類風濕性關節(jié)炎瓜氨酸化反應研究的最新進展

類風濕性關節(jié)炎瓜氨酸化反應研究的最新進展

常曉天鄭亞冰

(山東大學附屬千佛山醫(yī)院醫(yī)學研究中心,濟南250014)

類風濕性關節(jié)炎 (Rheumatoid arthritis,RA) 是一種以慢性侵蝕性關節(jié)炎為特征的全身性自身免疫疾病。該病在我國發(fā)病率約3‰~5‰。RA患者體內(nèi)可以檢測到多種抗瓜氨酸化蛋白的自我免疫抗體(Anti-citrullinated peptide antibodies,ACPA)，包括抗角蛋白抗體(Anti-keratin antibody,AKA)、抗環(huán)瓜氨酸肽抗體(Anti-cyclic citrullinated peptide antibody,anti-CCP)、抗纖維蛋白原抗體(Anti-fibrinogen antibody,ACF)、抗波形蛋白抗體(Anti-vimentin antibody,anti-MCV)等[1-3]。該類抗體所針對的靶抗原均含有瓜氨酸表位，對RA具有高度的特異性，并且與疾病的嚴重程度密切相關。瓜氨酸是一種非編碼氨基酸，在肽酰精氨酸脫亞胺酶(Peptidyl deiminase，PAD)的催化下，蛋白中的精氨酸殘基轉(zhuǎn)化成瓜氨酸殘基，這一過程稱為蛋白的瓜氨酸化。瓜氨酸化是蛋白翻譯后修飾的一種形式。蛋白質(zhì)的瓜氨酸化現(xiàn)象可見于許多疾病，如感染、炎癥、腫瘤及自身免疫性疾病等[4，5]。PAD的表達及瓜氨酸反應在RA患者滑膜組織中高表達，PAD家族的PADI4基因多態(tài)性與RA呈明顯相關性，且與ACPA抗體水平具有相關性，但是這種相關性具有一定的種族差異[6，7]。因此，瓜氨酸化反應和PAD在RA發(fā)病過程中起著非常重要的作用，一直是RA發(fā)病機制研究中的熱點。本文將重點介紹、討論近年來有關RA瓜氨酸化研究的進展、發(fā)展趨勢以及作者對該研究的理解和建議。

1篩選新瓜氨酸化蛋白的研究

到目前為止，研究已發(fā)現(xiàn)了一些RA的瓜氨酸化蛋白，諸如纖維蛋白原(Fibrinogen)、纖維連接蛋白(Fibronectin)、波形蛋白(Vementin)。但鑒于瓜氨酸化反應在RA發(fā)病過程中的重要作用和代謝通路的復雜性，PAD的作用底物應該不止這幾種。隨著分子生物學技術的進步，近年來，有更多的瓜氨酸化蛋白及自我免疫抗體在RA患者的滑膜、滑液和血液中被發(fā)現(xiàn)。Gro?b等[8]用110位早期RA患者的血液為探針對HL60細胞的蛋白進行了免疫印跡(Western blot)實驗，然后用蛋白質(zhì)組學的方法對雜交信號進行了鑒定，發(fā)現(xiàn)遠端上游元件結(jié)合蛋白1和2[far upstream element-binding proteins (FUSE-BP) 1 and 2]被瓜氨酸化。我們用抗角蛋白抗體AE1/AE3(一種廣譜的抗細胞角質(zhì)蛋白抗體)和抗瓜氨酸抗體進行了免疫組化和免疫印跡實驗，發(fā)現(xiàn)RA滑膜中有角質(zhì)蛋白(Cytokeratin)表達并被瓜氨酸化[9]。Sawada等[10]在RA滑液中發(fā)現(xiàn)了瓜氨酸化的抗原C1q-binding and monoclonal rheumatoid factor (mRF)-binding peptides。最近，我們以RA患者血液為抗體對RA滑膜組織進行了的二維免疫印跡(2D-Western blot)研究，經(jīng)質(zhì)譜鑒定和免疫共沉淀分析發(fā)現(xiàn)α-1抗胰蛋白酶(A1AT)、細胞角質(zhì)蛋白84(KRT84)和微管蛋白B(TUBB)在滑膜中高表達并發(fā)生瓜氨酸化修飾，而且我們在RA患者的血液中也檢測到高水平的抗KRT84抗體[11]。van Beers等[12]用蛋白質(zhì)組學方法在RA滑液中檢測出瓜氨酸化蛋白載脂蛋白E(Apolipoprotein E)、髓核分化抗原(Myeloid nuclear differentiation antigen)和β-肌動蛋白(β-actin)。同時發(fā)現(xiàn)細胞表面的糖調(diào)節(jié)蛋白78(Grp78)可能也是ACPA抗原之一，因為他們發(fā)現(xiàn)谷胱苷肽S-轉(zhuǎn)移酶標記的重組Grp78(Glutathione S-transferase-tagged recombinant Grp78)瓜氨酸化之后可結(jié)合ACPA[12]。Lu等[13]用環(huán)裝瓜氨酸化肽結(jié)合親和柱(cyclic citrullinated peptide-conjugated affinity column)從RA血液中純化了ACPA，然后用將ACPA 加入到U937 細胞(人系髓樣白血病細胞系)培養(yǎng)液中。他們發(fā)現(xiàn)ACPA 可以增加細胞腫瘤壞死因子(TNF-α)的表達水平和增強NF-κB對DNA的結(jié)合能力。隨著研究的深入和研究手段的進步，應該有更多的與RA有關的瓜氨酸化蛋白被發(fā)現(xiàn)，為揭示瓜氨酸化反應對RA的作用提供了依據(jù)。

2瓜氨酸化反應對RA骨破壞作用的研究

ACPA在RA中特異表達并且與RA病情發(fā)展密切相關,但ACPA的作用機制并不很清楚。相比在腫瘤研究領域的進展[14]，RA瓜氨酸化修飾的意義和PAD功能的研究進展并不是很快。自我免疫反應是RA中發(fā)生骨破壞的重要因素。Harre等[15]研究發(fā)現(xiàn)ACPA與破骨細胞(Osteoclast)調(diào)節(jié)的骨破壞密切相關，破骨細胞分化過程中波形蛋白(Vimentin)的N端發(fā)生瓜氨酸化。純化的抗瓜氨酸化變異波形蛋白(Mutated citrullinated vimentin，MCV)抗體不僅可以結(jié)合到破骨細胞表面，而且可以刺激破骨過程和骨的吸收，因此RA anti-vimentin自我免疫抗體的形成會直接誘導骨破壞。另外，在RA滑液中檢測到整合素樣金屬蛋白酶(ADAMTS4)高表達，ADAMTS4也是導致軟骨降解的一個重要的酶，參與骨的降解[16]。ADAMTS4在其蛋白C端可與纖維連接蛋白(Fibronectin)結(jié)合，結(jié)合后其酶活性受到Fibronectin的抑制[17]。我們前期工作證明，在RA滑膜中有大量的瓜氨酸化的Fibronectin[18]。瓜氨酸化后的Fibronectin失去了對ADAMTS4調(diào)控和抑制功能，ADAMTS4活性因此得以增強而導致骨降解加速[19]。Shelef等[20]研究了瓜氨酸化修飾的Fibronectin 對滑膜成纖維狀細胞(Fibroblast)的作用。他們用瓜氨酸化的Fibronectin培養(yǎng)了正常鼠、關節(jié)炎鼠和RA患者的Fibroblasts細胞，發(fā)現(xiàn)瓜氨酸的Fibronectin可以改變fibroblast細胞轉(zhuǎn)移和侵入行為，因此細胞外介質(zhì)的瓜氨酸化是RA病變過程的一個重要步驟[20]。

3瓜氨酸化反應參與RA炎癥機制的研究

瓜氨酸化后的蛋白可轉(zhuǎn)變成新的免疫原，進而刺激RA的自我免疫反應，但對其具體機制了解不多。TNF-α是免疫炎性因子調(diào)控網(wǎng)絡中的關鍵因子，高水平的TNF-α可導致RA患者發(fā)生炎癥反應，進而導致組織破壞。因此，TNF-α是RA生物制劑諸如益賽普、阿達木等用來治療RA的靶點[21]。Sokolove等[22]發(fā)現(xiàn)瓜氨酸化的纖連蛋白(Fibronogen)更能刺激巨噬細胞表達TNF-α，而且該過程依賴于Toll樣受體4/髓樣分化蛋白[Toll-like receptor 4 (TLR-4)/myeloid differentiation protein (MyD88)]。Van Steendam等[23]發(fā)現(xiàn)瓜氨酸化蛋白可以刺激IFN-γ分泌細胞和IL-17分泌細胞增殖。他們認為瓜氨酸化依賴的(Citrulline-dependent)T細胞反應不是RA特有，但RA中高表達瓜氨酸化會打破免疫平衡，從而開啟自我免疫。TNF-α本身也可以被瓜氨酸化。Moelants等[24]用PAD體外處理白介素1β(IL-1β) 和TNF-α，發(fā)現(xiàn)TNF-α可以被瓜氨酸化,而IL-1β不行。TNF-α 瓜氨酸化后降低了刺激人Fibroblasts制造趨化因子(chemokine)的能力，但具有維持誘導單核細胞凋亡和壞死的能力[24]。Sanchez-Pernaute等[25]用全基因組表達芯片(Whole-genome-based gene expression array)檢測纖維蛋白(Fibrin)刺激后RA滑膜成纖維細胞(RASF)的全轉(zhuǎn)錄組表達狀況。他們發(fā)現(xiàn)與未修飾的Fibrin相比，用PADI2體外瓜氨酸化Fibrin后，更能刺激RASF促炎性細胞因子(Pro-inflammatory cytokines)的表達，而且Fibrin 調(diào)節(jié)的炎癥反應是通過 TLR4 通路進行的。

4牙周病與RA相關性的研究

人們很早就開始認為牙周病和RA之間存在某種聯(lián)系。近年研究越來越多地發(fā)現(xiàn)牙周炎(Periodontitis)和RA發(fā)病密切相關。二者在病理上都表現(xiàn)為慢性炎癥、骨損傷、軟組織損傷，并顯示有相似的免疫反應和免疫遺傳機制[26-31]。一項關聯(lián)分析結(jié)果表明，RA和牙周炎的相對危險度(Odds ratios)在1.8∶1(95%CI:1.0~3.2)到8∶1 (95%CI:2.9~22.1,P<0.001)變化范圍內(nèi)[31]。牙周炎的重要病原細菌是牙齦卟啉單胞菌(Porphyromonas gingivalis，P.gingivalis)，P gingivalis是口腔菌叢的重要細菌之一，而P gingivalis細菌恰恰含有PAD，可以對肽鏈進行瓜氨酸化修飾，而其他的口腔細菌沒有瓜氨酸化反應能力。研究還發(fā)現(xiàn)，野生型的P.gingivalis可以瓜氨酸化Fibrinogen 和α-烯醇化酶(α-enolase)[32,33]。Abdullah等[34]報道，P.gingivalis 的PAD存在于P gingivalis細胞表面上,并表現(xiàn)出熱穩(wěn)定和堿條件下穩(wěn)定，顯示P.gingivalis 中PAD在炎癥條件下也應當保持其瓜氨酸化能力。Okada等[35]觀察發(fā)現(xiàn)一旦治療牙周炎后患者體內(nèi)抗P.gingivalis抗體降低，RA病情也隨之減輕。更有趣的是，清除口腔牙齦的生物沉淀后RA癥狀也隨之緩解[36]。有人在牙周炎的齦溝液(Gingival crevicular fluid)中發(fā)現(xiàn)P.gingivalis，并檢測到ACPA的存在[37]。Nesse等[38]也在牙周炎基質(zhì)(Stroma)和牙周炎表皮(Epithelium periodontitis)上檢測到和RA滑膜組織一樣的大量瓜氨酸化蛋白存在。上述結(jié)果表明，P.gingivalis 因為其具有表達PAD及瓜氨酸化能力，參與RA的自我免疫進程，這也是為什么牙周炎和RA有密切關系的原因[39]。但是，Marchant等[40]認為細胞內(nèi)源的PAD表達水平不受外源P.gingivalis影響，外源P.gingivalis 可能只催化細胞外介質(zhì)的瓜氨酸化。

5對RA瓜氨酸化研究的建議

以上是近年來關于RA瓜氨酸化反應研究的一些最新進展，顯示了該領域的研究有了很大的發(fā)展?；趯Ρ狙芯款I域的經(jīng)驗和認識，本文作者對今后RA瓜氨酸化反應的研究有如下建議：

5.1繼續(xù)篩選新的RA瓜氨酸化蛋白，探索還有哪些瓜氨酸化蛋白對RA起重要作用到目前為止，已在RA滑膜中發(fā)現(xiàn)許多瓜氨酸化反應的靶點，但這些瓜氨酸化蛋白大都是中豐度蛋白，而且多為結(jié)構(gòu)蛋白，很少有代謝通路的蛋白。這些瓜氨酸化蛋白雖然豐度低，但可能在RA調(diào)控路徑中扮演十分重要的角色。所以，應該繼續(xù)尋找可能的瓜氨酸化調(diào)控蛋白，并深入探索其對RA的作用。隨著分子生物學技術的進步應該會有更多新的發(fā)現(xiàn)。Okazaki等在此方面進行過嘗試，他們首先用PADI4瓜氨酸化的人軟骨細胞cDNA表達庫(human chondrocyte cDNA expression library)，然后用抗瓜氨酸化抗體(anti-modified citrulline antibody)和RA患者血清去免疫雜交。結(jié)果，他們篩選到真核轉(zhuǎn)錄起始因子(Eukaryotic translation initiation factor 4G1，eIF4G1)的表達。他們的研究證明，50%的RA患者的血清中含有anti-eIF4G1抗體，而且抗體表達水平與anti-CCP 水平密切相關[41]。我們最近用2D-Western blot聯(lián)合蛋白質(zhì)組學方法也發(fā)現(xiàn)了數(shù)個新的瓜氨酸化蛋白，包括瓜氨酸化的A1AT、KRT84和TUBB[11]。我們首先用2D電泳對RA滑膜組織進行蛋白處理，獲得兩張一樣的凝膠電泳，然后把其中一張按Western blot方法轉(zhuǎn)到PVDF膜上。我們用RA患者血液對這張PVDF膜雜交，將得到的免疫信號圖案與原始的凝膠電泳蛋白譜作對照，選出有雜交信號的蛋白點做質(zhì)譜鑒定。我們當時用的7 cm的凝膠電泳。如果用規(guī)格更大的凝膠應當獲得更多的低豐度RA瓜氨酸化蛋白。

5.2繼續(xù)探索瓜氨酸化反應對RA的作用機制，分析瓜氨酸化反應如何刺激RA雖然瓜酸化反應一直是研究RA的熱點，但有關其對RA的作用機制研究不多，而近年PADI4及其瓜氨酸化對腫瘤發(fā)病作用的研究很多。RA和腫瘤組織病理有很多相似之處。他山之石可以攻玉，腫瘤PADI4及其瓜氨酸化作用的研究可以開拓我們的思路。Guo等[42]用高密度蛋白芯片(High-density protein array)尋找新的PADI4底物，發(fā)現(xiàn)了40余個潛在的PAD底物，其中包括40S ribosomal protein S2 (RPS2)。而且該研究發(fā)現(xiàn)RPS2瓜氨酸化的位置恰好也是蛋白精氨酸轉(zhuǎn)甲基化酶(Protein arginine methyltransferase 3，PRMT3)甲基化的位置。這種瓜氨酸化和甲基化相互拮抗而調(diào)控信號通路的現(xiàn)象在腫瘤細胞中也發(fā)現(xiàn)過[43,44]，有異曲同工之妙。

5.3以瓜氨酸化反應為靶點研發(fā)RA檢測試劑和治療藥物anti-CCP是很好的RA檢測試劑，但其抗原蛋白為人工的含瓜氨酸的環(huán)裝蛋白，那么anti-CCP在RA抗原中是哪種蛋白、一種還是一組不得而知。近年，抗波形蛋白已開始成為檢測RA的指標。因此，應該還有類似的瓜氨酸化蛋白可開發(fā)成RA的檢測試劑。還有，既然瓜氨酸化反應在RA發(fā)病中起著主導作用，為什么不以瓜氨酸化反應為靶點，通過抑制瓜氨酸化反應治療RA。腫瘤研究方面也已嘗試開發(fā)抗PAD的靶向藥物[45,46]。Willis等[47]用PAD的抑制藥物N-α-benzoyl-N5-(2-chloro-1-iminoethyl)-L-ornithine amide (Cl-amidine)處理膠原誘導關節(jié)炎(collagen-induced arthritis，CIA)鼠，檢測Cl-amidine對關節(jié)炎的治療作用。他們發(fā)現(xiàn)Cl-amidine可以有效地降低CIA鼠關節(jié)和血清中的瓜氨酸化水平、抗IgG2a anti-mouse type Ⅱcollagen抗體水平、炎癥指數(shù)、C3補體沉淀和炎癥指數(shù)。所以Cl-amidine可能通過抑制瓜氨酸化而抑制RA進程。Cl-amidine可能是潛在的治療RA藥物。

5.4確認RA瓜氨酸化反應的主導者(到底是PADI2還是PADI4，還是二者都參與了RA催化的瓜氨酸化反應)PAD家族共有5位PAD成員。在這5位PAD成員中，PADI4被證明與RA明顯相關，是RA的易感基因。但是，早在十幾年前，Vossenaar等[48]就分析了4種PAD在RA外周血和關節(jié)滑液細胞中的表達。他們在外周血單核細胞中檢測到了PADI2 和 PADI4 mRNA，同時也從RA滑液中檢測到了PADI2 和瓜氨酸化蛋白。Vossenaar[49]后來也在CIA鼠關節(jié)滑膜組織中檢測到PADI2 mRNA，但沒有檢測到PADI2 蛋白表達，同時在侵入炎癥關節(jié)的中性粒細胞中檢測到PADI4 mRNA及其酶蛋白。他們也在人RA滑膜組織和滑液中檢測到PADI4蛋白表達[50,51]。Foulquier等[52]報道在RA滑膜組織中檢測到PADI2和PADI4，而且炎癥細胞是PAD的主要來源。他們認為PADI2和PADI4都參與到對纖維蛋白Fibrin的瓜氨酸化過程中。我們最近用custom-designed Illumina 96-SNP VeraCode microarray和Sequenom MassARRAY方法分別對267個RA患者和307個RA患者PADI2基因的17個tagSNP進行基因分型，發(fā)現(xiàn)rs2235926和rs2057094與PADI2強相關，PADI2是RA易感基因。我們也在RA滑膜中檢測到PADI2蛋白的表達[53]。以上數(shù)據(jù)顯示，PADI2和 PADI4 都在RA滑膜中表達并可能參與RA的瓜氨酸化。盡管很多研究證明PADI4是RA易感基因并在RA病變關節(jié)組織中表達，但無法否認PADI2 甚至 PAD 其他成員也參與了RA病理進程。Darrah等[54]發(fā)現(xiàn)PAD有選擇地催化不同的瓜氨酸化底物，PADI2修飾β/γ-actin,PADI4修飾組蛋白H3。他們建議PAD 對底物的特異性可能使RA產(chǎn)生不同自我免疫原[54]。Nakayama-Hamada等[55]用質(zhì)譜發(fā)現(xiàn)，PADI2和PADI4對纖維蛋白原瓜氨酸化方式不一樣，也說明PADI2和PADI4在瓜氨酸化過程中有不同作用。

綜上所述，PAD和瓜氨酸化對包括RA在內(nèi)的諸多疾病起著重要作用。瓜氨酸化可能和乙?；⑻腔?、甲基化、泛素化等蛋白翻譯后修飾一樣在代謝和基因調(diào)控中起著重要作用。有關PAD和瓜氨酸研究可能剛剛開始，今后會有更多的研究去探索PAD和瓜氨酸化調(diào)控機制、病理作用及對其藥物的研發(fā)。

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[收稿2015-03-25修回2015-04-09]

(編輯倪鵬)

作者簡介：常曉天(1964年-)，男，博士，研究員，博士生導師，主要從事類風濕性關節(jié)炎致病機制方面的研究，E-mail:chang-xt@163.com。

中圖分類號R392.1

文獻標志碼A

文章編號1000-484X(2016)02-0279-05

doi:10.3969/j.issn.1000-484X.2016.02.031