雙氰基熒光染料的合成、光學(xué)性質(zhì)及其生物成像

李龍龍， 趙 寧*， 李 冰， 彭 丹， 周寧寧， 劉世新

(1. 山東省科學(xué)院新材料研究所 山東省特種含硅新材料重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室， 山東 濟(jì)南 250014；2. 山東省計量科學(xué)研究院， 山東 濟(jì)南 250014； 3. 山東省標(biāo)準(zhǔn)化研究院， 山東 濟(jì)南 250014)

雙氰基熒光染料的合成、光學(xué)性質(zhì)及其生物成像

李龍龍1， 趙 寧1*， 李 冰1， 彭 丹1， 周寧寧2， 劉世新3

(1. 山東省科學(xué)院新材料研究所 山東省特種含硅新材料重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室， 山東 濟(jì)南 250014；2. 山東省計量科學(xué)研究院， 山東 濟(jì)南 250014； 3. 山東省標(biāo)準(zhǔn)化研究院， 山東 濟(jì)南 250014)

設(shè)計合成了一種A-π-D-π-A型的雙光子熒光染料3,6-雙(4-乙烯基苯腈)-9-乙基咔唑，測試了其在二氯甲烷(DCM)、乙酸乙酯(EA)、乙醇(EtOH)、乙腈(ACN)、二甲亞砜(DMSO)和磷酸緩沖鹽溶液(PBS)等不同溶劑中的紫外吸收光譜、單光子及雙光子熒光光譜?；衔?,6-雙(4-乙烯基苯腈)-9-乙基咔唑在紫外吸收光譜中存在兩個相似的特征吸收帶并呈現(xiàn)出復(fù)雜的溶劑化效應(yīng)，在DMSO中具有最大熒光量子產(chǎn)率(86.02%)，其相應(yīng)的活性吸收截面為12.56 GM。在雙光子熒光成像方面，染料分子具有優(yōu)良的細(xì)胞膜通透性并且在雙光子熒光顯微鏡下呈現(xiàn)出明亮的綠色熒光，表現(xiàn)出較好的雙光子熒光成像性能。這些數(shù)據(jù)表明，化合物3,6-雙(4-乙烯基苯腈)-9-乙基咔唑可用作一種較為理想的雙光子熒光標(biāo)記染料。

雙光子熒光染料； 紫外吸收； 量子產(chǎn)率； 活性吸收截面； 細(xì)胞成像

1 引 言

近年來，有機(jī)雙光子吸收材料在熒光顯微成像[1-2]、三維光存儲[3-4]、微細(xì)加工[5-7]、上轉(zhuǎn)換熒光[8]、光限幅[9]、光動力學(xué)治療[10-11]和生物活種定位釋放[12]等諸多領(lǐng)域越來越受到重視，尤其是在雙光子熒光顯微和成像中的應(yīng)用得到了廣泛的關(guān)注[13-18]。雙光子熒光顯微成像兼具諸如近紅外激發(fā)、暗場成像、避免熒光漂白和光致毒、定靶激發(fā)、高分辨率、降低生物組織吸光系數(shù)及自發(fā)熒光干擾等特點(diǎn)而顯著地優(yōu)于單光子熒光顯微成像，因此雙光子熒光染料的設(shè)計與合成逐漸成為當(dāng)前研究的焦點(diǎn)。

咔唑類化合物的分子剛性強(qiáng)，共軛平面大，適當(dāng)修飾后具有較好的雙光子熒光性能，在雙光子甚至多光子激發(fā)熒光生物標(biāo)記和無損光動力學(xué)治療領(lǐng)域具有潛在的應(yīng)用價值[19]。氰基作為強(qiáng)的吸電子基團(tuán),其π軌道能與芳香環(huán)的大π電子交蓋，進(jìn)一步拓寬π共軛體系，增加分子的平面剛性，從而進(jìn)一步增強(qiáng)雙光子熒光性能。Thomas[20]和Wang[21]分別報道了一系列含氰基的咔唑類化合物，但只簡單測試了化合物在不同溶劑中的紫外吸收和單光子熒光性能，均未進(jìn)一步闡述其在生物細(xì)胞成像方面的應(yīng)用。因此，考慮到水溶性、相對較好的吸收截面和量子產(chǎn)率以及在生理環(huán)境下的實(shí)用性，我們合成了一種以咔唑?yàn)槟阁w的在末端帶有雙氰基發(fā)色團(tuán)的新型雙光子染料3,6-雙(4-乙烯基苯腈)-9-乙基咔唑，并且對其在不同溶劑下的紫外吸收、單光子熒光光譜、雙光子熒光光譜及其生物成像性能進(jìn)行了系統(tǒng)研究，為更進(jìn)一步拓寬探針分子在生物成像上的應(yīng)用奠定了理論基礎(chǔ)。

2 實(shí) 驗(yàn)

2.1儀器和試劑

咔唑、(4-氰基芐基)亞磷酸二乙酯、叔丁醇鉀、三氯氧磷、N, N-二甲基甲酰胺、四氫呋喃、二氯甲烷、氫氧化鉀、氫氧化鈉、硫酸鎂等所用試劑和溶劑均為AR，各試劑使用前均經(jīng)無水精制。紫外可見吸收光譜在HITACHI U-2910光譜儀上測得。單光子發(fā)射光譜在 HITACHI F-2700熒光光譜儀獲得，用450W的氙燈為光源，熒光收集為側(cè)面收集方式，半導(dǎo)體制冷的光電倍增管(PMT)為探測器。雙光子熒光采用 Ti∶Sapphire Mira900-F 飛秒激光器所發(fā)出的脈沖激光作為激發(fā)光源，其重復(fù)頻率為76MHz，脈沖寬度為200fs，采用SpectroPro300i光譜儀作記錄。雙光子熒光細(xì)胞成像圖片在Zeiss LSM(Laser Scaning Microscopy德國)510上獲得。

2.2染料的合成

雙光子染料3,6-雙(4-乙烯基苯腈)-9-乙基咔唑的合成路線如圖1所示。

圖1 染料分子的合成路線

2.2.19-乙基咔唑的合成

室溫下，將氫氧化鉀28g (500mmol)溶解在60mL的丙酮中，攪拌反應(yīng)30min。將咔唑13.2g (80mmol)加入到上述反應(yīng)液中，繼續(xù)攪拌反應(yīng)4h。將溴乙烷120mmol 緩慢滴加到上述反應(yīng)液中，攪拌反應(yīng)過夜。將反應(yīng)液倒入200mL的冰水中，有黃色沉淀析出，過濾，乙醇重結(jié)晶得到白色針狀產(chǎn)品8.2g，產(chǎn)率52.6%。1H NMR(400MHz)δ：8.11(d,J=7.2Hz,2H),7.48～7.41(m,4H),7.24(d,J=9.2Hz,2H),4.38(d,J=6.8Hz,2H),1.52～1.42(m,3H)。

2.2.23,6-二甲?；?9-乙基咔唑的合成

將22mL (0.3mol)DMF加入到250mL的三口瓶中，降溫至0℃。將三氯氧磷28mL (0.3mol)逐滴加入到上述反應(yīng)液中，攪拌30min，待有白色沉淀生成后將溶解在20mL DMF中的3.15g (16mmol)N-乙基咔唑加入到反應(yīng)液中，升溫至100℃，攪拌反應(yīng)30h后冷卻至室溫。將反應(yīng)液倒入200mL的冰水中，用氫氧化鈉調(diào)節(jié)pH至8，二氯甲烷萃取，硫酸鎂干燥，硅膠擔(dān)載柱分離，得淡黃色固體2.1g， 產(chǎn)率52.3%。1H NMR(400MHz)δ：10.11(s,2H)，8.92(s，2H)，8.08(d，J=8.0Hz，2H)，7.91(d，J=8.0Hz，2H)，4.59(d，J=6.4Hz，2H)，1.37(s，3H)。

2.2.33,6-雙(4-乙烯基苯腈)-9-乙基咔唑的合成

在無水無氧的條件下，取1.0g (3.98mmol)3,6-二甲酰基-9-乙基咔唑及(4-氰基芐基)亞磷酸二乙酯2.5g (9.88mmol)置于50mL的三口瓶中， 加入20mL的無水THF溶解。然后，將1.6g叔丁醇鉀溶解在10mL 無水THF中，緩慢滴加到上述反應(yīng)液中，室溫下攪拌反應(yīng)24h。將反應(yīng)液倒入100mL水中，乙酸乙酯萃取，硫酸鎂干燥，硅膠擔(dān)載柱分離，得黃綠色固體1.2g， 產(chǎn)率67.2%。1H NMR(400MHz)δ：8.48(s，2H)，7.81～7.86(m，10H)，7.66(t,J=9.2Hz，4H)，7.38(d，J=16.4Hz，2H)，4.47(d，J=6.8Hz，2H)，1.35(t，J=6.4Hz，3H)。

3 結(jié)果與討論

3.1紫外吸收光譜

圖2為染料在二氯甲烷(DCM)、乙酸乙酯(EA)、乙醇(EtOH)、乙腈(ACN)、二甲亞砜(DMSO) 和磷酸緩沖鹽溶液(PBS) 等不同溶劑中的紫外吸收光譜。由圖2可知，染料在不同溶劑中的紫外吸收都同時呈現(xiàn)出兩個相似的特征吸收帶。首先在330nm左右的吸收，可能源于探針分子中的取代咔唑通過雙鍵與苯環(huán)相連形成的共軛大π 鍵，在光的照射下所產(chǎn)生的π→π*躍遷；而在390nm左右的吸收帶，則源于氰基氮原子上的孤電子對與苯環(huán)π電子共軛形成的n→π*躍遷。

圖2 染料在不同溶劑中的紫外吸收光譜

Fig.2UV-Vis absorption spectra of the dye in different solvents

表1 染料在不同溶劑中的光譜數(shù)據(jù)

3.2 單光子熒光光譜

在不同溶劑中，染料熒光量子產(chǎn)率(Ф)的計算是以熒光素(Ф=0.95，pH=13)水溶液為參比測定并通過公式(1)計算:

(1)

圖3 染料在不同溶劑中的單光子熒光光譜

Fig.3 Single-photon fluorescent spectra of the dye in different solvents

3.3 雙光子熒光光譜

雙光子吸收截面采用雙光子誘導(dǎo)熒光法來測量，如公式(2)所示：

(2)

圖4為染料在DCM、EA、EtOH、ACN、DMSO和PBS等不同溶劑中的雙光子熒光光譜。由圖4可以看出，染料在不同溶劑中的雙光子熒光峰與單光子熒光峰相比略微紅移，這種紅移現(xiàn)象可以用再吸收效應(yīng)解釋。由于染料分子的線性吸收峰的長波段區(qū)域與發(fā)射光譜短波段區(qū)域的重疊，染料在該區(qū)域發(fā)射的熒光有一部分會被它自身的基態(tài)分子所吸收，使其雙光子熒光的最大吸收峰發(fā)生紅移。另一方面，染料在DCM、EA、EtOH 和ACN中的活性吸收截面分別為4.62，3.69，6.10，5.88 GM，水相PBS中的雙光子熒光強(qiáng)度最低，其活性吸收截面只有0.86 GM；而在DMSO中染料分子具有最強(qiáng)的雙光子熒光，相應(yīng)的活性吸收截面約為在水相PBS中的15倍，達(dá)到12.56 GM。

圖4 染料在不同溶劑中的雙光子熒光光譜

Fig.4 Two-photon fluorescent spectra of the dye in different solvents

3.4 雙光子熒光成像

3.4.1 活細(xì)胞的培養(yǎng)

首先將HeLa細(xì)胞注入到含有雙抗(青霉素和鏈霉素)和10% 的小牛血清的伊格爾培養(yǎng)基(Eagle minimal essential medium)中，然后置于含有5% CO2的恒溫(37 ℃)細(xì)胞培養(yǎng)箱中培養(yǎng)。當(dāng)HeLa細(xì)胞在培養(yǎng)瓶中生長到對數(shù)期，再接片培養(yǎng)：用鉻酸洗液浸泡蓋玻片0.5 h，再用清水、超純水沖洗3遍后，烘干，滅菌后放到無菌一次性培養(yǎng)皿中。將培養(yǎng)瓶中的培養(yǎng)液倒出后，細(xì)胞用PBS緩沖液沖洗3遍，再用1 mL濃度為0.25%的胰酶消化3 min，倒掉胰酶溶液，再加入少量培養(yǎng)基溶液，然后用移液槍鼓氣吹打均勻，細(xì)胞計數(shù)，留取適當(dāng)密度的細(xì)胞后，加入培養(yǎng)基，再次吹打均勻，然后將細(xì)胞加入到提前準(zhǔn)備好的含有載玻片的培養(yǎng)皿中，把接種好的培養(yǎng)皿放到細(xì)胞培養(yǎng)箱中，待其貼壁生長。在CO2恒溫細(xì)胞培養(yǎng)箱中培養(yǎng)12～36 h，待細(xì)胞密度達(dá)到50%～70%，即可用于細(xì)胞染色實(shí)驗(yàn)。

3.4.2 細(xì)胞的固定與染色

將準(zhǔn)備好的活細(xì)胞用4%的多聚甲醛溶液浸泡0.5 h， 然后在室溫下用0.5% Triton X-100溶液再處理2～3 min，將細(xì)胞固定。

先將染料配成1 mmol/L的DMSO母液，用5 μmol染料染色HeLa細(xì)胞在恒溫細(xì)胞培養(yǎng)箱中孵育30 min，然后用 D-Hans 溶液洗去未進(jìn)入細(xì)胞的多余的染料溶液， 再加入幾滴 PBS 溶液， 把載玻片的細(xì)胞生長面朝下蓋在培養(yǎng)皿的底片上，即可將培養(yǎng)皿放到熒光顯微鏡上進(jìn)行熒光成像。

3.4.3 細(xì)胞活性實(shí)驗(yàn)

首先采用細(xì)胞計數(shù)板來檢測細(xì)胞濃度，滴一滴細(xì)胞培養(yǎng)液到含有4塊16格1 mm×1 mm的大方格的計數(shù)板上，數(shù)一下每個方格上的細(xì)胞個數(shù)，取平均值n(細(xì)胞濃度為n/mm3)。將細(xì)胞的濃度控制在5 000～50 000個/mm3，然后對細(xì)胞培養(yǎng)液進(jìn)行稀釋，再放入96孔板培養(yǎng)。待96孔板中的細(xì)胞生長1 d后，分別在2，8，12，24 h時在孔板中加入5 mol的染料3,6-雙(4-乙烯基苯腈)-9-乙基咔唑，然后在孔板中加入20 mL濃度為5 μmg/mL的3-(4,5-二甲基噻唑-2)-2,5-二苯基四氮唑溴鹽商品名噻唑藍(lán)，再繼續(xù)培養(yǎng)4 h。依次把孔板內(nèi)的培養(yǎng)液吸去，再向每個空格中分別加入150 mL DMSO，將孔板放到搖床上低速振蕩使結(jié)晶物得到充分的溶解。最后在酶標(biāo)儀上讀取各孔的吸光值(OD 490 nm)進(jìn)行計算。對照孔(培養(yǎng)液、細(xì)胞、濃度相同的藥物溶解介質(zhì)、二甲基亞砜和MTT)調(diào)零孔( 二甲基亞砜、培養(yǎng)基和MTT)。

染料的細(xì)胞毒性也是不容忽略的一個重要參數(shù)，染料的細(xì)胞毒性在HeLa細(xì)胞上用MTT實(shí)驗(yàn)測得。細(xì)胞毒性實(shí)驗(yàn)結(jié)果由表2可以看出：在染色2 h以內(nèi)，HeLa細(xì)胞的存活率為89%左右，隨著孵育染色時間的增長，細(xì)胞的存活率也在下降，24 h時細(xì)胞的存活率為51%。所以當(dāng)染色濃度為5 μmol/L、染色時間為30 min 時，可以認(rèn)為染料對細(xì)胞沒有明顯毒性。

表2 染料毒性實(shí)驗(yàn)數(shù)據(jù)

aCell viability was quantified by the MTT assay (mean±SD)

3.4.4 細(xì)胞成像

為了進(jìn)一步研究染料在細(xì)胞中的成像能力，我們對活的Hela細(xì)胞進(jìn)行了嚴(yán)格的染色試驗(yàn)，并利用雙光子激光掃描顯微鏡進(jìn)行了熒光成像。如圖5所示，(a)為染料在細(xì)胞內(nèi)的熒光成像，(b)是細(xì)胞的微分干涉(DIC)成像，(c)為(a)和(b)的疊加圖像。結(jié)果表明，染料能很好地穿透活Hela細(xì)胞的胞膜進(jìn)入細(xì)胞，從而使細(xì)胞質(zhì)呈現(xiàn)出明亮的綠色熒光，證明染料具有優(yōu)良的細(xì)胞膜通透性和雙光子熒光成像性能。

圖5 染料在激發(fā)波長為800 nm下的雙光子細(xì)胞成像

Fig.5 Two-photon fluorescence and DIC images of dye exciting in 800 nm.(a) Fluorescent image incubated with the dye. (b)DIC photo.(c) Overlay the (a) and (b).

4 結(jié) 論

本文合成了一種新型的雙光子熒光染料3,6-雙(4-乙烯基苯腈)-9-乙基咔唑，研究了該化合物在不同溶劑中的光學(xué)性質(zhì)及其生物成像性能。結(jié)果表明：(1)染料在DCM、EA、EtOH、ACN、DMSO 和PBS 等不同溶劑的紫外吸收中呈現(xiàn)出兩個相似的特征吸收帶并且存在明顯的溶劑化效應(yīng)；(2)染料在水相PBS中的熒光量子產(chǎn)率最低只有21.88%，其活性吸收截面為0.86 GM，而在DMSO中熒光量子產(chǎn)率達(dá)到最大86.02%，相應(yīng)的活性吸收截面約為在水相PBS中的15倍達(dá)到12.56 GM；(3)雙光子熒光成像表明染料具有優(yōu)良的細(xì)胞膜通透性和雙光子熒光成像性能。綜上所述，3,6-雙(4-乙烯基苯腈)-9-乙基咔唑具有大的熒光量子產(chǎn)率，好的膜通透性和雙光子熒光成像性能，可用作一種較為理想的雙光子熒光標(biāo)記染料，也為進(jìn)一步構(gòu)筑優(yōu)秀的雙光子熒光探針提供了一種理想的染料平臺。

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Synthesis,OpticalPropertiesandBiologicalImagingofANewTwo-photonFluorescenceDyewithDicyano-group

LILong-long1,ZHAONing1*,LIBing1,PENGDan1,ZHOUNing-ning2,LIUShi-xin3

(1.ShandongKeyLaboratoryforSpecialSilicon-containingMaterials,AdvancedMaterialsInstitute,ShandongAcademyofSciences,Jinan250014,China;2.ShandongInstituteofMetrology,Jinan250014,China;3.ShandongInstituteofStandardization,Jinan250014,China)

A novel two-photon fluorescence dye4,4′-((1Z,1′Z)-(9-ethyl-9H-carbazole-3,6-diyl)bis(ethene-2,1-diyl))dibenzonitrile was synthesized, and the linear absorption and fluorescent spectra of the dye in different solvents were investigated. The results indicate that the dye has a intricate solvent effect existing in UV-Vis absorption spectra, and the quantum yields and two-photon active cross-sections in DMSO are86.02%,12.56GM, respectively. About the images, the dye exhibites excellent cell membrane permeability and optical properties. These data show that the compound is a promising candidate for two-photon fluorescence labels.

two-photon fluorescence dye; UV-Vis absorption; quantum yields; active cross-sections; biological imaging

2017-04-26；

2017-08-18

國家自然科學(xué)基金青年基金(51303097)資助項(xiàng)目

Supported by National Natural Science Foundation for Youth(51303097)

1000-7032(2017)12-1575-07

O625.67

A

10.3788/fgxb20173812.1575

*CorrespondingAuthor,E-mail:zhaon@sdas.org

李龍龍(1988-)，男，山東泰安人，碩士，2014年于齊魯工業(yè)大學(xué)獲得碩士學(xué)位，主要從事雙光子熒光材料的制備、構(gòu)效關(guān)系及其應(yīng)用等方面的研究。E-mail: babylove8856@126.com

趙寧(1982-)，男，山東萊蕪人，博士，副研究員，2010年于山東大學(xué)獲得博士學(xué)位，主要從事雙光子熒光材料的制備、構(gòu)效關(guān)系及其應(yīng)用等方面的研究。E-mail: zhaon@sdas.org