溫陽振衰顆粒對慢性心衰模型大鼠心肌中MEF2表達的影響Δ

蔡虎志，王笑瑩，陳青揚，陳新宇（1.湖南中醫(yī)藥大學(xué)第一附屬醫(yī)院科研科，長沙410007；.貴陽中醫(yī)學(xué)院基礎(chǔ)醫(yī)學(xué)院，貴陽550000；.湖南中醫(yī)藥大學(xué)第一附屬醫(yī)院中心重癥加強護理病房，長沙410007；4.湖南中醫(yī)藥大學(xué)第一附屬醫(yī)院，長沙410007）

溫陽振衰顆粒對慢性心衰模型大鼠心肌中MEF2表達的影響Δ

蔡虎志1＊，王笑瑩2，陳青揚3，陳新宇4#（1.湖南中醫(yī)藥大學(xué)第一附屬醫(yī)院科研科，長沙410007；2.貴陽中醫(yī)學(xué)院基礎(chǔ)醫(yī)學(xué)院，貴陽550000；3.湖南中醫(yī)藥大學(xué)第一附屬醫(yī)院中心重癥加強護理病房，長沙410007；4.湖南中醫(yī)藥大學(xué)第一附屬醫(yī)院，長沙410007）

目的：研究溫陽振衰顆粒對慢性心衰（CHF）模型大鼠心肌中肌細(xì)胞增強子（MEF2）表達的影響。方法：將60只大鼠隨機抽取10只作為正常對照組（生理鹽水），其余50只大鼠以阿霉素建立CHF模型后隨機分為模型對照組（生理鹽水）、陽性對照組[依那普利1.8 mg/（kg·d）]和溫陽振衰顆粒低、中、高劑量組[0.72、1.44、2.88 g/（kg·d）]，每天ig給藥2次，連續(xù)給藥4周。給藥結(jié)束后，檢測各組大鼠心功能指標(biāo)[左心室射血分?jǐn)?shù)（LVEF）、左心室短軸縮短率（LVFS）、左心室收縮末期內(nèi)徑（LVSD）和左心室舒張末期內(nèi)徑（LVDD）]，檢測各組大鼠心肌中MEF2和磷酸化MEF2（p-MEF2）mRNA及其蛋白的表達。結(jié)果：與正常對照組比較，模型對照組和各給藥組大鼠LVEF、LVFS明顯降低（P＜0.05），LVSD、LVDD明顯升高（P＜0.05）；心肌中p-MEF2蛋白表達明顯下調(diào)（P＜0.05），MEF2 mRNA及蛋白表達差異無統(tǒng)計學(xué)意義（P＞0.05）。與模型對照組比較，各給藥組大鼠心功能指標(biāo)均明顯改善（P＜0.05）；心肌中p-MEF2蛋白表達均明顯上調(diào)（P＜0.05），MEF2 mRNA及蛋白表達差異均無統(tǒng)計學(xué)意義（P＞0.05）。結(jié)論：溫陽振衰顆粒能拮抗阿霉素誘導(dǎo)的MEF2蛋白磷酸化的下調(diào)作用，這可能是其治療CHF的機制之一。

溫陽振衰顆粒；慢性心衰；心肌細(xì)胞增強子；磷酸化心肌細(xì)胞增強子；大鼠

慢性心衰（Chronic heart failure，CHF）作為復(fù)雜的臨床綜合征，一直是心血管內(nèi)科臨床防治的重點病癥

[1]。據(jù)流行病學(xué)調(diào)查顯示，CHF總患病率為0.4%～2%，其中老年人患病率更高，達到10%。該病一旦確診，患者5年生存率與惡性腫瘤相當(dāng)，而該病發(fā)病率近年呈持續(xù)升高趨勢[2-3]。溫陽振衰顆粒是湖南中醫(yī)藥大學(xué)第一附屬醫(yī)院的院內(nèi)制劑，其基本組方由制附子、干姜、甘草、紅參、茯苓、麥冬、五味子等組成，將紅參粉碎備用，其余6味藥材用10倍量水提取2次，合并2次提取液，濾過，濃縮為浸膏，將浸膏干燥粉碎后與紅參粉混勻制粒即得，為臨床治療CHF的有效中藥復(fù)方，在醫(yī)院門診及住院部已經(jīng)安全、有效地使用了8年有余。胞外信號調(diào)節(jié)激酶5（Extracellular signal-regulated kinase 5，ERK5）是絲裂原活化蛋白激酶（Mitogen-activated protein kinase，MAPK）家族中重要的一個亞族，本課題組前期研究發(fā)現(xiàn)，ERK5磷酸化蛋白具有顯著的心肌保護特點，且溫陽振衰顆?？梢悦黠@上調(diào)ERK5磷酸化蛋白的表達[4]。本研究主要探討ERK5下游關(guān)鍵調(diào)控基因肌細(xì)胞增強因子2（Myocyte enhancer factor 2，MEF2）在CHF的病理過程中具有怎樣的表達特點與規(guī)律，以及溫陽振衰顆粒是否通過ERK5下游通路調(diào)控蛋白MEF2的表達從而發(fā)揮對CHF的治療作用，為闡明溫陽振衰顆粒治療CHF的作用機制提供參考。

1 材料

1.1 儀器

CUSON Sequoia 512型彩色多普勒超聲診斷儀（美國西門子公司）；LE-80K型超速離心機（美國Beckman公司）；DYCZ-24F型電泳儀（北京六一儀器廠）；Nova-Blot型轉(zhuǎn)印儀（美國GE Healthcare公司）；7300型Realtime聚合酶鏈?zhǔn)椒磻?yīng)（RT-PCR）檢測儀（美國Applied Biosystems公司）；TG-16M型低溫冷凍離心機（上海盧湘儀離心機儀器有限公司）。

1.2 藥品與試劑

溫陽振衰顆粒（湖南中醫(yī)藥大學(xué)第一附屬醫(yī)院提供，批號：201516，規(guī)格：每1 g顆粒制劑相當(dāng)于5.93 g中藥飲片）；依那普利片（山東辰欣藥業(yè)股份有限公司，批號：201525，規(guī)格：10 mg/片）；鹽酸阿霉素注射劑（深圳萬樂藥業(yè)有限公司，批號：201508，規(guī)格：10 mg/瓶）；MEF2、磷酸化MEF2（p-MEF2）抗體（美國Santa Cruz公司）；SYBR Green PCR試劑盒（美國Thermo公司，批號：K0223）。

1.3 動物

健康SPF級SD大鼠60只，♀♂各半，體質(zhì)量200～220 g，由湖南斯萊克景達實驗動物有限公司提供，動物生產(chǎn)許可證號：SCXK（湘）2014-002。將大鼠置于光/暗周期為12 h/12 h（光照時間為6：00～18：00）、背景噪音為（40±10）db、溫度為（20±3）℃條件下適應(yīng)性飼養(yǎng)1周后用于實驗，飼養(yǎng)期間自由飲食。

2 方法

2.1 CHF模型的制備

用生理鹽水將阿霉素制備成質(zhì)量濃度為2.0 mg/mL的溶液，根據(jù)大鼠體質(zhì)量對給藥劑量進行調(diào)整，以1.5

mL/kg的標(biāo)準(zhǔn)對大鼠iv給藥，每周注射1次，連續(xù)注射6周，最終注射的阿霉素總量為9 mL/kg[5]。

2.2 分組

將60只大鼠隨機抽取10只作為正常對照組，其余50只大鼠按“2.1”項下方法進行CHF造模。在首次注射阿霉素后第20天（即第3次注射阿霉素后的第6天），對所有實驗大鼠行超聲心動圖檢查，并對阿霉素造模效果進行評價。然后將50只造模大鼠根據(jù)心功能分級先分層后隨機分為5組，每組10只，分別為模型對照組、陽性對照組和溫陽振衰顆粒低、中、高劑量組。

2.3 給藥

自實驗第21天開始，造模大鼠在iv阿霉素溶液的同時ig相應(yīng)藥物：溫陽振衰顆粒低、中、高劑量組大鼠分別按0.72、1.44、2.88 g/（kg·d）的劑量（分別根據(jù)臨床用量的1、2、4倍劑量換算而得）ig溫陽振衰顆粒生理鹽水溶液，陽性對照組大鼠按1.8 mg/（kg·d）的劑量ig依那普利生理鹽水溶液[4]，每天給藥2次，每次3 mL，連續(xù)給藥4周；正常對照組大鼠ig等體積生理鹽水。

2.4 樣本采集與指標(biāo)檢測

2.4.1 心功能指標(biāo)實驗大鼠稱質(zhì)量后取平臥位固定，采用彩色多普勒超聲診斷儀隨機攜帶軟件自動計算其左心室射血分?jǐn)?shù)（LVEF）、左心室短軸縮短率（LVFS）、左心室收縮末期內(nèi)徑（LVSD）、左心室舒張末期內(nèi)徑（LVDD）。

2.4.2 Western blot法檢測大鼠心肌中MEF2、p-MEF2蛋白表達將各組實驗大鼠處死后取心肌組織，加組織裂解液，提取總蛋白，Bradford法測定蛋白質(zhì)濃度；然后分裝，－80℃保存，備用。檢測時分別加入抗MEF2（1∶500）、p-MEF2（1∶250）抗體，4℃過夜。TBS-Tween 20漂洗10 min×3次，將膜取出，置于另一雜交袋中，加入酶標(biāo)二抗（1∶2 000），室溫雜交2 h。TBST漂洗10 min×3次，化學(xué)發(fā)光液曝光，顯像，掃描（300 dpi），以MEF2、p-MEF2蛋白條帶灰度值與內(nèi)參GAPDH蛋白條帶灰度值的比值表示MEF2、p-MEF2蛋白的相對表達水平。

2.4.3 RT-PCR法檢測大鼠心肌中MEF2 mRNA表達取實驗大鼠心肌組織，液氮保存。采用Trizol一步法提取心肌組織總RNA，于－80℃保存。根據(jù)美國國立生物技術(shù)信息中心（NCBI）基因庫中基因序列進行引物設(shè)計：MEF2上游為5′-ATTTCAGCGGCAGCCTTGG-3′，下游為5′-AGTCACCTGTCGGTTCCTCTC-3′，擴增長度為188 bp；GAPDH上游為5′-GTCGGTGTGAACGGATTTG-3′，下游為5′-TCCCATTCTCAGCCTTGAC-3′，擴增長度為181 bp。擴增條件：94℃、5 s，60℃、60 s，72℃、2 s，42個循環(huán)；基因擴增前94℃預(yù)變性10 min，擴增后72℃延伸10 min。反應(yīng)結(jié)束后建立RT-PCR溶解曲線，讀取目標(biāo)擴增產(chǎn)物達到設(shè)定閾值所需的循環(huán)數(shù)（ct）值，以GAPDH為內(nèi)參，校正每個樣品的ct值得出Δct（Δct＝ctp-值，表達差異以2－ΔΔct表示，式中ΔΔct＝Δct給藥組－Δct正常對照組。

2.5 統(tǒng)計學(xué)方法

采用SPSS 17.0統(tǒng)計分析軟件包進行結(jié)果數(shù)據(jù)處理。所有資料均進行正態(tài)性檢驗，計量資料以x±s表示。多組均數(shù)比較采用單因素方差分析，方差齊時采用LSD法進行組間兩兩比較，方差不齊時采用Tamhane’T2法。P＜0.05表示差異具有統(tǒng)計學(xué)意義。

3 結(jié)果

3.1 各組大鼠心功能指標(biāo)測定結(jié)果

與正常對照組比較，其余各組大鼠LVEF、LVFS均顯著降低（P＜0.05），LVSD、LVDD均顯著升高（P＜0.05）。與模型對照組比較，各給藥組大鼠LVEF、LVFS均顯著升高（P＜0.05），LVSD、LVDD均顯著降低（P＜0.05）；且以溫陽振衰顆粒中、高劑量組效果最為顯著，與其他給藥組比較差異均有統(tǒng)計學(xué)意義（P＜0.05），結(jié)果見表1。

3.2 各組大鼠心肌中MEF2、p-MEF2蛋白表達

與正常對照組比較，其余各組大鼠心肌中p-MEF2蛋白表達均顯著下調(diào)（P＜0.05），而MEF2蛋白表達差異無統(tǒng)計學(xué)意義（P＞0.05）。與模型對照組比較，各給藥組大鼠心肌中p-MEF2蛋白表達均明顯上調(diào)（P＜0.05）；其中以溫陽振衰顆粒中、高劑量組上調(diào)最為明顯，與其余各給藥組比較差異均有統(tǒng)計學(xué)意義（P＜0.05）。各組間MEF2蛋白表達差異均無統(tǒng)計學(xué)意義（P＞0.05）。蛋白表達電泳圖見圖1、測定結(jié)果見表2。

表1 各組大鼠心功能指標(biāo)的測定結(jié)果（±s，n＝10，%%）Tab 1Determination results of heart function relatedindexesofratsineachgroup（±s，n＝10，%%）

表1 各組大鼠心功能指標(biāo)的測定結(jié)果（±s，n＝10，%%）Tab 1Determination results of heart function relatedindexesofratsineachgroup（±s，n＝10，%%）

注：與正常對照組比較，＊P＜0.05；與模型對照組比較，#P＜0.05；與溫陽振衰顆粒中、高劑量組比較，ΔP＜0.05Note：vs.normal control group，＊P＜0.05；vs.model controlgroup，#P＜0.05；vs.Wenyangzhenshuaimiddle-dose，

LVDD 5.34±0.31 7.57±0.43＊6.68±0.37＊#Δ 6.59±0.41＊#Δ 6.02±0.33＊#6.17±0.35＊#組別正常對照組模型對照組陽性對照組溫陽振衰顆粒低劑量組溫陽振衰顆粒中劑量組溫陽振衰顆粒高劑量組LVEF 74.81±7.28 40.96±4.86＊47.52±5.87＊#Δ 49.52±5.68＊#Δ 58.83±6.01＊#59.95±5.32＊#LVFS 45.03±3.67 27.24±2.43＊33.08±2.92＊#Δ 32.08±2.58＊#Δ 37.65±3.21＊#36.12±3.01＊#LVSD 2.81±0.15 4.81±0.20＊4.20±0.21＊#Δ 4.18±0.16＊#Δ 3.85±0.18＊#3.96±0.19＊#

圖1 各組大鼠心肌中MEF2、p-MEF2蛋白表達的電泳圖Fig1Electrophoresischartofmyocardial MEF2，p-MEF2expressionsofratsin each group high-dose group，ΔP＜0.05

表2 各組大鼠心肌中MEF2、p-MEF2蛋白表達測定結(jié)果（±s，n＝10）Tab2Determinationresultsofmyocardial MEF2，p-MEF2 expression levels of rats in each group（±s，n＝10）

表2 各組大鼠心肌中MEF2、p-MEF2蛋白表達測定結(jié)果（±s，n＝10）Tab2Determinationresultsofmyocardial MEF2，p-MEF2 expression levels of rats in each group（±s，n＝10）

注：與正常對照組比較，＊P＜0.05；與模型對照組比較，#P＜0.05；與溫陽振衰顆粒中、高劑量組比較，ΔP＜0.05Note：vs.normal control group，＊P＜0.05；vs.model controlgroup，#P＜0.05；vs.Wenyangzhenshuaimiddle-dose，high-dose group，ΔP＜0.05

p-MEF2/GAPDH 0.45±0.05 0.06±0.02＊0.14±0.01＊#Δ 0.13±0.01＊#Δ 0.26±0.03＊#0.25±0.03＊#組別正常對照組模型對照組陽性對照組溫陽振衰顆粒低劑量組溫陽振衰顆粒中劑量組溫陽振衰顆粒高劑量組MEF2/GAPDH 0.45±0.03 0.44±0.03 0.43±0.03 0.45±0.03 0.44±0.03 0.45±0.04

3.3 各組大鼠心肌中MEF2 mRNA表達測定結(jié)果

與正常對照組比較，其余各組大鼠間心肌中MEF2 mRNA的表達差異均無統(tǒng)計學(xué)意義（P＞0.05）。正常對照組、模型對照組、陽性對照組和溫陽振衰顆粒低、中、高劑量組大鼠心肌MEF2 mRNA表達的相對水平依次為0.08±0.02、0.11±0.04、0.09±0.03、0.09±0.03、0.08±0.03、0.10±0.04。

4 討論

MEF2屬于MADS蛋白家族，在心肌中高表達[6]。已發(fā)現(xiàn)的脊椎動物中MEF2亞型有MEF2A、MEF2B、MEF2C和MEF2D 4種[7]，心肌中主要亞型為MEF2A和MEF2D[8]。MEF2表達與活性組蛋白乙?；D(zhuǎn)移酶（HATs）呈正相關(guān)。組蛋白去乙?；福℉DAC4）或HDAC5上有一個MEF2?？繀^(qū)域，鈣調(diào)蛋白或伴侶蛋白14-3-3結(jié)合至該區(qū)域可解除HDAC對MEF2的抑制作用，使MEF2釋放并通過與其他因子的相互作用啟動肥厚基因轉(zhuǎn)錄。MEF2基因失活可致心臟發(fā)育停止、心房鈉尿肽（ANP）基因表達下調(diào)，缺乏MEF2的小鼠表現(xiàn)出非正常的心臟功能，但可抵抗壓力誘導(dǎo)的心臟重塑（如心肌肥厚）[9]。心肌細(xì)胞形態(tài)學(xué)變化導(dǎo)致心肌肥厚的狀態(tài)下，MEF2A及MEF2C并不隨鈣調(diào)蛋白磷酸酶的活化而進一步變化，表明MEF2因子誘發(fā)心肌細(xì)胞肥大的過程相對獨立，不受鈣調(diào)蛋白磷酸酶的調(diào)節(jié)。MEF2更可對細(xì)胞骨架和線粒體網(wǎng)狀結(jié)構(gòu)產(chǎn)生影響，并最終造成心力衰竭過程中常見的心肌收縮功能失調(diào)[10]。MEF2是ERK5蛋白的重要下游靶蛋白，ERK5蛋白磷酸化后可結(jié)合于MEF2的MADS結(jié)構(gòu)域，能夠磷酸化MEF2A、MEF2C和MEF2D的順式激活結(jié)構(gòu)域而提高轉(zhuǎn)錄活性。此外，ERK5含有一個轉(zhuǎn)錄激活結(jié)構(gòu)域，這表明ERK5作為輔激活因子募集基本轉(zhuǎn)錄器而激活MEF2依賴的轉(zhuǎn)錄[11]。這兩個機制都適用于ERK5對MEF2活性的調(diào)節(jié)。

對于溫陽振衰顆粒各組分的主要成分，目前已有較為成熟的相關(guān)研究。其中，附子為毛茛科植物烏頭的子根，2005年版《中國藥典》（一部）記載：其“通行十二經(jīng)……回陽救逆”[12]。目前研究中，不僅從附子中提取出了有穩(wěn)定強心作用且副作用小的正性肌力化合物，還進一步發(fā)現(xiàn)其為能夠修復(fù)心肌受損細(xì)胞、恢復(fù)心肌搏動能力的脂溶性化合物。干姜為姜科植物姜的根莖，《本草經(jīng)疏》認(rèn)為：干姜“辛可散邪理結(jié)，溫可除寒通氣，故主胸滿咳逆上氣”；現(xiàn)代藥理研究發(fā)現(xiàn)，干姜能夠改善心肌缺氧和局部血液循環(huán)[13]，減緩血栓形成。紅參為五加科植物人參的主根加工品，有大補元氣、回陽救逆之用；現(xiàn)代研究認(rèn)為，人參皂苷類能明顯增加缺氧缺糖心肌細(xì)胞的搏動幅度和存活率[14]。甘草為豆科甘草屬草本植物的根及根莖，近年來，諸多研究發(fā)現(xiàn)，甘草主要有效成分中的甘草酸、甘草次酸以及疏水性黃酮類化合物是抗動脈粥樣硬化的主要活性成分[15]，且甘草次酸與甘草總黃酮也有明顯的抗心律失常、減少室顫的作用。

本課題組前期研究發(fā)現(xiàn)，與陽性對照藥依那普利對比，溫陽振衰顆粒能有效改善CHF實驗動物癥狀，同時還可以顯著上調(diào)心肌中ERK5蛋白磷酸化的表達，且效果較依那普利更為顯著[4]。本研究則進一步發(fā)現(xiàn)，溫陽振衰顆粒不僅對CHF大鼠心功能指標(biāo)有較為顯著的改善作用，且可以顯著調(diào)控p-MEF2蛋白的表達，但其對ERK5蛋白的關(guān)鍵下游靶基因MEF2蛋白和MEF2 mRNA的影響并不顯著。這說明MEF2蛋白主要以磷酸化修飾來發(fā)揮其生物學(xué)作用，且溫陽振衰顆粒主要通過調(diào)控MEF2蛋白磷酸化而產(chǎn)生治療作用，但具體調(diào)控模式尚需進一步研究。

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Effect of Wenyang Zhenshuai Granules on the Expression of Myocardial MEF2 in Model Rats with Chronic Heart Failure

CAI Huzhi1，WANG Xiaoying2，CHEN Qingyang3，CHEN Xinyu4（1.Section of Scientific Research，the First Affiliated Hospital of Hunan University of TCM，Changsha 410007，China；2.College of Basic Medicine，Guiyang University of Chinese Medicine，Guiyang 550000，China；3.ICU Center，the First Affiliated Hospital of Hunan University of TCM，Changsha 410007，China；4.The First Affiliated Hospital of Hunan University of TCM，Changsha 410007，China）

OBJECTIVE：To study the effect of Wenyang zhenshuai granules on myocardial MEF2 in model rats with chronic heart failure（CHF）.METHODS：10 rats were randomly selected in 60 rats as normal control group（normal saline），the remaining 50 rats were randomly divided into model control group（normal saline），positive control group[enalapril，1.8 mg/（kg·d）]，Wenyang zhenshuai granules low-dose，medium-dose，high-dose groups[0.72，1.44，2.88 g/（kg·d）]after induced to CHF models by adriamycin，intragastrically administrated twice a day，for 4 weeks.After administration，heart function indexes[left ventricular ejection fraction（LVEF），left ventricular fractional shortening（LVFS），left ventricular end-diastolic diameter（LVSD）and left ventricular end-diastolic diameter（LVDD）]of rats in each group were detected，protein expressions of myocardial MEF2 and phosphorylated MEF2（p-MEF2）and mRNA expression of MEF2 were determined.RESULTS：Compared with normal control group，LVEF，LVFS of rats in model control group and each administration group were significantly reduced（P＜0.05），LVSD，LVDD were significantly increased（P＜0.05）；protein expression of myocardial p-MEF2 was significantly down-regulated（P＜0.05），and there were no statistical significances in protein or mRNA expressions of MEF2（P＞0.05）.Compared with model control group，heart function indexes of rats in each administration group were significantly improved（P＜0.05）；protein expression of myocardial p-MEF2 was significantly up-regulated（P＜0.05），and there were no statistical significances in protein or mRNA expressions of MEF2（P＞0.05）.CONCLUSIONS：Wenyang zhenshuai granule can antagonize the down-regulation effect of adriamycin-induced MEF2 protein phosphorylation，which may be one of the mechanisms of its treatment for CHF.

Wenyang zhenshuai granules；Chronic heart failure；Myocardial cell enhancer；Phosphorylated myocardial cell enhancer；Rats

R256.21

A

1001-0408（2017）34-4780-04

DOI10.6039/j.issn.1001-0408.2017.34.07

國家自然科學(xué)基金資助項目（No.81173213、81704-061）；湖南省教育廳資助項目（No.15C1047）；2016年度湖南省中醫(yī)藥科研計劃項目（No.201651）

＊助理研究員，主治醫(yī)師，博士。研究方向：中醫(yī)藥防治心腦血管疾病。電話：0731-85369076。E-mail：805032226@qq.com

#通信作者：教授，主任醫(yī)師，博士生導(dǎo)師，博士。研究方向：中醫(yī)藥防治心腦血管疾病。電話：0731-85600703。E-mail：chenxinyuchen@163.com

2017-03-30

2017-10-04）

（編輯：林靜）