久久久久| 男人的好看免费观看在线视频| 真实男女啪啪啪动态图| 22中文网久久字幕| 一夜夜www| 国产91av在线免费观看| 永久网站在线| 久久综合国产亚洲精品| 99久久人妻综合| 国产老妇女一区| 免费电影在线观看免费观看| 狂野欧美白嫩少妇大欣赏| 亚洲精华国产精华液的使用体验| 男人舔女人下体高潮全视频| 亚洲婷婷狠狠爱综合网| 日本一本二区三区精品| 欧美又色又爽又黄视频| 久久韩国三级中文字幕| 夜夜爽夜夜爽视频| 国产精品国产三级专区第一集| 中国国产av一级| 久热久热在线精品观看| 欧美日韩一区二区视频在线观看视频在线 | 高清毛片免费看| 成人亚洲欧美一区二区av| 五月玫瑰六月丁香| 国产单亲对白刺激| 插逼视频在线观看| 淫秽高清视频在线观看| 美女内射精品一级片tv| 波多野结衣巨乳人妻| av播播在线观看一区| 69av精品久久久久久| 国产在线一区二区三区精 | 亚洲欧美日韩卡通动漫| 国产色婷婷99| 久久国产乱子免费精品| 免费观看的影片在线观看| 秋霞伦理黄片| 日韩中字成人| 欧美色视频一区免费| 97超碰精品成人国产| www日本黄色视频网| videossex国产| 亚洲在线观看片| 欧美又色又爽又黄视频| 丰满少妇做爰视频| 国产在线男女| 日韩制服骚丝袜av| 麻豆乱淫一区二区| 99视频精品全部免费 在线| 国产国拍精品亚洲av在线观看| 午夜激情福利司机影院| 亚洲成人av在线免费| 一边亲一边摸免费视频| 欧美另类亚洲清纯唯美| 久久久久久九九精品二区国产| 淫秽高清视频在线观看| 高清毛片免费看| 两个人的视频大全免费| 狠狠狠狠99中文字幕| 最近最新中文字幕大全电影3| 91久久精品电影网| av在线天堂中文字幕| 韩国高清视频一区二区三区| 亚洲国产高清在线一区二区三| 久久久精品94久久精品| 级片在线观看| 日本五十路高清| 日日摸夜夜添夜夜爱| 国产 一区 欧美 日韩| 亚洲精品亚洲一区二区| 天天躁日日操中文字幕| 在线播放无遮挡| 少妇丰满av| 亚洲欧美清纯卡通| 伦精品一区二区三区| 久久久久久久久大av| 水蜜桃什么品种好| 免费无遮挡裸体视频| 国产亚洲91精品色在线| 蜜桃久久精品国产亚洲av| 亚洲中文字幕一区二区三区有码在线看| 久久久久久久午夜电影| 高清在线视频一区二区三区 | 97超碰精品成人国产| 婷婷色麻豆天堂久久 | 纵有疾风起免费观看全集完整版 | 午夜免费激情av| a级一级毛片免费在线观看| 日本午夜av视频| 国产在视频线精品| 国产免费男女视频| 久久人人爽人人爽人人片va| 别揉我奶头 嗯啊视频| 91久久精品电影网| 97热精品久久久久久| 国产午夜精品一二区理论片| 色吧在线观看| 欧美成人免费av一区二区三区| 午夜福利在线观看免费完整高清在| 我要看日韩黄色一级片| 亚洲在线观看片| 少妇人妻一区二区三区视频| 国产美女午夜福利| 全区人妻精品视频| 69av精品久久久久久| 99热精品在线国产| 久久久成人免费电影| 国产成人aa在线观看| 看十八女毛片水多多多| 久久久精品94久久精品| 国产成人a区在线观看| 久久99蜜桃精品久久| 亚洲五月天丁香| 亚洲人成网站在线观看播放| 人妻少妇偷人精品九色| 看十八女毛片水多多多| 欧美一区二区亚洲| a级一级毛片免费在线观看| 午夜a级毛片| 亚洲国产色片| 一个人看视频在线观看www免费| 国产精品人妻久久久影院| 少妇熟女欧美另类| 亚洲国产高清在线一区二区三| 偷拍熟女少妇极品色| 国产高清三级在线| eeuss影院久久| av女优亚洲男人天堂| 九草在线视频观看| 亚洲精品色激情综合| 久久草成人影院| 亚洲第一区二区三区不卡| 国产黄色小视频在线观看| 午夜精品一区二区三区免费看| 成人三级黄色视频| 午夜激情福利司机影院| 国产免费一级a男人的天堂| 精品免费久久久久久久清纯| 亚洲精华国产精华液的使用体验| 少妇的逼好多水| 欧美另类亚洲清纯唯美| 日韩欧美精品v在线| 久久国内精品自在自线图片| 老司机影院毛片| 中文字幕熟女人妻在线| 又黄又爽又刺激的免费视频.| 国产 一区精品| 国产片特级美女逼逼视频| 大香蕉久久网| 青青草视频在线视频观看| 久久久精品大字幕| 久久婷婷人人爽人人干人人爱| 久久久久性生活片| 亚洲欧美精品自产自拍| 亚洲婷婷狠狠爱综合网| 久久鲁丝午夜福利片| 精品久久国产蜜桃| 国产日韩欧美在线精品| 国产不卡一卡二| 水蜜桃什么品种好| 国产免费福利视频在线观看| 久久午夜福利片| 国产精品人妻久久久久久| 免费av毛片视频| 久久久国产成人精品二区| 边亲边吃奶的免费视频| 亚洲va在线va天堂va国产| 国产成人freesex在线| 少妇的逼好多水| 亚洲国产精品国产精品| 亚洲欧洲国产日韩| 91精品国产九色| 国产精品综合久久久久久久免费| 免费大片18禁| 久久精品熟女亚洲av麻豆精品 | 日韩大片免费观看网站 | 国产极品精品免费视频能看的| 日本av手机在线免费观看| 国产探花在线观看一区二区| 日日撸夜夜添| 国产精品蜜桃在线观看| 欧美日韩在线观看h| 麻豆成人午夜福利视频| 国产免费福利视频在线观看| 久久久久九九精品影院| 小说图片视频综合网站| 午夜亚洲福利在线播放| 久久久久免费精品人妻一区二区| 国产精品爽爽va在线观看网站| 一级爰片在线观看| 丰满人妻一区二区三区视频av| 欧美成人免费av一区二区三区| 久久欧美精品欧美久久欧美| 亚洲欧美日韩高清专用| 99久久九九国产精品国产免费| 亚洲成人精品中文字幕电影| 边亲边吃奶的免费视频| 99热全是精品| 中文字幕人妻熟人妻熟丝袜美| 岛国毛片在线播放| 亚洲成人中文字幕在线播放| 麻豆成人午夜福利视频| 欧美激情国产日韩精品一区| 日韩中字成人| 一个人免费在线观看电影| 国产视频内射| 国产伦在线观看视频一区| 国产精品无大码| 又粗又硬又长又爽又黄的视频| 两个人视频免费观看高清| 非洲黑人性xxxx精品又粗又长| 国产免费又黄又爽又色| 欧美区成人在线视频| 免费播放大片免费观看视频在线观看 | 美女大奶头视频| 色综合站精品国产| 国产亚洲精品久久久com| 久久久a久久爽久久v久久| 白带黄色成豆腐渣| 国产成年人精品一区二区| 免费看av在线观看网站| 午夜日本视频在线| 国产黄色视频一区二区在线观看 | 超碰97精品在线观看| 婷婷色麻豆天堂久久 | eeuss影院久久| 日本黄色片子视频| 人人妻人人澡欧美一区二区| 国产精品一二三区在线看| 亚洲精品亚洲一区二区| 精品无人区乱码1区二区| 中文天堂在线官网| 亚洲成人久久爱视频| 永久网站在线| 国产片特级美女逼逼视频| 国产午夜福利久久久久久| 一级毛片我不卡| 国产精品1区2区在线观看.| 日日摸夜夜添夜夜爱| 日本熟妇午夜| 日日干狠狠操夜夜爽| 搞女人的毛片| av在线播放精品| 伦精品一区二区三区| 99九九线精品视频在线观看视频| 国产伦在线观看视频一区| 我要看日韩黄色一级片| 国产伦一二天堂av在线观看| 一夜夜www| 特级一级黄色大片| 欧美性感艳星| 日本熟妇午夜| 搡老妇女老女人老熟妇| 看免费成人av毛片| 日韩av在线大香蕉| 亚洲成色77777| 天天躁日日操中文字幕| 精品不卡国产一区二区三区| 日韩欧美精品免费久久| 国产精品久久久久久久电影| 午夜精品在线福利| 国产免费一级a男人的天堂| 亚洲av免费高清在线观看| 日本-黄色视频高清免费观看| 性色avwww在线观看| 精品国产一区二区三区久久久樱花 | 亚洲图色成人| 亚洲综合色惰| 日本一本二区三区精品| 99在线人妻在线中文字幕| 国产色婷婷99| 久久久精品94久久精品| 亚洲无线观看免费| 听说在线观看完整版免费高清| 91精品一卡2卡3卡4卡| 91久久精品国产一区二区三区| 国产午夜精品一二区理论片| 欧美一区二区亚洲| 黄色一级大片看看| 97热精品久久久久久| 欧美区成人在线视频| 国语对白做爰xxxⅹ性视频网站| 夫妻性生交免费视频一级片| 日韩高清综合在线| 日本-黄色视频高清免费观看| 毛片女人毛片| 国内少妇人妻偷人精品xxx网站| 久99久视频精品免费| 日韩欧美 国产精品| 麻豆成人午夜福利视频| 久久欧美精品欧美久久欧美| 久久久国产成人精品二区| 亚洲欧美精品专区久久| 99久国产av精品| 免费观看a级毛片全部| 亚洲欧美精品综合久久99| 日本色播在线视频| 亚洲av电影不卡..在线观看| 久久国产乱子免费精品| 久久久久久久国产电影| 精品久久久久久电影网 | 丰满乱子伦码专区| 熟妇人妻久久中文字幕3abv| 久久6这里有精品| 伦精品一区二区三区| 观看美女的网站| 亚洲最大成人中文| 18禁在线无遮挡免费观看视频| 在线a可以看的网站| 国产在视频线精品| 高清午夜精品一区二区三区| 国产精品嫩草影院av在线观看| 欧美三级亚洲精品| 国产黄色视频一区二区在线观看 | 免费黄网站久久成人精品| 男女下面进入的视频免费午夜| 久久精品国产亚洲av天美| 99久久精品热视频| 又黄又爽又刺激的免费视频.| av又黄又爽大尺度在线免费看 | 国产成人免费观看mmmm| 一级爰片在线观看| 国产视频首页在线观看| 国产免费男女视频| 午夜福利在线观看吧| 九九在线视频观看精品| 午夜精品在线福利| 日日啪夜夜撸| 欧美成人精品欧美一级黄| 久久精品国产自在天天线| 午夜福利成人在线免费观看| 国产成人91sexporn| 国产一区有黄有色的免费视频 | 最近中文字幕高清免费大全6| 久久鲁丝午夜福利片| 国产免费视频播放在线视频 | 国产精品一及| 啦啦啦观看免费观看视频高清| 日本猛色少妇xxxxx猛交久久| 日韩在线高清观看一区二区三区| 一个人免费在线观看电影| 三级经典国产精品| 亚洲va在线va天堂va国产| 国产一级毛片七仙女欲春2| 国产精品久久久久久精品电影小说 | 国产精品久久视频播放| 在线天堂最新版资源| 简卡轻食公司| av播播在线观看一区| 国产v大片淫在线免费观看| 久久久久精品久久久久真实原创| 精品久久久久久久久久久久久| 国产亚洲91精品色在线| 永久免费av网站大全| 一级毛片我不卡| 欧美精品一区二区大全| 韩国av在线不卡| 国产真实伦视频高清在线观看| 亚洲欧美精品综合久久99| 美女国产视频在线观看| 真实男女啪啪啪动态图| 97在线视频观看| 内射极品少妇av片p| 男女视频在线观看网站免费| 日韩亚洲欧美综合| 人体艺术视频欧美日本| 最近手机中文字幕大全| 久久久亚洲精品成人影院| 久99久视频精品免费| 黄片无遮挡物在线观看| 久久草成人影院| 日本wwww免费看| 黄色欧美视频在线观看| 91久久精品国产一区二区三区| 日韩,欧美,国产一区二区三区 | 成人毛片60女人毛片免费| 老司机影院成人| 中文字幕av成人在线电影| 91精品国产九色| 亚洲美女视频黄频| 国产成人精品一,二区| 91久久精品国产一区二区三区| 午夜免费男女啪啪视频观看| 日日摸夜夜添夜夜爱| 在线天堂最新版资源| 最近的中文字幕免费完整| 亚洲精品,欧美精品| 极品教师在线视频| 亚洲18禁久久av| 国产伦精品一区二区三区四那| 嫩草影院新地址| 国产黄片美女视频| 亚洲四区av| 波多野结衣高清无吗| 国产69精品久久久久777片| 精品久久久久久电影网 | 久久99热这里只频精品6学生 | 国产高清国产精品国产三级 | 老司机影院成人| 久久欧美精品欧美久久欧美| 国产91av在线免费观看| 少妇的逼好多水| 欧美人与善性xxx| 久久午夜福利片| 身体一侧抽搐| 91精品国产九色| av免费在线看不卡| 国产成人午夜福利电影在线观看| 卡戴珊不雅视频在线播放| 熟女电影av网| 热99re8久久精品国产| 国产亚洲5aaaaa淫片| 精品久久久久久成人av| 亚洲国产欧美在线一区| 日韩一区二区视频免费看| 国产高清有码在线观看视频| 在线观看66精品国产| 热99re8久久精品国产| 欧美bdsm另类| 成人欧美大片| 亚洲欧美日韩卡通动漫| 欧美精品一区二区大全| 亚洲欧美精品综合久久99| 亚洲国产精品专区欧美| 中文字幕av在线有码专区| 69av精品久久久久久| 边亲边吃奶的免费视频| 久热久热在线精品观看| av又黄又爽大尺度在线免费看 | 国产一区二区亚洲精品在线观看| 日韩国内少妇激情av| 最近手机中文字幕大全| 久久欧美精品欧美久久欧美| 亚洲国产精品久久男人天堂| 国国产精品蜜臀av免费| 黄色配什么色好看| 午夜爱爱视频在线播放| 欧美日韩精品成人综合77777| 亚洲av成人精品一区久久| 少妇裸体淫交视频免费看高清| 插逼视频在线观看| a级毛色黄片| 免费av毛片视频| 91精品一卡2卡3卡4卡| 一级毛片我不卡| 欧美又色又爽又黄视频| 亚洲天堂国产精品一区在线| 一级毛片电影观看 | 久久久久久大精品| 亚洲丝袜综合中文字幕| 日本爱情动作片www.在线观看| 在线天堂最新版资源| 午夜激情欧美在线| 久久这里只有精品中国| 日韩一区二区视频免费看| 天美传媒精品一区二区| 国产成人精品久久久久久| 亚洲一区高清亚洲精品| av又黄又爽大尺度在线免费看 | 国产成人免费观看mmmm| 欧美高清成人免费视频www| 91久久精品国产一区二区成人| 欧美一区二区精品小视频在线| 青春草国产在线视频| 久久99热这里只有精品18| 看片在线看免费视频| av卡一久久| 亚洲精品aⅴ在线观看| 晚上一个人看的免费电影| 高清av免费在线| 看免费成人av毛片| 亚洲国产精品成人久久小说| 久久热精品热| 国产乱人偷精品视频| 日韩强制内射视频| 一个人看的www免费观看视频| 国产精品一区www在线观看| 欧美bdsm另类| 青春草视频在线免费观看| 狠狠狠狠99中文字幕| 亚洲中文字幕日韩| 一级av片app| 久久久久久久久久黄片| 欧美激情国产日韩精品一区| 亚洲四区av| 少妇被粗大猛烈的视频| 可以在线观看毛片的网站| 亚洲aⅴ乱码一区二区在线播放| 边亲边吃奶的免费视频| 中文字幕免费在线视频6| 久久久久久国产a免费观看| 内射极品少妇av片p| 日韩亚洲欧美综合| 少妇丰满av| 亚洲人成网站在线观看播放| 一边摸一边抽搐一进一小说| 亚洲自拍偷在线| 中文字幕久久专区| 毛片一级片免费看久久久久| 欧美日本亚洲视频在线播放| 国产成人精品一,二区| 亚洲欧美日韩卡通动漫| 2022亚洲国产成人精品| 级片在线观看| 日韩视频在线欧美| 亚洲高清免费不卡视频| 国产一区二区三区av在线| 国产日韩欧美在线精品| 性插视频无遮挡在线免费观看| 国产精品福利在线免费观看| 午夜精品一区二区三区免费看| 性插视频无遮挡在线免费观看| 中文欧美无线码| 亚洲三级黄色毛片| 成人无遮挡网站| 91aial.com中文字幕在线观看| 青春草视频在线免费观看| 天天躁日日操中文字幕| 国产一区二区三区av在线| 波多野结衣巨乳人妻| 国产在视频线精品| 午夜a级毛片| 在线播放无遮挡| 国产精品熟女久久久久浪|