天冬總皂苷的大孔樹脂純化工藝研究Δ

劉亮，杜江，馮華，丁麗娜，陳東林，周英信（.遵義醫(yī)藥高等?？茖W(xué)校藥學(xué)系，貴州遵義56006；.貴陽中醫(yī)學(xué)院藥學(xué)院，貴陽55000；.遵義市食品藥品檢驗所中藥室，貴州遵義56000）

天冬總皂苷的大孔樹脂純化工藝研究Δ

劉亮1＊，杜江2，馮華3，丁麗娜1，陳東林1，周英信1（1.遵義醫(yī)藥高等?？茖W(xué)校藥學(xué)系，貴州遵義563006；2.貴陽中醫(yī)學(xué)院藥學(xué)院，貴陽550002；3.遵義市食品藥品檢驗所中藥室，貴州遵義563000）

目的：對天冬總皂苷的大孔樹脂純化工藝進行優(yōu)選。方法：以天冬總皂苷含量等為指標，采用單因素試驗考察大孔樹脂型號、上樣吸附時間、上樣液稀釋倍數(shù)、吸附容量、洗脫溶劑體積分數(shù)及用量、洗脫速度，對大孔樹脂純化工藝進行優(yōu)化，并進行驗證試驗。結(jié)果：HPD-300型大孔樹脂對天冬總皂苷吸附及解析能力較強；最優(yōu)純化工藝為上樣吸附時間60 min，上樣液質(zhì)量濃度0.1 g/mL，吸附容量120 mL（15 BV），使用3 BV的60%乙醇溶液進行洗脫，洗脫速度為4 BV/h。驗證試驗中總皂苷的平均解析率為68.30%（RSD＝0.95%，n＝3）。結(jié)論：優(yōu)選的純化工藝穩(wěn)定、可行，可較好地分離純化天冬總皂苷。

天冬；總皂苷；大孔樹脂；純化工藝

天冬為百合科植物天門冬[Asparagus cochinchinensis（Lour.）Merr.]的塊根，具有養(yǎng)陰清熱、潤肺滋腎的功效，是一種臨床常用中藥。天冬是貴州省內(nèi)的大宗藥材，種植面積較大，僅在遵義市鳳岡縣就有近3 000畝的天冬種植基地。天冬主要含有糖類、氨基酸、皂苷類等成分[1]，具有抗氧化、抗衰老、抗菌等藥理活性[2]。通過文獻查閱，筆者發(fā)現(xiàn)目前對天冬總皂苷提取工藝方面研究較少[3-4]，且尚未見其純化工藝研究的報道。鑒于此，本試驗以總皂苷含量為指標，考察不同型號大孔樹脂對分離純化天冬總皂苷的影響，在此基礎(chǔ)上優(yōu)選出總皂苷的最佳純化工藝，以期為制訂天冬藥材質(zhì)量標準及其進一步開發(fā)利用提供依據(jù)。

1 材料

1.1 儀器

UV2501型紫外分光光度計（日本島津公司）；ADHG 90AOA型電熱恒溫鼓風(fēng)干燥箱（寧波江南儀器廠）；SHZ-Ⅲ型循環(huán)水真空泵、RE-52型旋轉(zhuǎn)蒸發(fā)器（上海亞榮生化儀器廠）；FA2004B型電子天平（上海越平科學(xué)儀器有限公司）。

1.2 藥材與試劑

天冬藥材于2016年6月收集于貴州遵義，經(jīng)遵義醫(yī)藥高等專科學(xué)校藥學(xué)系張學(xué)愈副教授鑒定為百合科植物天門冬[Asparagus cochinchinensis（Lour.）Merr.]的塊根；AB-8、S-8、DM-130型大孔樹脂（陜西樂博生化科技有限公司）。菝葜皂苷元對照品（上海圻明生物科技有限公司，批號：126-19-2，純度：≥98%）；HPD-100、HPD-300、D-101型大孔樹脂（滄州寶恩化工有限公司）；其他試劑均為分析純，試驗用水為高純水。

2 方法與結(jié)果

2.1 天冬總皂苷含量測定

2.1.1 對照品溶液制備將準確稱量的菝葜皂苷元對照品7.8 mg加甲醇溶解，轉(zhuǎn)移至25 mL棕色量瓶中定容，搖勻，即得。

2.1.2 供試品溶液制備準確稱取天冬藥材粗粉5 g，水浴90℃加熱提取2次，第1次用40 mL水提取1 h，第2次用30 mL水提取40 min，過濾，濾液加水溶解并定容至100 mL量瓶中，搖勻。從中移取10 mL，用水飽合正丁醇分3次萃取（15、15、15 mL），合并正丁醇萃取液，用正丁醇飽和的水20 mL萃取，減壓回收正丁醇層至干，濃縮物用甲醇溶解并定容于25 mL量瓶中，搖勻，即得。

2.1.3 測定波長選擇分別精密吸取對照品溶液、供試品溶液適量，置于15 mL具塞試管中，揮干甲醇，加入5%的香草醛冰醋酸溶液0.2 mL、高氯酸0.8 mL，搖勻，密塞，60℃水浴顯色15 min。取出后立即用冰水冷卻5 min，再加入5 mL冰醋酸稀釋，搖勻，靜置10 min。在400～800 nm波長范圍內(nèi)進行掃描，結(jié)果顯示對照品在455 nm波長處有較大吸收峰，而樣品在455 nm波長處有最大吸收峰，故選擇455 nm波長為本試驗的測定波長，波長掃描見圖1、圖2。

圖1 對照品溶液波長掃描圖Fig1Wavelengthscanningforreference substance solutions

圖2 供試品溶液波長掃描圖Fig 2Wavelength scanning for test sample solutions

2.1.4 線性關(guān)系考察試驗方法參考文獻[5]。分別用刻度吸量管準確移取菝葜皂苷元對照品溶液0、0.1、0.2、0.4、0.6、0.8、1.0 mL于具塞試管中，按“2.1.3”項下方法處理后，于455 nm波長處測定吸光度。以對照品質(zhì)量濃度為橫坐標（x）、吸光度為縱坐標（y）進行線性回歸，得回歸方程y＝0.011 69x+0.030 56（r＝0.999 4），結(jié)果表明總皂苷質(zhì)量濃度在5.2～52 μg/mL范圍內(nèi)與吸光度線性關(guān)系良好。

2.1.5 方法學(xué)考察依法進行精密度與準確度試驗。結(jié)果，精密度試驗RSD為0.50%（n＝6）；準確度試驗中，平均回收率為98.83%（RSD＝1.88%，n＝6），均符合相關(guān)要求。

2.2 大孔樹脂純化工藝優(yōu)選

2.2.1 天冬提取液制備準確稱取天冬藥材粗粉50 g，依次用70%乙醇回流提取2次，每次400 mL，每次提取1.5 h。合并2次提取液濃縮至無醇味，再加水定容至250 mL量瓶中，搖勻，即得質(zhì)量濃度為0.2 g/mL的天冬提取液。

2.2.2 樹脂預(yù)處理分別稱取6種型號（AB-8、S-8、D-101、DM-130、HPD-100、HPD-300）的大孔吸附樹脂適量，用95%乙醇浸泡24 h之后，轉(zhuǎn)移至玻璃柱中，用純化水洗至無醇味，即得。

2.2.3 大孔樹脂型號選擇試驗方法參考文獻[6]。分別稱取上述6種樹脂0.5 g置于具塞錐形瓶中，再加入天冬提取溶液20 mL，每間隔5 min振搖1次，持續(xù)2 h。靜止24 h后，抽濾，濾液加水稀釋至100 mL，即得天冬吸附后溶液。

將抽干后的樹脂置于具塞錐形瓶中，加70%乙醇20 mL進行解吸，每間隔5 min振搖1次，持續(xù)2 h。靜止24 h后，抽濾，濾液濃縮乙醇至干，濃縮液加水稀釋至100 mL，即得天冬解吸后溶液。

將上述所得溶液按“2.1”項下操作并進行總皂苷的含量測定，計算樹脂對總皂苷的靜態(tài)吸附量、靜態(tài)吸附率及解析率。靜態(tài)吸附量＝（原溶液質(zhì)量濃度－吸附后溶液質(zhì)量濃度）×吸附液體積/樹脂質(zhì)量；靜態(tài)吸附率＝（原溶液質(zhì)量濃度－吸附液質(zhì)量濃度）/原溶液質(zhì)量濃度×100%；靜態(tài)解析率＝（解析液質(zhì)量濃度×解析液體積）/靜態(tài)吸附量×100%。6種樹脂靜態(tài)吸附和解析結(jié)果見表1。

表1 6種樹脂靜態(tài)吸附和解析結(jié)果Tab 1Static adsorption-desorption results of 6 kinds of macroporous resins

由表1結(jié)果可知，6種型號大孔樹脂靜態(tài)吸附量、靜態(tài)吸附率及靜態(tài)解析率相差較大，其中HPD-300型樹脂的靜態(tài)吸附率與靜態(tài)解析率均最大，因此確定選用HPD-300型大孔樹脂用于后續(xù)的分離純化工藝研究。2.2.4靜態(tài)吸附動力學(xué)特征考察試驗方法參考文獻[7]。稱取HPD-300大孔樹脂0.5 g，轉(zhuǎn)移到具塞錐形瓶中，精密加入天冬提取液20 mL，搖勻，靜置吸附，于15、30、60、90、120、180、240、300、360 min移取1 mL上層清液（同時補純水1 mL），將上清液加水至10 mL，按“2.1”項下操作并測定總皂苷含量，計算靜態(tài)吸附率，繪制靜態(tài)吸附動力學(xué)曲線，結(jié)果見圖3。

圖3 HPD-300樹脂靜態(tài)吸附動力學(xué)曲線Fig 3Static adsorption curves of HPD-300 macroporous resin

由圖3可知，加入天冬提取液后，樹脂在60 min內(nèi)靜態(tài)吸附率變化較快，而之后則變化較緩。因此，為了快速達到較高的吸附率，確定上樣靜態(tài)吸附時間為60 min。

2.2.5 上樣液稀釋倍數(shù)考察試驗方法參考文獻[8]。稱取HPD-300型大孔樹脂5份，每份4 g，裝入離子交換柱中。取天冬提取液60 mL分別稀釋1、2、3、4、5倍后，分別上柱靜態(tài)吸附1 h，再以3 BV/h的流速進行吸附，吸附完成后，用水洗脫至近無色，再用70%乙醇3 BV洗脫，流速控制為3 BV/h。依次收集流出液，蒸干乙醇，用水溶解并定容至100 mL量瓶中，取10 mL，按“2.1”項下操作并測定總皂苷含量，計算解析量及解析率。其中，解析量＝解析液質(zhì)量濃度×解析液體積；解析率＝（某解析液的解析量/加入量）×100%。上樣液不同稀釋倍數(shù)比較結(jié)果見表2。

表2 上樣液不同稀釋倍數(shù)比較Tab 2Comparison of column solutions with different dilution multiple

由表2可知，大孔樹脂對天冬總皂苷的解析率隨著稀釋倍數(shù)的增加呈現(xiàn)先增大后減小的規(guī)律：當稀釋倍數(shù)為3倍時，解析率最高；但稀釋倍數(shù)為2～4倍時，解析率變化不大。結(jié)合操作的速度，確定上樣液稀釋2倍最佳，即天冬藥液質(zhì)量濃度為0.1 g/mL。

2.2.6 吸附容量考察試驗方法參考文獻[9]。稱取HPD-300型大孔樹脂4 g裝柱，取天冬提取液（0.1 g/mL）以3 BV/h的流速上樣吸附。流出液每10 mL收集1份，共收集20份，分別加水補足至100 mL，搖勻，取10 mL，按“2.1”項下操作并測定總皂苷含量。以上樣體積為橫坐標、總皂苷泄漏率（流出液皂苷質(zhì)量濃度/上樣液皂苷質(zhì)量濃度×100%）為縱坐標，繪制吸附泄漏曲線，結(jié)果見圖4。

由圖4可知，隨著上樣液體積的增加，泄漏率也不斷增加，但增加的程度有差異。當上樣液體積達到120 mL時，泄漏率明顯增大，說明樹脂吸附已經(jīng)達到動態(tài)飽和吸附量，故確定上樣體積為120 mL（15 BV），即1 g樹脂動態(tài)吸附生藥量為3 g。

圖4 HPD-300樹脂上樣吸附泄漏曲線Fig4AdsorptionleakingcurvesofHPD-300 macroporous resin

2.2.7 洗脫溶劑體積分數(shù)考察稱取HPD-300型大孔樹脂4 g裝柱，加入天冬提取液（0.1 g/mL）120 mL，靜態(tài)吸附后，以3 BV/h的流速進行吸附，再用水洗脫至近無色。之后依次用50%、60%、70%、80%、90%乙醇溶液，各以流速3 BV/h洗脫4 BV，依次收集乙醇洗脫液?；厥找掖己笥盟芙獠⒍ㄈ葜?00 mL量瓶中，取10 mL，按“2.1”項下操作并測定總皂苷含量，計算解析量及解析比例。其中，解析比例＝某洗脫濃度的解析量/總解析量×100%。洗脫溶劑不同體積分數(shù)比較結(jié)果見表3。

表3 洗脫溶劑不同體積分數(shù)比較Tab 3Comparison of different volume fraction of elution

由表3可知，天冬總皂苷主要集中在50%乙醇洗脫液中，占解析量的90.40%，60%乙醇洗脫后即達到完全洗脫，之后的洗脫液中無總皂苷檢出，故確定60%乙醇溶液為洗脫溶劑。

2.2.8 洗脫溶劑用量考察稱取HPD-300型大孔樹脂4 g裝柱，加入天冬提取液120 mL（0.1 g/mL）上柱靜態(tài)吸附后，以3 BV/h的流速進行吸附。吸附完成后，先用水洗至近無色，再用60%乙醇6 BV以3 BV/h的流速洗脫，每1 BV收集1份。分別濃縮后用水溶解并定容至100 mL量瓶中，取10 mL，按“2.1”項下操作并測定總皂苷含量，計算解析量及解析比例，結(jié)果見表4。

表4 洗脫溶劑不同用量比較Tab 4Comparison of different quantities of elution

4 5 6 0 0 0 0 0 0

由表4可知，60%乙醇洗脫用量達到3 BV時，即可將總皂苷完全洗脫下來，故確定洗脫溶劑用量為3 BV。2.2.9洗脫速度考察稱取HPD-300型大孔樹脂4 g裝柱，共5份，加入天冬提取液靜態(tài)吸附后，分別以1、2、3、4、5 BV/h的流速進行吸附。吸附結(jié)束后，先用水洗脫至近無色，再用60%乙醇3 BV以1、2、3、4、5 BV/h的速度洗脫。依次收集洗脫液，濃縮后用水溶解并定容至100 mL量瓶中，取10 mL，按“2.1”項下操作并測定總皂苷含量，計算解析量及解析率，結(jié)果見表5。

表5 溶劑不同洗脫速度比較Tab 5Comparison of different flow velocities of elution

由表5可知，洗脫速度越大，解析率越小，但2～4 BV/h洗脫速度之間的解析率變化不明顯。因此，綜合考慮速度及總皂苷的解析率，確定洗脫速度為4 BV/h。

2.2.10 工藝驗證試驗根據(jù)上述單因素試驗結(jié)果，取HPD-300型大孔樹脂4 g裝柱，共3份，分別加入天冬提取液靜態(tài)吸附后，以4 BV/h的流速進行吸附。吸附結(jié)束后，用水洗脫至近無色，再用60%乙醇3 BV洗脫。分別收集洗脫液，濃縮后用水溶解并定容至100 mL量瓶中，取10 mL，按“2.1”項下操作并測定總皂苷含量，計算解析量及解析率，結(jié)果見表6。

表6 純化工藝驗證結(jié)果Tab 6Validation test result of purification technology

由表6可知，60%乙醇洗脫液中總皂苷的平均解析率為68.30%（RSD＝0.95%，n＝3），說明該工藝有較好的分離純化效果。

3 討論

天冬藥材由于含有多糖類成分，因此在粉碎成粗粉前，一定要充分的干燥，否則會增加粉碎的難度，甚至損壞機器；同時稱量天冬粗粉時，速度要快，否則天冬藥材易吸收水分降低測量的準確度；由于天冬中多糖含量較高、極性較大，故為了排除多糖的干擾，一定要在正丁醇萃取后，再用水進行反萃取，從而將皂苷與多糖類成分分離。大孔樹脂在裝柱時應(yīng)盡量將氣泡除去，以免柱子出現(xiàn)斷層；加入供試液時，應(yīng)緩緩加入，防止樹脂沖起，影響分離效果。

目前采用大孔吸附樹脂技術(shù)分離、純化藥材皂苷類等有效部位的研究較多[10-16]。本試驗在參考文獻的基礎(chǔ)上，通過一系列工藝參數(shù)的優(yōu)化研究，首次建立起大孔吸附樹脂分離純化天冬中總皂苷的工藝路線，其具體工藝參數(shù)為：上樣質(zhì)量濃度為0.1 g/mL，上樣量15 BV，上樣吸附時間60 min，上樣及洗脫流速為4 BV/h，乙醇體積分數(shù)為60%，用量為3 BV。

綜上，通過大孔樹脂的吸附和解析試驗及驗證試驗，優(yōu)選所得的純化工藝穩(wěn)定、可行，可為天冬皂苷的純化制備提供依據(jù)。

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Study on the Purification Technology of Total Saponins from Asparagus cochinchinensis with Macroreticular Resin

LIU Liang1，DU Jiang2，F(xiàn)ENG Hua3，DING Lina1，CHEN Donglin1，ZHOU Yingxin1（1.Zunyi Medical and Pharmaceutical College，Guizhou Zunyi 563006，China；2.School of Pharmacy，Guiyang College of TCM，Guiyang 550002，China；3.Office of TCM，Zunyi Institute for Food&Drug Control，Guizhou Zunyi 563000，China）

OBJECTIVE：To optimize the purification technology of total saponins from Asparagus cochinchinensis with macroreticular resin.METHODS：Using content of total saponins from A.cochinchinensis as index，single factor test was used to investigate the macroreticular resin model，sampling adsorption time，mass concentration of the column，adsorption capacity，volume fraction and the amount of elution solvent，elution rate，and optimize the purification technology.And verification test was conducted.RESULTS：HPD-300 macroreticular resin showed strong absorption and desorption property.The optimal purification technology was that sampling adsorption time was 60 min，mass concentration of sample liquid was 0.1 g/mL，adsorption capacity was 120 mL（15 BV），it was eluded with 60%ethanol solution with 3 BV and elution rate was 4 BV/h.In the verification test，the average desorption rate of total saponins was 68.30%（RSD＝0.95%，n＝3）.CONCLUSIONS：Optimized purification technology is stable，feasible，and can easily separate and purify the total saponins from A.cochinchinensis.

Asparagus cochinchinensis；Total saponins；Macroreticular resin；Purification technology

R284.2

A

1001-0408（2017）34-4868-04

DOI10.6039/j.issn.1001-0408.2017.34.30

遵義市科技計劃課題（No.遵市科合社字〔2013〕24號）

＊碩士。研究方向：中藥、民族藥化學(xué)成分及質(zhì)量標準。E-mail：jikman1@163.com

2017-04-14

2017-09-27）

（編輯：劉明偉）