KLF7聯(lián)合脂肪源性干細(xì)胞對脊髓損傷大鼠運動功能的影響及其機(jī)制

李文媛，王瑩，郭素芬，劉星，李智剛，劉貴波，許志鵬，張際菲

(1牡丹江醫(yī)學(xué)院，黑龍江牡丹江157011；2牡丹江醫(yī)學(xué)院紅旗醫(yī)院)

KLF7聯(lián)合脂肪源性干細(xì)胞對脊髓損傷大鼠運動功能的影響及其機(jī)制

李文媛1，王瑩1，郭素芬1，劉星1，李智剛2，劉貴波1，許志鵬1，張際菲1

(1牡丹江醫(yī)學(xué)院，黑龍江牡丹江157011；2牡丹江醫(yī)學(xué)院紅旗醫(yī)院)

目的觀察KLF樣轉(zhuǎn)錄因子7(KLF7)聯(lián)合脂肪源性干細(xì)胞(ADSC)對脊髓損傷大鼠運動功能的影響，并探討其可能的機(jī)制。方法將30只SD大鼠隨機(jī)分為KLF7聯(lián)合ADSC組、ADSC組及對照組，每組10只，均采用離斷右半脊髓的方法制備脊髓損傷模型。KLF7聯(lián)合ADSC組于脊髓損傷組織注入100 μL ADSC(ADSC均采用PKH26進(jìn)行標(biāo)記)及2 μL AAV2-KLF7腺病毒，ADSC組僅注入100 μL ADSC，對照組僅注入100 μL PBS。術(shù)后1天及1、2、3、4周行運動功能評分(BBB評分);術(shù)后4周，應(yīng)用誘發(fā)電位儀和磁刺激器經(jīng)顱磁刺激運動誘發(fā)神經(jīng)電生理反應(yīng)，記錄神經(jīng)傳導(dǎo)速度、潛伏期及波幅。術(shù)后4周處死，采用Western boltting法檢測脊髓損傷組織KLF7、神經(jīng)生長因子(NGF)及其受體酪氨酸激酶A(TrkA)蛋白相對表達(dá)量，計算脊髓損傷面積百分比及ADSC數(shù)量(以PKH26的光密度值表示)。結(jié)果與術(shù)后1天比較，各組術(shù)后1、2、3、4周BBB評分均升高(P均<0.05)。術(shù)后4周，KLF7聯(lián)合ADSC組與ADSC組BBB評分、神經(jīng)傳導(dǎo)速度、波幅、ADSC數(shù)量及脊髓損傷組織NGF、TrkA蛋白相對表達(dá)量均高于對照組，潛伏期及脊髓損傷面積百分比均低于對照組，且KLF7聯(lián)合ADSC組上述變化更明顯(P均<0.05)。KLF7聯(lián)合ADSC組脊髓損傷組織KLF7蛋白相對表達(dá)量均高于ADSC組及對照組(P均<0.05)。結(jié)論KLF7聯(lián)合ADSC可減輕脊髓損傷大鼠的神經(jīng)損傷，改善其運動功能；其機(jī)制可能與KLF7促進(jìn)ADSC存活及提高脊髓損傷組織NGF、TrkA表達(dá)有關(guān)。

脊髓損傷；KLF樣轉(zhuǎn)錄因子7；脂肪源性干細(xì)胞；神經(jīng)生長因子；酪氨酸激酶A；大鼠

脊髓損傷可導(dǎo)致機(jī)體感覺、運動、肌力異常等一系列病理變化，除導(dǎo)致機(jī)體感覺和隨意運動障礙外，還影響自主神經(jīng)系統(tǒng)，導(dǎo)致多個器官功能障礙或衰竭[1,2]。KLF樣轉(zhuǎn)錄因子7(KLF7)屬于鋅指家庭成員，在斑馬魚神經(jīng)系統(tǒng)中高表達(dá)[3]，并可促進(jìn)大鼠脊髓皮質(zhì)束軸突再生[4]。KLF7為軸突生長促進(jìn)劑， 可促進(jìn)小鼠坐骨神經(jīng)運動軸突再生和髓鞘形成，其基因轉(zhuǎn)錄激活可促進(jìn)成人皮質(zhì)脊髓束軸突再生[5]。敲除KLF7基因可引起中樞神經(jīng)、視網(wǎng)膜和嗅覺神經(jīng)軸突再生障礙[6]。研究證實，神經(jīng)生長因子(NGF)及其受體酪氨酸激酶A(TrkA)是KLF7的下游靶基因[4,7]，二者也是重要的神經(jīng)營養(yǎng)因子，在神經(jīng)損傷修復(fù)過程中發(fā)揮重要作用。前期研究證實，脂肪源性干細(xì)胞(ADSC)能夠促進(jìn)脊髓損傷修復(fù)，但單獨應(yīng)用對神經(jīng)功能的恢復(fù)效果并不理想[8,9]。2015年3月～2016年11月，本研究觀察了KLF7聯(lián)合ADSC對脊髓損傷大鼠運動功能的影響，現(xiàn)分析結(jié)果并探討其機(jī)制，旨在為脊髓損傷的治療提供依據(jù)。

1 材料與方法

1.1 材料 實驗動物：雄性健康C57BL/6小鼠5只，6～8周齡，體質(zhì)量(19±2)g，購自哈爾濱醫(yī)科大學(xué)實驗動物中心。SD大鼠30只，雌雄各半，6～8周齡，體質(zhì)量(200±20)g，購自哈爾濱醫(yī)科大學(xué)實驗動物中心。主要試劑：DMEM/F12 培養(yǎng)液購自美國Hyclone公司，F(xiàn)BS、胰蛋白酶、茜素紅、多聚賴氨均購自美國Gibco公司，PKH26、兔抗NGF抗體和兔抗TrkA抗體均購自美國Sigma公司，AAV2-KLF7腺病毒購自美國Vector BioLabs公司。主要儀器：CO2培養(yǎng)箱購自日本三洋公司，誘發(fā)電位儀和磁刺激器購自英國Magstim公司，脊髓沖擊損傷模型儀(ModelⅡ NYU Impactor)購自美國MASCIS公司。

1.2 ADSC分離培養(yǎng)及標(biāo)記 參照前期研究方法[9]，取5只C57BL/6小鼠的腹部脂肪組織行ADSC分離、原代培養(yǎng)。原代培養(yǎng)8天，ADSC形成的細(xì)胞群落較為密集，光鏡下呈多角形或梭形伸展，有鋪路石狀特征。傳代培養(yǎng)2周，加入成骨誘導(dǎo)液(基礎(chǔ)培養(yǎng)液+0.1 μmol/L地塞米松+50 μmol/L維生素C+10 mmol/L β-甘油磷酸鈉)進(jìn)行成骨誘導(dǎo)。成骨誘導(dǎo)28天茜素紅染色結(jié)果顯示，ADSC細(xì)胞質(zhì)內(nèi)出現(xiàn)鈣鹽沉積，茜素紅染色后呈紅色聚集物，證實該細(xì)胞為ADSC(具有成骨誘導(dǎo)分化潛能)。取傳4代的ADSC，制備單細(xì)胞懸液，調(diào)整細(xì)胞密度為1×106個/100 μL，參照Wang等[10]的方法行PKH26染色標(biāo)記。

1.3 模型制備及分組處理 將30只大鼠隨機(jī)分為KLF7聯(lián)合ADSC組、ADSC組及對照組，每組10只。三組均參照Gomes-Osman等[2]的方法制備脊髓損傷模型，方法如下：10%水合氯醛溶液腹腔注射麻醉，術(shù)區(qū)備皮，常規(guī)消毒，鋪無菌單；以肋骨為定位中心，于大鼠背部棘突體表作一長約3 cm的切口，切開皮膚、皮下組織，剝離椎旁肌肉，顯露棘突、椎板及關(guān)節(jié)突。用咬骨鉗咬除T10及部分T9、T11椎板，顯露脊髓；顯微鏡下可見正中靜脈，用顯微外科剪垂直剪斷右側(cè)脊髓，鏡下可見脊髓右半部分完全離斷，大鼠雙下肢出現(xiàn)抽動和癱瘓，證實造模成功。KLF7聯(lián)合ADSC組于脊髓損傷組織注入100 μL ADSC及2 μL AAV2-KLF7腺病毒(含1×1011pfu/mL)，ADSC組僅注入100 μL ADSC，對照組僅注入100 μL PBS。關(guān)閉切口，術(shù)后切口涂抹紅霉素軟膏預(yù)防感染。

1.4 運動功能檢測 ①BBB評分：各組均于術(shù)后1天及1、2、3、4周同一時間點(20：00)行BBB評分[11]，由兩名醫(yī)師同時進(jìn)行，取平均值。②神經(jīng)電生理相關(guān)參數(shù)：術(shù)后4周，參照Wang等[12]的方法，將電磁線圈置于各組大鼠顱骨激活皮層下組織，應(yīng)用誘發(fā)電位儀和磁刺激器經(jīng)顱磁刺激運動誘發(fā)神經(jīng)電生理反應(yīng)，記錄神經(jīng)傳導(dǎo)速度、潛伏期及波幅。實驗重復(fù)4次，取平均值。

1.5 脊髓損傷組織KLF7、NGF、TrkA蛋白表達(dá)檢測 采用Western boltting法。術(shù)后4周，采用10%水合氯醛溶液(350 mg/kg)腹腔注射將大鼠麻醉后迅速處死，以T10損傷灶為中心，取出約1 cm的新鮮脊髓組織，-80 ℃冰箱保存。用顯微外科手術(shù)剪刀將損傷脊髓組織剪碎，研磨器充分研磨，加入相應(yīng)體積的RIPA裂解液和1% PMSF蛋白酶抑制劑，離心吸取上清液。BCA定量試劑盒測定蛋白濃度合格，進(jìn)行SDS-PAGE，分離蛋白后轉(zhuǎn)至硝酸纖維素膜；緩沖液封閉后，加入KLF7一抗(1∶200)、兔抗NGF一抗(1∶200)或兔抗TrkA一抗(1∶200)，4 ℃孵育過夜；加入辣根過氧化物酶標(biāo)記的抗小鼠二抗(1∶2 000)，孵育 2 h；TBS洗凈后經(jīng)顯色液作用15 min，掃描后經(jīng)Image J圖像分析軟件對印跡區(qū)進(jìn)行條帶灰度分析。以目的蛋白與內(nèi)參蛋白GADPH灰度值的比值作為目的蛋白相對表達(dá)量。

1.6 脊髓損傷面積檢測 取脊髓損傷組織，中性甲醛液充分固定，常規(guī)脫水制片包埋，25 μm厚度切片。常規(guī)行HE染色：將冰凍切片在空氣中干燥1～2天，蒸餾水浸泡1～2 min；蘇木素溶液中浸泡1 min，蒸餾水洗凈；1%鹽酸處理30 s，蒸餾水沖洗3 min，80%乙醇脫水1～2 min；伊紅溶液中浸泡1～2 min，蒸餾水洗凈；80%乙醇脫水1 min，95%乙醇脫水1 min，無水乙醇脫水1 min，二甲苯透明3 min。擦干后中性樹膠封片。選擇10張切片，采用Image6.0軟件計算每張切片空洞面積與正常脊髓面積的百分比，即脊髓損傷面積百分比。實驗重復(fù)3次，取平均值。

1.7 脊髓損傷組織ADSC數(shù)量檢測 取各組1.5中的脊髓損傷組織冰凍切片，根據(jù)檢測PKH26標(biāo)記的熒光顯像說明書進(jìn)行操作。熒光顯像參數(shù)設(shè)定如下：激發(fā)光波長450～570 nm，發(fā)射光波長570～700 nm，曝光時間1 min。熒光顯微鏡下進(jìn)行觀察，PKH26標(biāo)記后的ADSC呈紅色。采用Image6.0軟件分析PKH26的光密度值，以此表示ADSC數(shù)量。

2 結(jié)果

2.1 三組BBB評分比較 見表1。

表1 三組BBB評分比較

注：與同組術(shù)后1天比較，*P<0.05；與對照組同時間點比較，#P<0.05；與ADSC組同時間點比較，△P<0.05。

2.2 三組神經(jīng)電生理相關(guān)參數(shù)比較 見表2。

表2 三組神經(jīng)電生理相關(guān)參數(shù)比較

注：與對照組比較，*P<0.05；與ADSC組比較，#P<0.05。

2.3 三組脊髓損傷組織KLF7、NGF、TrkA蛋白表達(dá)比較 見表3。

表3 三組脊髓損傷組織KLF7、NGF、TrkA蛋白相對表達(dá)量比較

注：與對照組比較，*P<0.05；與ADSC組比較，#P<0.05。

2.4 三組脊髓損傷面積及ADSC數(shù)量比較 見表4。

表4 三組脊髓損傷面積百分比及ADSC數(shù)量比較

注：與對照組比較，*P<0.05；與ADSC組比較，#P<0.05。

3 討論

脊髓損傷修復(fù)的機(jī)制仍然不明確，其臨床治療多以外科手術(shù)減壓及大劑量激素沖擊為主，對于脊髓炎、脊髓空洞等引起的脊髓變性目前暫無有效藥物治療[12]。ADSC不僅可以分化為中、內(nèi)、外胚層細(xì)胞，而且還能夠分化為神經(jīng)細(xì)胞，在中樞神經(jīng)損傷恢復(fù)期發(fā)揮重要作用[13]。ADSC在脊髓損傷早期具有刺激作用，可促進(jìn)多種細(xì)胞因子和神經(jīng)營養(yǎng)因子表達(dá)，如腦源性神經(jīng)營養(yǎng)因子、NGF、堿性成纖維細(xì)胞生長因子、胰島素樣生長因子、肝細(xì)胞生長因子、血管內(nèi)皮生長因子等[14]。在神經(jīng)修復(fù)過程中，上述細(xì)胞因子和神經(jīng)營養(yǎng)因子可以通過誘導(dǎo)血管生成促進(jìn)神經(jīng)功能恢復(fù)，減少損傷周邊區(qū)神經(jīng)元凋亡，重建樹突和軸突突觸，并促進(jìn)神經(jīng)元再生和分化。ADSC可誘導(dǎo)分泌可溶性因子，如骨形態(tài)發(fā)生蛋白2和骨形態(tài)發(fā)生蛋白4等，這些因子在缺血區(qū)星形膠質(zhì)細(xì)胞的分化過程中具有重要作用。前期研究也發(fā)現(xiàn)，ADSC可合成、分泌大量神經(jīng)營養(yǎng)因子，如神經(jīng)生長因子、血管內(nèi)皮生長因子等，這些促進(jìn)神經(jīng)生長的因子可為軸突生長提供營養(yǎng)，促進(jìn)周圍神經(jīng)軸突再生[8,9]。因此，ADSC移植被認(rèn)為是一個治療脊髓損傷的具有廣闊前景的方法。

KLF屬于鋅指家庭成員，具有DNA結(jié)合域的羧基末端，由3個高度保守的Cys2/His2鋅指結(jié)構(gòu)組成，其DNA結(jié)合域通過與靶基因啟動子上的C框或CACCC元件結(jié)合而發(fā)揮調(diào)控靶基因表達(dá)的作用，廣泛參與細(xì)胞增殖、凋亡、分化以及胚胎發(fā)育等多個生命活動的調(diào)控[15]。KLF7在中樞和周圍神經(jīng)系統(tǒng)中廣泛存在，可調(diào)控多種細(xì)胞的發(fā)育、增殖和分化，對周圍神經(jīng)系統(tǒng)軸突再生、髓鞘形成發(fā)揮重要作用，提高KLF7表達(dá)不僅可促進(jìn)軸突生長，也可增加神經(jīng)元營養(yǎng)，促進(jìn)軸突生長[16]。本研究結(jié)果顯示，與術(shù)后1天比較，各組術(shù)后1、2、3、4周BBB評分均升高，說明三組治療后運動功能均有所恢復(fù)；KLF7聯(lián)合ADSC組與ADSC組術(shù)后4周BBB評分、神經(jīng)傳導(dǎo)速度、波幅均高于對照組，潛伏期及脊髓損傷面積百分比均低于對照組，但KLF7聯(lián)合ADSC組變化更明顯，說明KLF7聯(lián)合ADSC可有效減輕脊髓損傷大鼠的神經(jīng)損傷，并有助于提高其神經(jīng)功能、促進(jìn)其運動功能的恢復(fù)。

研究發(fā)現(xiàn)，KLF7能夠在周圍神經(jīng)系統(tǒng)上調(diào)靶基因NGF和TrkA表達(dá)，激活神經(jīng)營養(yǎng)因子信號通路；通過增強(qiáng)TrkA受體的穩(wěn)態(tài)，促進(jìn)NGF誘發(fā)神經(jīng)突起生長的作用[4]。目前已明確NGF/TrkA信號通路在促進(jìn)神經(jīng)元生長中發(fā)揮重要作用，但KLF7在脊髓損傷中對NGF/TrkA信號通路的調(diào)控尚不清楚。本研究結(jié)果顯示，KLF7聯(lián)合ADSC組、ADSC組脊髓損傷組織NGF、TrkA蛋白相對表達(dá)量均高于對照組，但KLF7聯(lián)合ADSC組升高更明顯；說明KLF7聯(lián)合ADSC促進(jìn)脊髓損傷后運動及神經(jīng)功能恢復(fù)的機(jī)制可能與NGF/TrkA信號通路激活有關(guān)，與以往研究結(jié)果一致[16]。本研究結(jié)果顯示，KLF7聯(lián)合ADSC組、ADSC組ADSC數(shù)量均高于對照組，但KLF7聯(lián)合ADSC組升高更明顯，說明KLF7與ADSC聯(lián)合移植有助于促進(jìn)ADSC存活及發(fā)揮神經(jīng)再生功能。

綜上所述，KLF7聯(lián)合ADSC可改善脊髓損傷大鼠的運動功能，減輕其神經(jīng)損傷；其機(jī)制可能與KLF7促進(jìn)ADSC存活及提高脊髓損傷組織NGF、TrkA表達(dá)有關(guān)。

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EffectofKLF7andadipose-derivedstemcellsonmotorfunctionafterspinalcordinjuryinrats

LIWenyuan1,WANGYing,GUOSufen,LIUXing,LIZhigang,LIUGuibo,XUZhipeng,ZHANGJifei

(1MudanjiangMedicalCollege,Mudanjiang157011,China)

ObjectiveTo observe the effect of KLF7 and adipose-derived stem cell (ADSC) on motor function after spinal cord injury (SCI) in rats, and to probe the possible mechanism.MethodsThirty healthy SD rats were randomly divided into the KLF7+ADSC group, ADSC group, and control group, with 10 in each. SCI models were prepared by the method of transection of right half spinal cord. The 100 μL ADSC (ADSC labeled with PKH26) and 2 μL AAV2-KLF7 were injected into the SCI tissues in the KLF7+ADSC group, 100 μL ADSC was injected in the ADSC group, and 100 μL PBS was injected in the control group. At 1 day and 1, 2, 3, 4 weeks after operation, BBB was used to evaluate rats′ double lower limb functional recovery in each group. At week 4 after the operation, evoked electrophysiological responses were evoked by evoke potential instrument and tcMMEP, and the nerve conduction velocity, latency and amplitude were recorded. The rats were killed at 4 weeks after the operation, KLF7, NGF and TrkA protein in the SCI tissues were evaluated by Western blotting. The lesion area percentage of SCI and the number of ADSC were evaluated (the number of ADSC was represented by the light density value of PKH26).ResultsThe BBB scores increased at 1, 2, 3 and 4 weeks after operation as compared with that at 1 day after operation in each group (P<0.05). At 4 weeks after operation, compared with the control group, BBB score, nerve conduction velocity, amplitude, the number of ADSC, NGF and TrkA protein expression in the SCI tissues increased in the KLF7+ADSC group and ADSC group, however, the latency and the percentage of lesion area decreased, moreover, the effect of KLF7+ADSC group was more significant than that of the ADSC group (P<0.05). KLF7 relative protein expression in the SCI tissues in the KLF7+ADSC group was higher than that of the ADSC group and control group (allP<0.05).ConclusionKLF7 combined with ADSC could improve the motor function and alleviate the nerve damage, and the mechanism may be that KLF7 promotes ADSC survival and up-regulates NGF and TrkA expression in the lesion area.

spinal cord injury; KLF-like transcription factor 7; adipose-derived stem cells; nerve growth factor; tyrosine kinase A; rats

國家自然科學(xué)基金資助項目(81371362)；黑龍江省科學(xué)基金資助項目(LC2017040)；黑龍江省衛(wèi)生廳科研課題(2016-357)。

李文媛(1980-)，女，副教授，研究方向為腫瘤淋巴管的生成機(jī)制。E-mail: yuanyuan19800413@163.com

王瑩(1977-)，男，副教授，研究方向為腫瘤淋巴管的生成機(jī)制。E-mail: Yingwang770224@163.com

10.3969/j.issn.1002-266X.2017.44.002

R496

A

1002-266X(2017)44-0005-04

2016-11-23)