• <tr id="yyy80"></tr>
  • <sup id="yyy80"></sup>
  • <tfoot id="yyy80"><noscript id="yyy80"></noscript></tfoot>
  • 99热精品在线国产_美女午夜性视频免费_国产精品国产高清国产av_av欧美777_自拍偷自拍亚洲精品老妇_亚洲熟女精品中文字幕_www日本黄色视频网_国产精品野战在线观看 ?

    JAK2-STAT3信號通路在樹鼩腦缺血后適應(yīng)中的作用機(jī)制*

    2017-12-22 09:09:18李樹清
    中國病理生理雜志 2017年12期
    關(guān)鍵詞:皮層腦缺血磷酸化

    李 霞, 李樹清

    (昆明醫(yī)科大學(xué)病理生理學(xué)教研室, 云南 昆明 650500)

    JAK2-STAT3信號通路在樹鼩腦缺血后適應(yīng)中的作用機(jī)制*

    李 霞, 李樹清△

    (昆明醫(yī)科大學(xué)病理生理學(xué)教研室, 云南 昆明 650500)

    目的觀察JAK2-STAT3信號轉(zhuǎn)導(dǎo)通路在樹鼩缺血后適應(yīng)(ischemic postconditioning,IPoC)神經(jīng)保護(hù)中的調(diào)控作用,探討阻斷JAK2-STAT3通路后腦損傷加重的機(jī)制。方法通過光化學(xué)反應(yīng)建立樹鼩血栓性腦缺血模型;于缺血后4 h夾閉患側(cè)頸總動脈3次(每次5 min)實施IPoC。于IPoC前10 min側(cè)腦室注射AG490(JAK2抑制劑)后,采用TTC染色觀察樹鼩腦梗死面積的變化,通過HE染色和電鏡觀察腦皮層神經(jīng)元形態(tài)改變及超微結(jié)構(gòu)變化,應(yīng)用Western blot檢測IPoC及AG490處理后皮層t-STAT3和p-STAT3蛋白水平的變化。結(jié)果缺血24 h,皮層神經(jīng)元固縮,線粒體腫脹,嵴溶解;腦梗死面積占半腦面積的(24.78±3.30)%;此時皮層神經(jīng)元STAT3磷酸化水平明顯增高(P<0.01)。IPoC后皮層神經(jīng)元損傷減輕,線粒體腫脹改善,腦梗死面積占半腦面積的百分比減小為(17.67±1.83)%(P<0.01),STAT3磷酸化水平進(jìn)一步增高(P<0.01)。然而,給予AG490處理后,皮層神經(jīng)元損傷加重,腦梗死面積再次增大為(23.85±2.77)%(P<0.05),STAT3磷酸化水平則明顯降低(P<0.05)。結(jié)論IPoC可能通過調(diào)控STAT3的磷酸化而減輕樹鼩缺血性腦損傷,抑制JAK2-STAT3信號通路可抵消IPoC的保護(hù)效應(yīng)而加重腦損傷。

    光化學(xué)反應(yīng); 缺血后適應(yīng); JAK2-STAT3信號通路; 神經(jīng)保護(hù); 樹鼩

    缺血性腦卒中是人類致殘、致死的常見多發(fā)病,有關(guān)腦缺血治療的研究多集中在神經(jīng)保護(hù)藥物的評估與開發(fā)上,盡管這些研究對當(dāng)前和將來均具有重要意義[1],但腦缺血的死亡率一直居高不下,腦保護(hù)研究依然是國內(nèi)外缺血性腦血管病治療的重要領(lǐng)域。業(yè)已證明,通過反復(fù)3次夾閉頸總動脈實施非藥物干預(yù),即缺血后適應(yīng)(ischemic postconditioning,IPoC),可使局部腦血流(regional cerebral blood flow,rCBF)在不輸液或用藥的前提下逐步回升至正常rCBF的56%以上[2]。IPoC可以激活機(jī)體內(nèi)源性保護(hù)機(jī)制,減輕腦缺血再灌注損傷[2],與缺血預(yù)適應(yīng)(ischemic preconditioning,IPC)相比,IPoC具有明顯的可預(yù)見性,且易于操作,因而更具臨床應(yīng)用價值,是近年腦保護(hù)策略由神經(jīng)保護(hù)向細(xì)胞保護(hù)轉(zhuǎn)變的重要轉(zhuǎn)折。IPoC的神經(jīng)保護(hù)機(jī)制較為復(fù)雜,涉及多條細(xì)胞內(nèi)信號轉(zhuǎn)導(dǎo)通路的活化,目前國內(nèi)外對IPoC腦保護(hù)機(jī)制的研究主要涉及絲裂原活化蛋白激酶(mitogen-activated protein kinase,MAPK)[3]、磷脂酰肌醇3-激酶(phosphatidylinositol 3-kinase,PI3K)/Akt[4]以及蛋白激酶C(protein kinase C,PKC)通路[5]等,對其它信號通路的探索正在進(jìn)行中。研究發(fā)現(xiàn),Janus激酶2/信號轉(zhuǎn)導(dǎo)和轉(zhuǎn)錄激活蛋白3(Janus kinase 2/signal transducer and activator of transcription 3,JAK2/STAT3)是一條重要的信號通路,參與多種生理和病理過程,包括細(xì)胞生長、分化、增殖、凋亡和炎癥等[6-7]。在心肌IPoC的研究中發(fā)現(xiàn),JAK2/STAT3信號通路也參與了保護(hù)作用,其作為生存活化因子增強(qiáng)通路(survivor activating factor enhancement,SAFE)的一部分,在IPoC的心肌保護(hù)中具有抗凋亡效應(yīng)[8]。新近研究證實,STAT1活性抑制劑和DNA合成抑制劑在腦缺血的早期階段就表現(xiàn)出了神經(jīng)保護(hù)作用,其潛在的機(jī)制則與神經(jīng)細(xì)胞中STAT3的磷酸化有關(guān)[1]??梢姡沂維TAT3相關(guān)通路的激活因子,闡明其神經(jīng)保護(hù)作用的分子機(jī)制具有重要意義。而有關(guān)JAK2/STAT3信號通路是否也參與了樹鼩腦IPoC的神經(jīng)保護(hù)作用迄今未見報道,其信號通路在IPoC中的分子機(jī)制也尚未闡明。因此,本實驗通過觀察IPoC對JAK2/STAT3信號通路的影響,并應(yīng)用JAK2特異性抑制劑AG490抑制其信號通路,檢測腦缺血損傷時總STAT3(total STAT3,t-STAT3)與磷酸化STAT3(phosphorylated STAT3,p-STAT3)蛋白表達(dá)的消長變化,探討IPoC調(diào)控JAK2/STAT3信號通路的分子機(jī)制,為腦缺血的臨床治療提供新的實驗依據(jù)。

    材 料 和 方 法

    1 材料

    1.1實驗動物與分組 健康成年樹鼩60只,雌雄不限,體重(150±20) g,由中科院昆明動物所實驗中心提供 [動物合格證為SYXK(滇)K2012-0003],實驗前在清潔、安靜的環(huán)境下飼養(yǎng)。將動物隨機(jī)分為5組:假手術(shù)對照(control)組、腦缺血(ischemia)組、IPoC組、溶劑對照(IPoC+DMSO)組和AG490處理(DMSO+AG490+IPoC)組,每組5只。

    1.2主要儀器和試劑 本室研制的SQ-Ⅲ型腦血栓形成裝置(專利號:ZL201420068737.2) ,光源中心波長(λ) 560 nm,帶寬 (Δλ) 60 nm,光強(qiáng)度1.0 W/cm2,用時間繼電器控制照射時間;DSC-T30 數(shù)碼相機(jī)(SONY); JEM-100CX 型電子顯微鏡(Hitachi)。孟加拉紅(rose bengal)購自Fluka;2,3,5-三苯基氯化四氮唑(2,3,5-triphenyl tetrazolium chloride,TTC)系國藥集團(tuán)化學(xué)試劑有限公司分裝;AG490購自Abcam,用DMSO(<0.01%)溶解后配成1 mmol/L的儲存液,保存于-20 ℃;抗p-STAT3 (Thr705)和t-STAT3抗體購自CST;辣根過氧化物酶標(biāo)記的 II 抗購自ABMART;抗β-actin抗體購自Abcam。

    2 方法

    2.1樹鼩局灶性腦缺血及缺血后適應(yīng)模型的建立 采用本室研制的SQ-Ⅲ型腦血栓形成裝置復(fù)制腦缺血模型[2, 4]。以1%硫噴妥鈉溶液5 mL/kg腹腔注射麻醉動物,仰臥位固定,經(jīng)舌下靜脈注射(1.5 g/L)孟加拉玫瑰紅(rose bengal)生理鹽水溶液(1.33 mL/kg),循環(huán)10 min后,將動物改為俯臥位固定,消毒右側(cè)顳頂部皮膚,在右耳屏與右眼外眥連線中點(diǎn)做一長約1 cm切口,分離部分顳肌,暴露顱骨,此時透過顱骨可見顱內(nèi)血管,于切口處嵌入一外徑為1 cm × 2.5 cm 的消毒鋁片,其中心有一直徑為 0.5 cm 的窗孔,光束可通過該窗孔照射于顱骨表面,鋁片以外的組織用避光紙遮蓋。將動物置于腦血栓形成裝置下,照射血管15 min(時間由繼電器控制),照射期間維持顱骨表面溫度在(36±1)℃。術(shù)后取出鋁片,消毒并逐層縫合切口,保溫待動物蘇醒后放入飼養(yǎng)籠內(nèi)觀察。假手術(shù)組注射等量孟加拉玫瑰紅但不予以光照。在上述局部性腦缺血模型基礎(chǔ)上建立腦IPoC 模型[2, 4],于缺血4 h 前40 min 再次麻醉動物,仰臥位固定,消毒皮膚,做頸正中縱行切口,逐層分離皮下組織及頸闊肌,分離缺血側(cè)頸總動脈,注意保護(hù)迷走神經(jīng),以無創(chuàng)動脈夾在甲狀軟骨上緣平面夾閉頸總動脈5 min后,再灌注5 min,重復(fù)3個循環(huán),復(fù)制IPoC模型,術(shù)后消毒并逐層縫合切口,保暖回籠,見圖1。

    Figure 1. The schematic diagram of the experimental design. FC: first time clipping; SC: second time clipping; TC: third time clipping.

    圖1實驗設(shè)計示意圖

    2.2JAK2抑制劑AG490側(cè)腦室給藥 將AG490用50%的DMSO溶解后,配成1 mmol/L的儲存液,保存于-20 ℃。使用時用含50% DMSO的PBS緩沖液稀釋成50 nmol/L工作液,于缺血后適應(yīng)前10 min進(jìn)行側(cè)腦室注射。將動物俯臥位固定于腦立體定位儀上,備皮,消毒頂部皮膚,沿頂部正中線切開皮膚,暴露顱骨,在患側(cè)側(cè)腦室給予50 nmol/L的AG490溶液5 μL,注射完畢后消毒并縫合切口,保暖回籠。溶劑對照組給予等量的含50% DMSO的PBS溶液作為對照。

    2.3TTC染色及腦梗死面積測定 各組動物于腦缺血24 h后麻醉,迅速斷頭取腦,放入2% TTC 溶液中,37 ℃溫育30 min。正常腦組織經(jīng)TTC 染色呈現(xiàn)均勻紅色,而梗死區(qū)呈蒼白色,界限清楚。采用CAD 2007制圖軟件測定梗死面積占半腦面積的百分比。

    2.4HE染色及光鏡觀察腦皮層組織結(jié)構(gòu)變化 各組動物于既定時點(diǎn)再次麻醉,快速開胸并剪開心包,自心尖部插入一根聚乙烯管,使其進(jìn)入升主動脈,扎閉主動脈根部以防回流,剪開右心耳,用4℃預(yù)冷的生理鹽水(100 mL)進(jìn)行灌注,待肝臟變白后,在120 mmHg壓力下緩慢滴注4%甲醛(200 mL)內(nèi)固定2 h。固定完畢后開顱取腦,浸泡于新配制的4%甲醛中后固定24 h。常規(guī)脫水、透明、浸蠟,石蠟包埋制作蠟塊標(biāo)本,進(jìn)行HE染色,在光鏡下觀察腦皮層組織結(jié)構(gòu)及神經(jīng)元的變化。

    2.5透射電鏡觀察腦皮層神經(jīng)元超微結(jié)構(gòu)變化 各組動物于既定時點(diǎn)進(jìn)行深度麻醉后,迅速斷頭,打開顱骨,暴露缺血側(cè)皮層,在冰盤上快速切取梗死灶周圍皮層組織塊,置于3.5%戊二醛4℃預(yù)固定保存,用PBS緩沖液沖洗后,置于1%四氧鋨酸中固定24 h,再用乙醇-丙酮酸逐級脫水,Epon-618環(huán)氧丙烷滲透、包埋,經(jīng) LKBS 型超薄切片機(jī)半薄切片定位后,再進(jìn)行檸檬酸鉛-醋酸鈾雙染色,在JEM-1011 型透射電子顯微鏡下觀察皮層超微結(jié)構(gòu)。

    2.6Western blot檢測皮層t-STAT3和p-STAT3的蛋白水平 于既定時點(diǎn)麻醉動物,迅速斷頭,將大腦置于冰盤上,參照本室取材方法[17]快速切取相應(yīng)皮層組織,按每100 mg組織重量加入1 mL裂解液提取總蛋白,用BCA法測定蛋白濃度,蛋白變性后進(jìn)行SDS-PAGE, 100 V、80 min分離蛋白質(zhì),并以100 mA、55 min半干轉(zhuǎn)印到PVDF 膜上。用5% 脫脂牛奶室溫振搖封閉1 h,將抗鼠t-STAT3單克隆抗體(1∶1 000)、抗鼠p-STAT3單克隆抗體(1∶2 000)和抗鼠β-actin多克隆抗體(1∶5 000)室溫振搖2 h 后,4 ℃冰箱中孵育過夜,將辣根過氧化物酶標(biāo)記的Ⅱ抗(1∶5 000)室溫振搖,孵育2 h。ECL化學(xué)發(fā)光試劑盒進(jìn)行反應(yīng),Bio-Rad化學(xué)發(fā)光凝膠成像儀進(jìn)行顯色、成像,ImageJ 圖像分析軟件分析處理,計算目標(biāo)條帶的吸光度(A)。

    3 統(tǒng)計學(xué)處理

    實驗數(shù)據(jù)以均數(shù)±標(biāo)準(zhǔn)差(mean±SD)表示,用GraphPad Prism 5 統(tǒng)計軟件行方差齊性檢驗和單因素方差分析(one-way ANOVA),樣本均數(shù)間的兩兩比較用SNK-q檢驗。以P<0.05為差異有統(tǒng)計學(xué)意義。

    結(jié) 果

    1 IPoC及AG490 對樹鼩腦梗死面積的影響

    TTC染色后,樹鼩腦皮層光照區(qū)梗死灶明顯,呈蒼白色,邊界清楚。Ischemia組腦缺血24 h可見明顯的梗死灶,梗死面積占半腦面積的(24.78±3.3)%;實施IPoC處理后,皮層梗死面積明顯減小為(17.67±1.83)%(P<0.01),與DMSO組無明顯差異;而AG490處理后,梗死面積再次增大(23.85±2.77)%(P<0.05),見圖2。

    Figure 2. The effects of IPoC and AG490 on the infarct size 24 h after cerebral ischemia in tree shrews. Mean±SD.n=5.**P<0.01vsischemia group;△P<0.05vsIPoC group.

    圖2IPoC及AG490對樹鼩腦缺血24h梗死面積的影響

    2 IPoC及AG490 對樹鼩腦皮層神經(jīng)元組織病理學(xué)改變的影響

    光鏡下對照組樹鼩大腦皮層神經(jīng)元形態(tài)正常,見圖3A、B。腦缺血24 h后,皮層缺血中心區(qū)可見液化壞死灶,組織結(jié)構(gòu)疏松、染色變淺,神經(jīng)細(xì)胞壞死、脫失,神經(jīng)元數(shù)量減少;壞死灶周圍神經(jīng)元胞體縮小變形,核固縮,胞質(zhì)尼氏小體消失,見圖3C。IPoC處理后,皮層神經(jīng)元損傷減輕,正常神經(jīng)元增多,見圖3D。DMSO溶劑對照組皮層神經(jīng)元變化與缺血后適應(yīng)組相似,見圖3E。AG490處理組皮層神經(jīng)元損傷又有所加重,神經(jīng)元壞死增多,數(shù)量減少,見圖3F。

    Figure 3. The effects of IPoC and AG490 on the cortical neuronal changes 24 h after cerebral ischemia in tree shrews (HE staining, ×200 in A and ×400 in others). A and B: control group; C: ischemia group; D: IPoC group; E: IPoC+DMSO group; F: IPoC+AG490 group.

    圖3IPoC及AG490對樹鼩腦缺血24h后皮層神經(jīng)元改變的影響

    3 IPoC及AG490對樹鼩皮層神經(jīng)元超微結(jié)構(gòu)改變的影響

    電鏡下觀察顯示,對照組樹鼩腦皮層神經(jīng)元形態(tài)正常,邊界清楚,雙層核膜清晰可見,常染色質(zhì)豐富;線粒體形態(tài)正常,內(nèi)質(zhì)網(wǎng)排列規(guī)則,高爾基體結(jié)構(gòu)正常,見圖4A、B。腦缺血24 h后,皮層神經(jīng)元壞死,細(xì)胞水腫明顯,神經(jīng)細(xì)胞核膜邊界不清,核內(nèi)異染色質(zhì)增多;線粒體腫脹,嵴溶解、消失,或形成空泡;內(nèi)質(zhì)網(wǎng)腫脹、擴(kuò)張,見圖4C。缺血后適應(yīng)24 h,神經(jīng)元損傷減輕,細(xì)胞水腫及線粒體腫脹減輕,見圖4D。DMSO溶劑對照組皮層神經(jīng)元損傷與后適應(yīng)組變化基本相似,見圖4E。AG490處理組皮層神經(jīng)元損傷加重,核膜不清,線粒體固縮及空泡增多,見圖4F。

    Figure 4. The effects of IPoC and AG490 on the ultrastructure of cortical neurons 24 h after cerebral ischemia in tree shrews (×10 000 in A and ×25 000 in others). A and B: control group; C: ischemia group; D: IPoC group; E: IPoC+DMSO group; F: IPoC+AG490 group.

    圖4IPoC及AG490對樹鼩腦缺血24h皮層神經(jīng)元超微結(jié)構(gòu)改變的影響

    4 IPoC及AG490對樹鼩皮層t-STAT3和p-STAT3蛋白表達(dá)的影響

    Western blot 檢測結(jié)果顯示,各組皮層t-STAT3的差異無統(tǒng)計學(xué)顯著性。對照組皮層p-STAT3較少(0.04±0.01),ischemia組STAT3蛋白的磷酸化水平明顯上調(diào)(0.45±0.17,P<0.01),IPoC組STAT3的磷酸化水平較缺血組升高(0.83±0.15,P<0.01)。DMSO組STAT3的磷酸化水平與后適應(yīng)24 h組差異無統(tǒng)計學(xué)顯著性,而AG490處理24 h后STAT3的磷酸化水平明顯下降(0.36±0.05,P<0.05),見圖5。

    討 論

    資料顯示,樹鼩腦部結(jié)構(gòu)發(fā)育和顱腦血管分布與人腦較為接近,其大部分的皮層內(nèi)動脈呈直線分布,并具有密集的毛細(xì)血管網(wǎng),與人類的腦血管分布相似,因此用樹鼩作為人類腦血管疾病實驗?zāi)P鸵褌涫荜P(guān)注[9-11]。加之樹鼩的顱骨薄而透明(厚度僅為大鼠的1/3),透光性好,有利于特殊光束透過顱骨進(jìn)行光化學(xué)反應(yīng);后者選擇性損傷血管內(nèi)皮細(xì)胞,誘導(dǎo)血小板黏附、集聚而形成血栓;由于該模型不需開顱,無腦脊液外漏,樹鼩感染率低而便于長期觀察,因此與臨床缺血性腦血管疾病發(fā)生發(fā)展的病理過程十分吻合。研究證實,JAK2激酶活化后募集胞漿中以單體形式存在的STAT3分子,使與受體結(jié)合的STAT3分子磷酸化后,STAT3形成同源或異源二聚體而從受體上被釋放出來,進(jìn)入細(xì)胞核與特定的靶基因調(diào)控區(qū) DNA 結(jié)合,通過調(diào)節(jié)靶基因的表達(dá)而發(fā)揮多種生物學(xué)效應(yīng)。近年研究發(fā)現(xiàn),STAT3激活后可以減少神經(jīng)細(xì)胞凋亡、減輕氧化應(yīng)激、抑制中樞炎癥反應(yīng)和促進(jìn)血管生成[1]。隨著JAK2/STAT3信號通路在缺血性細(xì)胞損傷研究的不斷深入[12],揭示腦缺血時JAK2/STAT3表達(dá)的消長變化,尤其是IPoC調(diào)控其信號通路分子機(jī)制的探索也廣受重視。

    業(yè)已證明,梗死面積測量是反映缺血性損傷程度的重要指標(biāo)。TTC為一種光敏化合物,其與乳酸脫氫酶反應(yīng)可使正常腦組織染成紅色,而缺血性腦組織則為白色[13]。本研究的TTC染色結(jié)果顯示,腦缺血24 h后,皮層梗死灶明顯,此時神經(jīng)元的p-STAT3蛋白明顯增高,提示JAK2/STAT3信號通路已被激活,STAT3的磷酸化反應(yīng)既是缺血缺氧的原因,又是缺血耐受抗損傷的主要結(jié)果;還可能與缺血導(dǎo)致的神經(jīng)元過度興奮以及中樞炎癥反應(yīng)有關(guān)[14]。已證明,腦缺血可激活星形膠質(zhì)細(xì)胞和小膠質(zhì)細(xì)胞,并釋放細(xì)胞因子、趨化因子和生長因子而導(dǎo)致膠質(zhì)細(xì)胞與神經(jīng)元以及血管內(nèi)皮細(xì)胞之間復(fù)雜的相互作用[15],JAK2/STAT3信號通路在缺血性腦損傷中可能與調(diào)控促炎和抗炎因子之間的失衡有關(guān)[16]。研究證實,STAT蛋白主要通過JAK而直接磷酸化,經(jīng)典的JAK2/STAT3途徑如同激素信號一樣參與多種細(xì)胞因子的信號途徑[1]。大鼠腦缺血/再灌注研究發(fā)現(xiàn),JAKs聚合后又可通過自動或轉(zhuǎn)磷酸化反應(yīng)而自我激活,IPoC可以通過JAK2/STAT3信號通路減少神經(jīng)細(xì)胞凋亡,減輕炎癥反應(yīng)從而發(fā)揮腦保護(hù)作用[12]。腦缺血時,細(xì)胞ATP生成減少,STAT3的磷酸化反應(yīng)在一定的程度上可補(bǔ)償細(xì)胞能量的不足,而IPoC又可促進(jìn)JAK2/STAT3活化,使p-STAT3增多,既可緩解神經(jīng)元的能量需求,又能增強(qiáng)細(xì)胞的缺血耐受,二者共同作用可能是減輕皮質(zhì)神經(jīng)元損傷,縮小梗死面積的機(jī)制所在。此結(jié)果與我們先前關(guān)于IPoC使樹鼩缺血神經(jīng)元Akt Ser473和Thr308位點(diǎn)磷酸化的結(jié)果一致[4],且與Cheng等[13]報道的IPoC可提高大腦半暗區(qū)的細(xì)胞存活能力的結(jié)果相吻合。然而,經(jīng)STAT3抑制劑AG490處理后,神經(jīng)元STAT3磷酸化水平明顯降低,神經(jīng)元超微結(jié)構(gòu)可見核膜不清,線粒體固縮及空泡增多,缺血性損傷又有所加重;由于IPoC的保護(hù)作用因抑制劑的應(yīng)用而明顯削弱,腦梗死面積因此而擴(kuò)大。以上結(jié)果可概括為兩方面:一是IPoC可以通過激活JAK2/STAT3信號通路,減輕神經(jīng)元損傷而發(fā)揮腦保護(hù)作用;二是抑制JAK2/STAT3通路則可干擾STAT3的磷酸化而消除IPoC介導(dǎo)的腦保護(hù)效應(yīng)。IPoC不僅可改善樹鼩缺血區(qū)局部腦血流,促進(jìn)緊密連接蛋白o(hù)ccludin/ZO-1蛋白表達(dá),進(jìn)而減輕腦水腫[17];還可抑制腦組織Toll樣受體4 mRNA及髓過氧化物酶的表達(dá),減輕腦內(nèi)炎癥反應(yīng)[18];而肢體缺血后適應(yīng)也可促進(jìn)缺血腦區(qū)熱休克蛋白70表達(dá),抑制小鼠的腦缺血再灌注損傷[19]。而某些藥物如七氟醚后處理也可通過JAK2/STAT3信號通路減少線粒體ROS的產(chǎn)生而增加線粒體ATP含量,進(jìn)而減少細(xì)胞凋亡和梗塞面積[20]。事實上,IPoC介導(dǎo)的“機(jī)械信號轉(zhuǎn)導(dǎo)”及其對“JAK2/STAT3”等信號通路的調(diào)控可能在增強(qiáng)機(jī)體內(nèi)部抗損傷能力,抑制神經(jīng)元繼發(fā)性損傷中起著重要作用[17,21]。盡管JAK2/STAT3信號通路在IPoC的保護(hù)中發(fā)揮著重要作用,但目前對STAT3的上游和下游信號轉(zhuǎn)導(dǎo)及其與其它信號通路間的相互關(guān)系仍有待進(jìn)一步研究。

    Figure 5. Representative images and quantitative analysis of Western blot for determining the protein levels of t-STAT3 and p-STAT3 in ischemic cortex in tree shrews 24 h after IPoC and AG490 treatment. Mean±SD.n=5.**P<0.01vscontrol group;△△P<0.01vsischemia group;▲P<0.05vsIPoC group.

    圖5Westernblot檢測IPoC及AG490處理后皮層t-STAT3和p-STAT3蛋白水平的變化

    [1] Liang Z, Wu G, Fan C, et al. The emerging role of signal transducer and activator of transcription 3 in cerebral ischemic and hemorrhagic stroke[J]. Prog Neurobiol, 2016, 137:1-16.

    [2] 李樹清, 羅海蕓. 缺血后適應(yīng)對樹鼩海馬區(qū)腦血流及星形膠質(zhì)細(xì)胞活化的影響及可能機(jī)制[J]. 中國病理生理雜志, 2008, 24(6):1090-1095.

    [3] Gao X, Zhang H, Takahashi T, et al. The Akt signaling pathway contributes to postconditioning’s protection against stroke; the protection is associated with the MAPK and PKC pathway[J]. J Neurochem, 2008, 105(3):943-955.

    [4] 湯 諹, 李樹清, 李 凡, 等. 缺血后適應(yīng)對樹鼩海馬區(qū)神經(jīng)元信號轉(zhuǎn)導(dǎo)調(diào)控機(jī)制的研究[J]. 中國病理生理雜志, 2011, 27(3):560-565.

    [5] Shimohata T, Zhao H, Steinberg GK. PKC may contribute to the protective effect of hypothermia in a rat focal cerebral ischemia model[J]. Stroke, 2007, 38(2):375-380.

    [6] Shi X, Franko B, Frantz C, et al. JSI-124 (cucurbitacin I) inhibits Janus kinase-3/signal transducer and activator of transcription-3 signalling,downregulates nucleophosmin-anaplastic lymphoma kinase (ALK),and induces apoptosis in ALK-positive anaplastic large cell lymphoma cells[J]. Br J Haematol, 2006, 135(1):26-32.

    [7] 宗林飛, 向曉輝, 夏時海. STAT3信號轉(zhuǎn)導(dǎo)在胰腺炎發(fā)病機(jī)制中的作用[J]. 中國病理生理雜志, 2016, 32(3):558-563.

    [8] Tian Y, Zhang W, Xia D, et al. Postconditioning inhibits myocardial apoptosis during prolonged reperfusion via a JAK2-STAT3-Bcl-2 pathway[J]. J Biomed Sci, 2011, 18:53.

    [9] Reina-De La Torre F, Rodriguez-Baeza A, Sahuquillo-Barris J. Morphological characteristics and distribution pattern of the arterial vessels in human cerebral cortex: a scanning electron microscope study[J]. Anat Rec, 1998, 251(1):87-96.

    [10] Wolfrom-Gabel R, Maillot C. Vascular networks of the nucleus lentiformis[J]. Surg Radial Anat, 1994, 16(4):373-377.

    [11] Rieke GK, Bowers DE Jr, Penn P. Vascular supply pattern to rat caudatoputamen and globus pallidus: scanning electronmicroscopic study of vascular endocasts of stroke-prone vessels[J]. Stroke, 1981, 12(6):840-847.

    [12] 趙彥瑞, 劉 洋, 王 東, 等. PI3K/Akt和JAK2/STAT3信號轉(zhuǎn)導(dǎo)通路在SO2抗大鼠肢體缺血再灌注至急性肺損傷中的作用[J]. 中國病理生理雜志, 2015, 31(11): 2076-2082.

    [13] Cheng Z, Li L, Mo X, et al. Non-invasive remote limb ischemic postconditioning protects rats against focal cerebral ischemia by upregulating STAT3 and reducing apoptosis[J]. Int J Mol Med, 2014, 34(4):957-966.

    [14] Jang SS, Choi JH, Im DS, et al. The phosphorylation of STAT6 during ischemic reperfusion in rat cerebral cortex[J]. Neuroreport, 2014, 25(1):18-22.

    [15] Chen Z, Trapp BD. Microglia and neuroprotection[J]. J Neurochem, 2016, 136(Suppl 1):10-17.

    [16] Shrivastava K, Llovera G, Recasens M, et al. Temporal expression of cytokines and signal transducer and activator of transcription factor 3 activation after neonatal hypoxia/ischemia in mice[J]. Dev Neurosci, 2013, 35(2-3):212-225.

    [17] 李樹清, 李 凡, 何 亮, 等. 缺血后適應(yīng)促進(jìn)樹鼩血栓性腦缺血時緊密連接occludin /ZO-1蛋白表達(dá)及抑制腦水腫的機(jī)制[J]. 中國病理生理雜志, 2016, 32(3):477-484.

    [18] Feng R, Li S, Li F. Toll-like receptor 4 is involved in ischemic tolerance of postconditioning 6 in hippocampus of tree shrews to thrombotic cerebral ischemia[J]. Brain Res, 2011, 1384(15):118-127.

    [19] 趙 瑾, 李 楊, 黃 磊, 等. 肢體缺血后適應(yīng)對小鼠腦缺血再灌注損傷的影響及機(jī)制[J]. 中國病理生理雜志, 2010, 26(6):1096-1101.

    [20] Wu J, Yu J, Xie P, et al. Sevoflurane postconditioning protects the myocardium against ischemia reperfusion injury via activation of the JAK2-STAT3 pathway[J]. PeerJ, 2017, 5:e3196.

    [21] Lin J, Wang T, Li Y, et al. N-acetylcysteine restores sevoflurane postconditioning cardioprotection against myocardial ischemia-reperfusion injury in diabetic rats[J]. J Diabetes Res, 2016, 2016:9213034.

    Mechanism of JAK2-STAT3 signaling pathway in ischemic postconditio-ning neuroprotection after cerebral ischemia in tree shrews

    LI Xia, LI Shu-qing

    (DepartmentofPathophysiology,KunmingMedicalUniversity,Kunming650500,China.E-mail:shuqing28@hotmail.com)

    AIM: To investigate the regulatory effect of JAK2-STAT3 signaling pathway on the neuroprotection of ischemic postconditioning (IPoC) in tree shrews, and to explore the mechanisms of cerebral injury deterioration after inhibiting the JAK2-STAT3 pathway.METHODSThe model of thrombotic cerebral ischemia was induced by photochemical reaction in tree shrews and the IPoC was established at 4 h after ischemia followed by clipping ipsilateral common carotid artery on the ischemia side for 5 min (3 times). After IPoC and intracerebroventricular injection of AG490 (JAK2 inhibitor), the changes of cerebral infarction area were detected by TTC staining, and the histological and ultrastructural changes of cortical neurons were observed under light and electron microscopes, respectively. The protein levels of t-STAT3 and p-STAT3 in the cortical tissue were determined by Western blot.RESULTSThe neuronal pycnosis, mitochondrial swelling and vanish of the mitochondrial cristae were found in cortical cortex, and the infarction area was (24.78±3.30)% at 24 h after cerebral ischemia. Meanwhile, the phosphorylation level of STAT3 protein in the cortical tissue was significantly increased (P<0.01). The cortical neuronal damage and mitochondrial swelling were decreased after IPoC, the area of cerebral infarction was significantly reduced to (17.67±1.83)% (P<0.01), and the phosphorylation level of STAT3 protein was further increased (P<0.01). However, the neuronal damage was aggravated, the infarction area was expanded to (23.85±2.77)%(P<0.05) after treatment with AG490, and the phosphorylation level of STAT3 protein was also significantly reduced (P<0.05).CONCLUSIONIPoC may reduce cerebral injury by regulating the phosphorylation of STAT3 protein, and inhibition of JAK2-STAT3 signaling pathway may counteract the cerebral protective effect of IPoC and aggravate brain injury.

    Photochemistry reaction; Ischemic postconditioning; JAK2-STAT3 signaling pathway; Neuroprotection; Tree shrews

    1000- 4718(2017)12- 2121- 07

    2017- 08- 18

    2017- 10- 20

    國家科技支撐計劃項目(No.2014BAI01B01);國家自然科學(xué)基金資助項目(No.30971171);云南省教育廳科研基金資助項目(No.2014C042Y)

    △通訊作者Tel: 0871-65922858; E-mail: shuqing28@hotmail.com

    R743.3; R363.2

    A

    10.3969/j.issn.1000- 4718.2017.12.002

    (責(zé)任編輯: 盧 萍, 羅 森)

    猜你喜歡
    皮層腦缺血磷酸化
    急性皮層腦梗死的MRI表現(xiàn)及其對川芎嗪注射液用藥指征的指導(dǎo)作用研究
    ITSN1蛋白磷酸化的研究進(jìn)展
    基于復(fù)雜網(wǎng)絡(luò)的磁刺激內(nèi)關(guān)穴腦皮層功能連接分析
    基底節(jié)腦梗死和皮層腦梗死血管性認(rèn)知功能的對比
    原花青素對腦缺血再灌注損傷后腸道功能的保護(hù)作用
    血必凈對大鼠腦缺血再灌注損傷的保護(hù)作用及其機(jī)制
    MAPK抑制因子對HSC中Smad2/3磷酸化及Smad4核轉(zhuǎn)位的影響
    細(xì)胞外組蛋白與腦缺血再灌注損傷關(guān)系的初探
    組蛋白磷酸化修飾與精子發(fā)生
    遺傳(2014年3期)2014-02-28 20:59:01
    模擬初級視皮層注意機(jī)制的運(yùn)動對象檢測模型
    搡老熟女国产l中国老女人| 99国产精品99久久久久| 日韩欧美在线二视频 | 久久人人97超碰香蕉20202| 国产又爽黄色视频| 高清黄色对白视频在线免费看| 久久久国产成人免费| 国产人伦9x9x在线观看| 看片在线看免费视频| 精品一区二区三区av网在线观看| 丰满迷人的少妇在线观看| 久久久久国产一级毛片高清牌| 熟女少妇亚洲综合色aaa.| 国产精品欧美亚洲77777| 老司机深夜福利视频在线观看| 黑人巨大精品欧美一区二区蜜桃| 岛国毛片在线播放| 日本wwww免费看| av国产精品久久久久影院| 国产精品98久久久久久宅男小说| 午夜免费观看网址| 最新的欧美精品一区二区| www.精华液| 岛国在线观看网站| 午夜福利欧美成人| 在线看a的网站| 亚洲av欧美aⅴ国产| 久久精品国产亚洲av高清一级| 51午夜福利影视在线观看| 中文字幕人妻丝袜制服| 国产成人欧美在线观看 | 亚洲av熟女| 最新在线观看一区二区三区| 无限看片的www在线观看| 男女午夜视频在线观看| 日韩熟女老妇一区二区性免费视频| 麻豆国产av国片精品| 亚洲在线自拍视频| 欧美日韩亚洲高清精品| 久久精品人人爽人人爽视色| 在线av久久热| 9热在线视频观看99| 99re在线观看精品视频| 1024视频免费在线观看| 黑人欧美特级aaaaaa片| 亚洲精品国产区一区二| 午夜福利在线免费观看网站| 免费在线观看黄色视频的| 亚洲色图综合在线观看| 午夜免费成人在线视频| 国产精品自产拍在线观看55亚洲 | 久久国产精品男人的天堂亚洲| 亚洲av电影在线进入| 一进一出抽搐动态| 无限看片的www在线观看| 精品久久久久久,| 久久香蕉国产精品| 男女之事视频高清在线观看| 这个男人来自地球电影免费观看| 亚洲一码二码三码区别大吗| 18禁观看日本| 精品福利观看| 999久久久国产精品视频| 天天影视国产精品| 久久精品国产清高在天天线| a级片在线免费高清观看视频| 91av网站免费观看| 亚洲一卡2卡3卡4卡5卡精品中文| 18禁黄网站禁片午夜丰满| 在线观看免费午夜福利视频| 亚洲一区高清亚洲精品| 国产人伦9x9x在线观看| 香蕉久久夜色| 色在线成人网| 香蕉丝袜av| 久久久久久亚洲精品国产蜜桃av| 9热在线视频观看99| 国产高清激情床上av| 男女下面插进去视频免费观看| 自拍欧美九色日韩亚洲蝌蚪91| 欧美性长视频在线观看| 国产主播在线观看一区二区| 最新的欧美精品一区二区| xxx96com| 国产深夜福利视频在线观看| 亚洲av日韩在线播放| 人妻久久中文字幕网| 又黄又爽又免费观看的视频| 久久久精品免费免费高清| 在线观看午夜福利视频| 啦啦啦在线免费观看视频4| 久久久久久人人人人人| 免费观看人在逋| 国产精品二区激情视频| 大香蕉久久成人网| 91精品国产国语对白视频| 自线自在国产av| 天天添夜夜摸| 多毛熟女@视频| 亚洲欧美激情在线| 岛国毛片在线播放| 成人三级做爰电影| 亚洲三区欧美一区| 国产一区二区三区综合在线观看| 视频区图区小说| 91九色精品人成在线观看| 在线视频色国产色| 国产黄色免费在线视频| 男男h啪啪无遮挡| 精品电影一区二区在线| 天天添夜夜摸| 欧美精品av麻豆av| 老熟女久久久| 一级片免费观看大全| 法律面前人人平等表现在哪些方面| 久久国产精品影院| 欧美激情极品国产一区二区三区| 一进一出抽搐动态| 日韩免费高清中文字幕av| 国产在线观看jvid| 大香蕉久久成人网| 香蕉久久夜色| 久久亚洲精品不卡| 国产熟女午夜一区二区三区| 韩国av一区二区三区四区| 精品电影一区二区在线| 捣出白浆h1v1| 亚洲五月婷婷丁香| 精品久久蜜臀av无| 国产99久久九九免费精品| 色老头精品视频在线观看| 午夜精品国产一区二区电影| 亚洲国产精品sss在线观看 | 热99国产精品久久久久久7| 欧美成人午夜精品| 国产日韩欧美亚洲二区| 老汉色av国产亚洲站长工具| cao死你这个sao货| 夜夜夜夜夜久久久久| 成人影院久久| 欧美性长视频在线观看| 精品国产超薄肉色丝袜足j| 波多野结衣av一区二区av| 精品国产一区二区三区四区第35| 美女高潮喷水抽搐中文字幕| 少妇裸体淫交视频免费看高清 | 午夜影院日韩av| 人人妻人人澡人人爽人人夜夜| 欧美黄色淫秽网站| 欧美日韩精品网址| 女性生殖器流出的白浆| 亚洲avbb在线观看| 久久久久久人人人人人| 99国产精品一区二区蜜桃av | 美女高潮到喷水免费观看| 两人在一起打扑克的视频| 成年版毛片免费区| 视频区欧美日本亚洲| 老司机午夜福利在线观看视频| 岛国在线观看网站| 国产一区二区激情短视频| 国产成人欧美在线观看 | 男人操女人黄网站| 国产精品国产高清国产av | 韩国av一区二区三区四区| 成年动漫av网址| 国产精品偷伦视频观看了| 久久国产亚洲av麻豆专区| 国产男靠女视频免费网站| 交换朋友夫妻互换小说| 国产成人精品久久二区二区免费| 久久狼人影院| 99香蕉大伊视频| 中文字幕精品免费在线观看视频| 丰满的人妻完整版| 国产97色在线日韩免费| 精品国产亚洲在线| 久久精品国产亚洲av高清一级| 中文字幕最新亚洲高清| 新久久久久国产一级毛片| 狠狠婷婷综合久久久久久88av| 亚洲欧美激情综合另类| 国产精品一区二区免费欧美| 亚洲av片天天在线观看| 黄网站色视频无遮挡免费观看| 亚洲欧美色中文字幕在线| 亚洲精品粉嫩美女一区| 国产成人影院久久av| 国产成人av教育| 国产aⅴ精品一区二区三区波| 国产精品免费视频内射| 国产午夜精品久久久久久| 精品久久蜜臀av无| 精品电影一区二区在线| 视频在线观看一区二区三区| 国产亚洲精品一区二区www | 在线观看舔阴道视频| 99re在线观看精品视频| 国产极品粉嫩免费观看在线| 午夜激情av网站| 国产午夜精品久久久久久| 精品久久久久久电影网| 精品少妇久久久久久888优播| 亚洲精品一卡2卡三卡4卡5卡| 亚洲国产欧美日韩在线播放| 久久狼人影院| 这个男人来自地球电影免费观看| 成人影院久久| 岛国在线观看网站| 女同久久另类99精品国产91| 久久人人97超碰香蕉20202| 亚洲精品国产精品久久久不卡| 欧美色视频一区免费| 欧美乱色亚洲激情| 精品人妻熟女毛片av久久网站| e午夜精品久久久久久久| 亚洲五月色婷婷综合| 国产一区二区激情短视频| 大片电影免费在线观看免费| 一进一出抽搐gif免费好疼 | av网站在线播放免费| 动漫黄色视频在线观看| 亚洲av日韩在线播放| 中文字幕av电影在线播放| 日韩欧美三级三区| 可以免费在线观看a视频的电影网站| 亚洲熟女毛片儿| 天天添夜夜摸| 50天的宝宝边吃奶边哭怎么回事| 91成人精品电影| a级毛片在线看网站| 久久国产亚洲av麻豆专区| 精品人妻在线不人妻| tocl精华| 天天躁日日躁夜夜躁夜夜| 成年动漫av网址| 国产精华一区二区三区| 久久精品亚洲精品国产色婷小说| 99精品欧美一区二区三区四区| 最新在线观看一区二区三区| 中文亚洲av片在线观看爽 | 精品福利观看| 国产有黄有色有爽视频| 免费一级毛片在线播放高清视频 | 午夜精品国产一区二区电影| 一级片免费观看大全| 人妻丰满熟妇av一区二区三区 | 19禁男女啪啪无遮挡网站| 国产成人一区二区三区免费视频网站| 看免费av毛片| 国产淫语在线视频| 亚洲成a人片在线一区二区| 国产亚洲一区二区精品| 狠狠狠狠99中文字幕| 黄色怎么调成土黄色| 亚洲国产毛片av蜜桃av| 欧美乱妇无乱码| 精品久久久精品久久久| 啦啦啦 在线观看视频| 婷婷丁香在线五月| 一进一出抽搐gif免费好疼 | 9色porny在线观看| 久久国产精品男人的天堂亚洲| 成人黄色视频免费在线看| 欧美 亚洲 国产 日韩一| 91精品三级在线观看| 国产亚洲欧美精品永久| 精品人妻1区二区| 满18在线观看网站| 18禁裸乳无遮挡动漫免费视频| 国产成人精品久久二区二区免费| 12—13女人毛片做爰片一| 久久精品熟女亚洲av麻豆精品| av有码第一页| 青草久久国产| 婷婷丁香在线五月| 岛国在线观看网站| 在线视频色国产色| 极品教师在线免费播放| 国产97色在线日韩免费| 91在线观看av| 国产精品久久久av美女十八| 欧美日韩亚洲综合一区二区三区_| x7x7x7水蜜桃| 亚洲国产欧美网| 精品人妻1区二区| 午夜福利在线免费观看网站| 精品一区二区三区四区五区乱码| 精品国产乱子伦一区二区三区| 一区二区三区激情视频| 国产精品二区激情视频| 一区在线观看完整版| 91精品国产国语对白视频| av中文乱码字幕在线| 国产精华一区二区三区| 麻豆成人av在线观看| 少妇裸体淫交视频免费看高清 | 美国免费a级毛片| 老汉色av国产亚洲站长工具| 免费av中文字幕在线| 色在线成人网| 久久久精品国产亚洲av高清涩受| 久久人人97超碰香蕉20202| 日韩大码丰满熟妇| 下体分泌物呈黄色| 男女之事视频高清在线观看| netflix在线观看网站| 十八禁网站免费在线| 男女高潮啪啪啪动态图| 午夜福利乱码中文字幕| 18禁黄网站禁片午夜丰满| 天堂俺去俺来也www色官网| 久久99一区二区三区| 中文字幕av电影在线播放| 欧美激情 高清一区二区三区| 亚洲成国产人片在线观看| 91字幕亚洲| 午夜精品在线福利| 日韩中文字幕欧美一区二区| 18在线观看网站| 在线十欧美十亚洲十日本专区| 国产不卡av网站在线观看| 成人手机av| 精品第一国产精品| 国产在线一区二区三区精| 亚洲国产精品一区二区三区在线| 可以免费在线观看a视频的电影网站| 在线十欧美十亚洲十日本专区| 日韩欧美一区视频在线观看| 日韩大码丰满熟妇| 国产成人av激情在线播放| 天天躁夜夜躁狠狠躁躁| 久久久久久久久久久久大奶| 欧美日韩瑟瑟在线播放| 亚洲av日韩在线播放| 成人永久免费在线观看视频| 亚洲av日韩精品久久久久久密| 国产激情欧美一区二区| 美女高潮喷水抽搐中文字幕| 久久久久久久久免费视频了| 欧美黄色片欧美黄色片| 两个人看的免费小视频| 久久久精品免费免费高清| 久久久久视频综合| 亚洲国产精品sss在线观看 | 国产精品免费大片| av在线播放免费不卡| 亚洲精品乱久久久久久| 国产日韩欧美亚洲二区| 欧美黄色淫秽网站| 欧美+亚洲+日韩+国产| 国产熟女午夜一区二区三区| 999精品在线视频| 男女免费视频国产| 国产精品久久久久成人av| 国产精品.久久久| 夜夜躁狠狠躁天天躁| 亚洲成人国产一区在线观看| 久久ye,这里只有精品| 久久久久久人人人人人| 欧美日韩乱码在线| 国产精品欧美亚洲77777| 欧美日韩黄片免| 国产三级黄色录像| 正在播放国产对白刺激| ponron亚洲| 国产男女超爽视频在线观看| 老司机午夜福利在线观看视频| 777久久人妻少妇嫩草av网站| 99精品欧美一区二区三区四区| 久久久久久亚洲精品国产蜜桃av| 激情视频va一区二区三区| 这个男人来自地球电影免费观看| 国产精品免费视频内射| 99热只有精品国产| 国产男女内射视频| 午夜福利乱码中文字幕| 久久午夜综合久久蜜桃| 精品国产美女av久久久久小说| 午夜成年电影在线免费观看| 丰满的人妻完整版| 国产成人av激情在线播放| 美女高潮喷水抽搐中文字幕| 怎么达到女性高潮| 成人亚洲精品一区在线观看| 亚洲欧美一区二区三区久久| 欧美日韩乱码在线| 欧美日韩瑟瑟在线播放| 色精品久久人妻99蜜桃| 又紧又爽又黄一区二区| 国产精品成人在线| 少妇粗大呻吟视频| 美女 人体艺术 gogo| 日韩制服丝袜自拍偷拍| 亚洲免费av在线视频| 欧美精品高潮呻吟av久久| 日韩一卡2卡3卡4卡2021年| 日韩欧美国产一区二区入口| 女人精品久久久久毛片| 一a级毛片在线观看| 欧美成人免费av一区二区三区 | 中文字幕人妻熟女乱码| 亚洲av成人不卡在线观看播放网| 免费在线观看亚洲国产| 欧美av亚洲av综合av国产av| 午夜久久久在线观看| 精品人妻在线不人妻| 男女高潮啪啪啪动态图| 99国产精品免费福利视频| 人妻丰满熟妇av一区二区三区 | 国产高清videossex| 人妻 亚洲 视频| 亚洲一卡2卡3卡4卡5卡精品中文| 久久精品亚洲精品国产色婷小说| 婷婷丁香在线五月| 日韩免费高清中文字幕av| 欧美+亚洲+日韩+国产| 69av精品久久久久久| 免费观看精品视频网站| 久久久国产欧美日韩av| 夜夜夜夜夜久久久久| 亚洲国产毛片av蜜桃av| 午夜久久久在线观看| 国产精品久久久人人做人人爽| 亚洲精品国产色婷婷电影| 99re6热这里在线精品视频| 日日夜夜操网爽| 国产免费现黄频在线看| 亚洲自偷自拍图片 自拍| 亚洲av欧美aⅴ国产| 亚洲专区国产一区二区| 青草久久国产| 大型黄色视频在线免费观看| 国产欧美日韩精品亚洲av| 丰满迷人的少妇在线观看| 欧美日本中文国产一区发布| 在线观看免费高清a一片| 亚洲精品美女久久久久99蜜臀| 高清av免费在线| 999久久久国产精品视频| 午夜福利在线观看吧| 韩国av一区二区三区四区| 高清视频免费观看一区二区| 久久久国产成人精品二区 | 在线观看舔阴道视频| 国产精品免费一区二区三区在线 | 亚洲国产欧美网| 亚洲久久久国产精品| 首页视频小说图片口味搜索| 999精品在线视频| 国产成人精品无人区| 啦啦啦在线免费观看视频4| 久久精品国产亚洲av香蕉五月 | 久久久久久久国产电影| 丝袜在线中文字幕| 人成视频在线观看免费观看| 亚洲欧美一区二区三区久久| 岛国毛片在线播放| 国产亚洲精品一区二区www | 亚洲专区中文字幕在线| 大码成人一级视频| 宅男免费午夜| 看片在线看免费视频| 国产有黄有色有爽视频| 国产精品1区2区在线观看. | 色老头精品视频在线观看| 麻豆av在线久日| 久久国产精品影院| 香蕉国产在线看| 999久久久国产精品视频| 日韩一卡2卡3卡4卡2021年| 波多野结衣av一区二区av| 高清av免费在线| 亚洲第一青青草原| 日日夜夜操网爽| 亚洲人成77777在线视频| 高清欧美精品videossex| 精品免费久久久久久久清纯 | 免费观看a级毛片全部| 亚洲全国av大片| 亚洲免费av在线视频| 巨乳人妻的诱惑在线观看| 黑人猛操日本美女一级片| 国产精品免费一区二区三区在线 | 午夜福利,免费看| 脱女人内裤的视频| 黄色视频,在线免费观看| 又黄又粗又硬又大视频| 母亲3免费完整高清在线观看| 精品国产超薄肉色丝袜足j| 热99re8久久精品国产| 天天影视国产精品| 国产精品一区二区在线不卡| 岛国毛片在线播放| 99国产精品一区二区三区| 18在线观看网站| 天天躁夜夜躁狠狠躁躁| 狂野欧美激情性xxxx| 午夜福利一区二区在线看| 亚洲在线自拍视频| 午夜福利在线免费观看网站| 色老头精品视频在线观看| 国产黄色免费在线视频| 成人av一区二区三区在线看| av片东京热男人的天堂| 在线永久观看黄色视频| 欧美最黄视频在线播放免费 | 99riav亚洲国产免费| 国产精品综合久久久久久久免费 | 人人妻人人澡人人爽人人夜夜| 老司机亚洲免费影院| 嫁个100分男人电影在线观看| 丰满饥渴人妻一区二区三| 精品一区二区三区四区五区乱码| 国产主播在线观看一区二区| 国产99久久九九免费精品| 日本a在线网址| 日本黄色视频三级网站网址 | 久久亚洲精品不卡| 我的亚洲天堂| 18禁美女被吸乳视频| 欧美成人午夜精品| 极品人妻少妇av视频| 午夜福利乱码中文字幕| 啦啦啦在线免费观看视频4| 亚洲精品中文字幕一二三四区| 精品一区二区三区视频在线观看免费 | 亚洲专区国产一区二区| 国产精品 国内视频| 麻豆成人av在线观看| 又大又爽又粗| 亚洲欧美精品综合一区二区三区| 中亚洲国语对白在线视频| 变态另类成人亚洲欧美熟女 | 三上悠亚av全集在线观看| 午夜精品在线福利| 妹子高潮喷水视频| 久久午夜亚洲精品久久| 欧美日韩黄片免| 欧美日韩一级在线毛片| 欧美 日韩 精品 国产| 午夜精品久久久久久毛片777| 婷婷成人精品国产| 午夜精品久久久久久毛片777| 大型黄色视频在线免费观看| 黄色片一级片一级黄色片| 欧美日韩亚洲高清精品| 久久精品亚洲av国产电影网| 国产99白浆流出| 99香蕉大伊视频| 老熟妇仑乱视频hdxx| 超色免费av| 黄网站色视频无遮挡免费观看| a在线观看视频网站| 亚洲熟女毛片儿| 久久精品亚洲av国产电影网| 欧美日韩黄片免| 别揉我奶头~嗯~啊~动态视频| 国产精品久久久久久精品古装| 欧美成狂野欧美在线观看| 一区二区三区激情视频| 国产精品成人在线| 老司机靠b影院| 99香蕉大伊视频| 久久久久久久国产电影| 国产麻豆69| 国产亚洲精品第一综合不卡| 首页视频小说图片口味搜索| 巨乳人妻的诱惑在线观看| 亚洲avbb在线观看| 国产av一区二区精品久久| 成人精品一区二区免费| 高清毛片免费观看视频网站 | 精品人妻在线不人妻| www.熟女人妻精品国产| 欧美激情 高清一区二区三区| 怎么达到女性高潮| 欧美日韩中文字幕国产精品一区二区三区 | 在线十欧美十亚洲十日本专区| 亚洲aⅴ乱码一区二区在线播放 | 午夜视频精品福利| 色综合欧美亚洲国产小说| 黄色视频不卡| 国产乱人伦免费视频| 黄色片一级片一级黄色片| 在线永久观看黄色视频| 搡老熟女国产l中国老女人| 欧美日韩视频精品一区| 国产深夜福利视频在线观看| 成人影院久久| 狠狠婷婷综合久久久久久88av| 飞空精品影院首页| 亚洲精品乱久久久久久| 亚洲熟妇熟女久久| 国产精品98久久久久久宅男小说| 国产区一区二久久| 亚洲精品美女久久久久99蜜臀| 97人妻天天添夜夜摸| aaaaa片日本免费| 日韩欧美一区二区三区在线观看 | 久久久国产精品麻豆| 国产视频一区二区在线看| 首页视频小说图片口味搜索| 捣出白浆h1v1| 变态另类成人亚洲欧美熟女 | 日本一区二区免费在线视频| 久久精品国产亚洲av香蕉五月 | 在线观看午夜福利视频| 免费黄频网站在线观看国产| 脱女人内裤的视频| 色精品久久人妻99蜜桃| 国产成人系列免费观看| 丁香六月欧美| 日韩大码丰满熟妇| 精品一区二区三卡|