LC-MS/MS法在不明原因復(fù)發(fā)性流產(chǎn)患者血清10種氨基酸水平檢測中的應(yīng)用

許紅，韓彥潔，張瑤，劉力

(石家莊市第四醫(yī)院 石家莊市婦產(chǎn)醫(yī)院，石家莊050000)

LC-MS/MS法在不明原因復(fù)發(fā)性流產(chǎn)患者血清10種氨基酸水平檢測中的應(yīng)用

許紅，韓彥潔，張瑤，劉力

(石家莊市第四醫(yī)院 石家莊市婦產(chǎn)醫(yī)院，石家莊050000)

目的采用高效液相色譜串聯(lián)質(zhì)譜(LC-MS/MS)法檢測不明原因復(fù)發(fā)性流產(chǎn)(URSA)患者血清10種氨基酸水平變化，并對該方法進(jìn)行評價。方法選擇URSA患者40例作為觀察組，同期孕檢正常的早孕(孕周<20周)婦女40例作為對照組。采用LC-MS/MS法檢測兩組血清鳥氨酸、瓜氨酸、甘氨酸、丙氨酸、纈氨酸、精氨酸、亮氨酸、蛋氨酸、苯丙氨酸、酪氨酸水平，并進(jìn)行LC-MS/MS法檢測的專屬性、精密度及添加回收率、穩(wěn)定性分析。結(jié)果觀察組與對照組血清鳥氨酸分別為(89.3±8.9)、(33.6±5.4)μmol/L，瓜氨酸分別為(18.6±3.2)、(14.3±2.4)μmol/L，甘氨酸分別為(230.2±27.3)、(202.2±19.9)μmol/L，兩組比較P均<0.01。兩組血清丙氨酸、纈氨酸、精氨酸、亮氨酸、蛋氨酸、苯丙氨酸、酪氨酸水平比較差異均無統(tǒng)計學(xué)意義(P均>0.05)。專屬性分析結(jié)果顯示，觀察組血清中出現(xiàn)相應(yīng)氨基酸的質(zhì)荷比信號圖，空白甲醇溶液中只有添加內(nèi)標(biāo)的質(zhì)荷比信號，未見相應(yīng)的氨基酸信號。精密度及添加回收率分析結(jié)果顯示，采用LC-MS/MS法檢測血清10種氨基酸水平的添加回收率為82.1%～93.6%，日內(nèi)標(biāo)準(zhǔn)偏差為1.5%～5.1%，日間標(biāo)準(zhǔn)偏差為2.5%～7.1%。穩(wěn)定性分析結(jié)果顯示，樣本放置2～7天的平均回收率為95.3%～103.2%。結(jié)論URSA患者血清鳥氨酸、瓜氨酸、甘氨酸水平均升高，血清丙氨酸、纈氨酸、精氨酸、亮氨酸、蛋氨酸、苯丙氨酸、酪氨酸水平無明顯變化；LC-MS/MS法檢測血清氨基酸的回收率、重復(fù)性和穩(wěn)定性均較高。

復(fù)發(fā)性自然流產(chǎn)；高效液相色譜串聯(lián)質(zhì)譜法；氨基酸

復(fù)發(fā)性自然流產(chǎn)(RSA)是指與同一性伴侶連續(xù)發(fā)生≥2次于20孕周前妊娠物或胎兒丟失(胎兒體質(zhì)量<500 g)[1]，在育齡婦女中發(fā)生率為0.4%～1.0%[2]。目前已知導(dǎo)致RSA的病因包括夫妻雙方染色體異常及女性孕期內(nèi)分泌功能異常、自身免疫性疾病、病原微生物感染、子宮解剖結(jié)構(gòu)異常、環(huán)境異常因素等[3]。除上述因素外，仍有約50%的RSA患者尚未發(fā)現(xiàn)明確的致病因素，為不明原因復(fù)發(fā)性流產(chǎn)(URSA)[4,5]。孕婦體內(nèi)氨基酸為胎兒蛋白的合成提供物質(zhì)基礎(chǔ)，與胎兒生長發(fā)育密切相關(guān)[6]。文獻(xiàn)報道，孕婦氨基酸代謝紊亂是RSA發(fā)生的一個重要因素，如孕婦血漿同型半胱氨酸水平增高可明顯增加RSA發(fā)生率[7]。受實驗技術(shù)條件的影響，關(guān)于URSA患者血清氨基酸水平變化的相關(guān)研究報道較少[8]。2016年8月～2017年3月，本研究采用高效液相色譜串聯(lián)質(zhì)譜(LC-MS/MS)法檢測URSA患者血清10種氨基酸水平變化，并評價該方法的專屬性、精密度及添加回收率、穩(wěn)定性分析，旨在為URSA的病因?qū)W研究及其診斷、治療提供理論依據(jù)。

1 臨床資料

選擇同期石家莊市婦產(chǎn)醫(yī)院收治的URSA患者40例作為觀察組，年齡20～35歲。納入標(biāo)準(zhǔn)：①通過詳細(xì)病史、常規(guī)血液學(xué)檢查(血常規(guī)、血生化、抗磷脂抗體系列、血同型半胱氨酸等)及神經(jīng)系統(tǒng)檢查等未查明流產(chǎn)原因；②確診妊娠后不明原因流產(chǎn)2次及以上，流產(chǎn)時孕周<20周，且既往有不明原因流產(chǎn)史；③入組前未接受任何藥物治療。排除標(biāo)準(zhǔn)：①生殖器官解剖異常；②合并內(nèi)分泌、免疫、遺傳疾病；③生殖泌尿系統(tǒng)急性感染；④身體其他部位存在明顯感染。選擇同期孕檢正常的早孕婦女40例作為對照組，年齡20～35歲，孕周<20周，無自然流產(chǎn)、死胎、死產(chǎn)史。排除合并肝、腎等系統(tǒng)性疾病者、合并免疫性疾病者，宮內(nèi)感染及存在其他臨床發(fā)熱征象者。兩組年齡、孕周均具有可比性。本研究通過石家莊市婦產(chǎn)醫(yī)院倫理委員會審核，受試者及其家屬均知情同意。

2 方法與結(jié)果

2.1 血清10種氨基酸水平檢測 采用LC-MS/MS法。兩組入組次日空腹8 h后采血2 mL，立即以離心半徑10.5 cm、轉(zhuǎn)速3 500 r/min的離心機離心15 min，分離血清，將離心后的血清滴于903#專用采血濾紙上(直徑>8 mm)，晾干后分批待測。用打孔器打孔(3 mm)采血濾紙，收集圓孔于96孔U型板中，每孔加入工作液90 μL，并覆上粘性封膜減少揮發(fā)。30 ℃條件下650 CPM振頻振蕩孵育45 min，轉(zhuǎn)移70 μL上清液至V型底耐熱微孔板中，覆上鋁箔封膜減少揮發(fā)。將微孔板放入LC-MS/MS自動進(jìn)樣器中進(jìn)行檢測。

工作液配制：取同位素標(biāo)準(zhǔn)品50 μL，加入甲醇9.95 mL(稀釋200倍)，密封4 ℃保存，使用時恢復(fù)至室溫。色譜與質(zhì)譜條件：流動相：100%甲醇溶液，進(jìn)樣量：20 μL，采用多反應(yīng)監(jiān)測(MRM)模式進(jìn)行正離子掃描。離子噴射電壓 5 000 V，溫度 550 ℃；源內(nèi)氣體1(GS1，N2)壓力350 kPa，氣體2(GS2，N2)壓力400 kPa，氣簾氣體(N2)壓力135 kPa；碰撞氣(N2)壓力中等，解簇電壓(DP)35 V，碰撞能量(CE)30 eV。

定量及數(shù)據(jù)處理：處理后的樣本在LC-MS/MS平臺檢測得到總離子流，提取10 種氨基酸和對應(yīng)內(nèi)標(biāo)的MRM離子流，進(jìn)行積分處理。每20 μL進(jìn)樣中含有25 pmol從日常工作液中帶入的丙氨酸、纈氨酸、鳥氨酸、精氨酸、亮氨酸、蛋氨酸、苯丙氨酸、酪氨酸、瓜氨酸同位素內(nèi)標(biāo)，以及125 pmol甘氨酸同位素內(nèi)標(biāo)，以特定的校正系數(shù)K進(jìn)行校準(zhǔn)。校準(zhǔn)公式：C1=A1×CIS×K/AIS。其中，C1為測試樣本氨基酸濃度，A1為測試樣本氨基酸峰面積，CIS為內(nèi)標(biāo)氨基酸濃度，K為特定校準(zhǔn)系數(shù)，AIS為內(nèi)標(biāo)氨基酸峰面積。定量方法參考既往文獻(xiàn)[9]。

2.2 LC-MS/MS法檢測血清氨基酸的方法學(xué)評價

2.2.1 專屬性分析 在1.2色譜質(zhì)譜條件下檢測空白甲醇溶液與URSA患者血清不同質(zhì)荷比的氨基酸信號強度，驗證方法專屬性。結(jié)果顯示，觀察組血

表1 兩組血清10種氨基酸水平比較

注：與對照組比較，*P<0.01。

清中出現(xiàn)相應(yīng)氨基酸的質(zhì)荷比信號圖，空白甲醇溶液中只有添加內(nèi)標(biāo)的質(zhì)荷比信號，未見相應(yīng)氨基酸的信號。

2.2.2 精密度及添加回收率分析 將含各氨基酸的血液樣本進(jìn)行添加回收實驗和精密度實驗，參照1.2的方法進(jìn)行預(yù)處理及檢測，丙氨酸、纈氨酸、鳥氨酸、亮氨酸、甘氨酸的添加濃度均為10、50、100 μmol/L，精氨酸、苯丙氨酸、酪氨酸的添加濃度均為10、20、50 μmol/L，蛋氨酸、瓜氨酸的添加濃度均為5、10、20 μmol/L。每日平行測定添加樣本5次，計算其添加回收率和日內(nèi)相對標(biāo)準(zhǔn)偏差，連續(xù)測定5天，計算其日間相對標(biāo)準(zhǔn)偏差。結(jié)果顯示，采用LC-MS/MS法檢測血清10種氨基酸水平的添加回收率為82.1%～93.6%，日內(nèi)標(biāo)準(zhǔn)偏差為1.5%～5.1%，日間標(biāo)準(zhǔn)偏差為2.5%～7.1%。見表2。

2.2.3 穩(wěn)定性分析 將離心后高、低濃度的質(zhì)控血滴于采血濾紙上，同一樣本分別放置1～7天，每天檢測3次，以第1天檢測為基準(zhǔn)。結(jié)果顯示，樣本放置2～7天的平均回收率為95.3%～103.2%。見表3。

3 討論

URSA的發(fā)病機制復(fù)雜，迄今尚未明確，無法采取針對性治療，是困擾生殖醫(yī)學(xué)和婦產(chǎn)科學(xué)的一大難題[10,11]。近年來文獻(xiàn)報道，氨基酸為胎兒蛋白質(zhì)合成提供物質(zhì)基礎(chǔ)，與胎兒生長發(fā)育密切相關(guān)，蛋白質(zhì)和氨基酸代謝可能與URSA發(fā)病機制有關(guān)[12]。首先，母體或胎盤氨基酸轉(zhuǎn)運障礙，輸送至胎兒生長微環(huán)境的氨基酸量不足，可導(dǎo)致胎兒發(fā)育不良而流產(chǎn)；其次，母體分解代謝亢進(jìn)，母體-胎盤-胎兒循環(huán)鏈代謝失衡亦可導(dǎo)致胎兒停育。本研究采用LC-MS/MS法檢測URSA患者血清10種氨基酸水平，旨在為URSA的病因?qū)W研究及其診斷、治療提供理論依據(jù)，同時有助于篩查URSA患者血清生物標(biāo)記物。

纈氨酸、亮氨酸、苯丙氨酸為人體必需氨基酸，對胎兒在宮內(nèi)發(fā)育具有重要影響[13]，丙氨酸、鳥氨酸、精氨酸、酪氨酸、蛋氨酸與胎兒宮內(nèi)生長遲緩及胎兒早產(chǎn)有關(guān)[14]，甘氨酸和瓜氨酸作為抑制性氨基酸與胎兒畸形及出生缺陷有關(guān)[15]。鳥氨酸在體內(nèi)與胺甲酰磷酸化合生成瓜氨酸和磷酸，瓜氨酸再轉(zhuǎn)化為精氨酸，精氨酸再裂解為尿素和鳥氨酸，這一代謝途徑在代謝上具有重要作用[16]。精氨酸降低可導(dǎo)致胎兒生長受限，可能會影響正常妊娠導(dǎo)致早產(chǎn)[17]。甘氨酸不僅是中樞神經(jīng)系統(tǒng)的抑制性神經(jīng)遞質(zhì)，而且還廣泛參與代謝調(diào)控、抗氧化和凋亡、 調(diào)節(jié)血脂代謝等病理生理學(xué)過程[18]。本研究結(jié)果顯示，觀察組血清鳥氨酸、瓜氨酸、甘氨酸水平均高于對照組，兩組血清丙氨酸、纈氨酸、精氨酸、亮氨酸、蛋氨酸、苯丙氨酸、酪氨酸水平比較差異均無統(tǒng)計學(xué)意義；說明血清鳥氨酸、瓜氨酸、甘氨酸水平變化可能參與了URSA的發(fā)生，未來可針對上述3種氨基酸深入研究URSA的發(fā)生機制。本研究專屬性分析結(jié)果顯示，觀察組血清中出現(xiàn)相應(yīng)氨基酸的質(zhì)荷比信號圖，空白甲醇溶液中只有添加內(nèi)標(biāo)的質(zhì)荷比信號，未見相應(yīng)氨基酸的信號，說明本方法具有良好的專屬性和特異性；精密度及添加回收率分析結(jié)果顯示，采用LC-MS/MS法檢測血清10種氨基酸水平的添加回收率為82.1%～93.6%，日內(nèi)標(biāo)準(zhǔn)偏差為1.5%～5.1%，日間標(biāo)準(zhǔn)偏差為2.5%～7.1%，說明該方法具有良好的添加回收率和精密度；穩(wěn)定性分析結(jié)果顯示，樣本放置2～7天的平均回收率為95.3%～103.2%，說明該樣本在室溫下放置7天對檢測結(jié)果無明顯影響。以上均說明采用LC-MS/MS法檢測血清氨基酸的回收率、重復(fù)性和穩(wěn)定性均較高，操作簡單、快速。

表2 血液氨基酸精密度及添加回收率測定結(jié)果

表3 血液氨基酸穩(wěn)定性測定結(jié)果

本研究為了提升檢測效果，對幾個重要的檢測條件進(jìn)行了優(yōu)化。由于氨基酸分子量均較小，檢測中選用較小的離子噴射電壓，經(jīng)過優(yōu)化調(diào)試發(fā)現(xiàn)離子噴射電壓在5 000 V時信號較高且穩(wěn)定。離子化溫度低于500 ℃時會導(dǎo)致離子化程度不充分，影響氨基酸檢測響應(yīng)值和定量結(jié)果；而當(dāng)離子化溫度高于650 ℃時又會造成離子化過程中部分中性基質(zhì)碳化或焦化，污染離子源，降至550 ℃后離子化效果較好且不易焦化。由于氣簾氣過小容易污染標(biāo)本，使中性分子和污染物進(jìn)入質(zhì)譜，造成基線過高而影響準(zhǔn)確性，因此本研究氣簾氣選擇為135 kPa。

綜上所述，URSA患者血清鳥氨酸、瓜氨酸、甘氨酸水平升高，丙氨酸、纈氨酸、精氨酸、亮氨酸、蛋氨酸、苯丙氨酸、酪氨酸水平無明顯變化。人體中氨基酸種類眾多，本研究僅涉及其中10種相關(guān)氨基酸，后續(xù)將繼續(xù)對URSA患者體內(nèi)其他相關(guān)氨基酸水平變化進(jìn)行深入研究，為明確URSA的發(fā)病機制提供依據(jù)。

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ApplicationofLC-MS/MSmethodindetectionof10kindsofaminoacidsinserumofpatientswithunexplainedrecurrentspontaneousabortion

XUHong,HANYanjie,ZHANGYao,LIULi

(TheFourthHospitalofShijiazhuang,Shijiazhuang050000,China)

ObjectiveTo detect the changes of 10 kinds of amino acid levels in patients with unexplained recurrent spontaneous abortion (URSA) by high performance liquid chromatography-tandem mass spectrometry (LC-MS/MS) method, then to evaluate the performance of this method.MethodsForty URSA patients were used as the observation group, 40 normal early pregnancy women (<20 weeks) were arranged as the control group. LC-MS/MS method was used to detect ornithine, citrulline, glycine, alanine, valine, arginine, leucine, methionine, phenylalanine, and tyrosine levels in the two groups. The specificity, precision, recovery rate, and stability of LC-MS/MS method were also analyzed.ResultsThe serum ornithine levels in the observation group and control group were (89.3±8.9) and (33.6±5.4) μmol/L, respectively; citrulline levels were separately (18.6±3.2) and (14.3±2.4) μmol/L, and glycine levels were separately (230.2±27.3) and (202.2±19.9) μmol/L(allP<0.01). No significant difference was found in the levels of serum alanine, valine, arginine, leucine, methionine, phenylalanine, and tyrosine between the two groups (allP>0.05). The specificity analysis showed that the amino acid m/z was observed in the serum of the observation group, and there was only internal standard m/z in methanol blank solution, no m/z of the corresponding amino acid. The precision and recovery rate analysis showed that the recovery rate of the method was 82.1%-93.6%, the within-day relative standard deviation (RSD) was 1.5%-5.1% and the between-days RSD was 2.5%-7.1%. The stability analysis showed that the average recovery rate was 95.3%-103.2% for 2-7 days.ConclusionsThe levels of serum ornithine, citrulline, and glycine increase in URSA patients, but no significant changes are found in the serum alanine, valine, arginine, leucine, methionine, phenylalanine and tyrosine. The LC-MS/MS method has high recovery rate, repeatability, and stability in detection of serum amino acids.

recurrent spontaneous abortion; high performance liquid chromatography-tandem mass spectrometry; amino acid

河北省科技計劃項目(122777100)。

許紅(1962-)，女，主任檢驗師，研究方向為串聯(lián)質(zhì)譜在臨床檢驗中的應(yīng)用。E-mail： xuhong5618@126.com

10.3969/j.issn.1002-266X.2017.44.005

R331

A

1002-266X(2017)44-0018-04

2017-05-17)