靶向ESCCAL-1基因的siRNA納米復(fù)合物的制備及體外對食管癌EC-9706細(xì)胞的抑制作用

韓鵬黎, 孫 蕾, 呂朋舉, 龔芬芬, 夏 天, 曹 巍

(1.鄭州大學(xué)附屬鄭州中心醫(yī)院轉(zhuǎn)化醫(yī)學(xué)中心，河南 鄭州 450007；2. 加州大學(xué)納米研究所，洛杉磯，CA 90095，美國)

食管癌是發(fā)生于食管上皮組織的惡性腫瘤，是全球最常見的惡性腫瘤之一，在世界范圍內(nèi)，食管癌發(fā)生率高居第8位，死亡率居于第6位，中國是世界上食管癌高發(fā)國家，具有發(fā)病率高、治愈率差、病死率高等特點。在我國大部分地區(qū)，尤其是高發(fā)區(qū)河南省林州市，仍然是導(dǎo)致人死亡的主要原因之一[1]。食管癌早、中期有治愈可能，晚期難度較大，傳統(tǒng)的治療手段如手術(shù)、化學(xué)和放射治療仍然存在損傷性大、并發(fā)癥多、毒副作用強(qiáng)等問題，因此，腫瘤靶向的基因治療具有重要意義[2]。

RNA干擾(RNA interfering，RNAi)是雙鏈RNA 介導(dǎo)的一種有效的、高度特異的基因沉默現(xiàn)象，它能有效地抑制體內(nèi)外基因的表達(dá)。食管鱗狀細(xì)胞癌特異相關(guān)LncRNA轉(zhuǎn)錄物1(esophageal squamous cell carcinoma specifically associated long non-coding RNA transcript 1, ESCCAL_1)是我們課題組發(fā)現(xiàn)的在食管鱗狀細(xì)胞癌中高表達(dá)的LncRNA，且體內(nèi)、外實驗均證實其在食管鱗狀細(xì)胞癌的增殖、凋亡、侵襲、轉(zhuǎn)移、成瘤等過程中具有癌基因功能[3-4]。因此，通過小干擾RNA (small interfering RNA，siRNA) 誘導(dǎo)的RNAi抑制ESCCAL_1 LncRNA 的表達(dá)是一種新的腫瘤治療途徑。siRNA 表面帶負(fù)電荷、相對分子質(zhì)量大，因此，其與細(xì)胞膜相互作用受到抑制，通過細(xì)胞膜的被動擴(kuò)散也受到限制[5]。所以，siRNA在體內(nèi)、外使用時需要一種有效的基因載體。

近年來，介孔材料憑借其獨特的結(jié)構(gòu)特征以及優(yōu)良的理化性能，在化學(xué)、光電子學(xué)、材料學(xué)等諸多領(lǐng)域擁有巨大的應(yīng)用前景。介孔二氧化硅納米微粒(mesoporous silica nanoparticle, MSNP)兼具介孔材料和納米材料的雙重特性，具有一定范圍內(nèi)連續(xù)可調(diào)的均一孔徑、規(guī)則的圓柱形孔道、穩(wěn)定的骨架結(jié)構(gòu)、易于修飾的內(nèi)外表面、良好的生物相容性等特點[6-7]，適合用作藥物或基因載體。本實驗以對ESCCAL_1 LncRNA起干擾作用的siRNA為對象，制備PEI修飾的納米復(fù)合物，并在體外研究對食管癌EC-9706細(xì)胞增殖的抑制作用、轉(zhuǎn)染效率以及對ESCCAL_1 LncRNA表達(dá)的影響進(jìn)行了研究。

1 材料

1.1細(xì)胞人食管癌細(xì)胞株EC-9706購自中國科學(xué)院細(xì)胞庫，使用含10% 胎牛血清的RPMI 1640 培養(yǎng)基，在飽和濕度、5% CO2、37℃的細(xì)胞培養(yǎng)箱中恒溫培養(yǎng)。

1.2試劑PEI(相對分子質(zhì)量2.5×104，Sigma公司，美國)；培養(yǎng)基和胎牛血清(Gibco，美國)；RT-PCR試劑盒、TRIzol 提取試劑、PCR 引物(大連寶生物)；其他試劑均為分析純。

1.3儀器透射電鏡(FEI 公司，美國)；酶標(biāo)儀(Bio-TEK，美國)；CO2恒溫細(xì)胞培養(yǎng)箱(SANYO，日本)；熒光倒置顯微鏡(Olympus，日本)；流式細(xì)胞分析儀( BD Biosciences，美國)。

2 方法

2.1MSNP及MSNP-PEI的制備及理化性質(zhì)的測定100 mg十六烷基三甲基溴化銨溶解于48 mL去離子水，依次加入350 μL 2 mol·L-1氫氧化鈉、500 μL正硅酸乙酯，15 min后加入127 μL 3-(三羥基硅基)丙甲基磷酸酯，80℃油浴繼續(xù)攪拌2 h，離心(18 000 r·min-1，20 min)，去離子水、無水乙醇各洗2次，所得粒子分散在20 mL無水乙醇與1 mL濃鹽酸混合溶液中，70℃水浴冷凝回流24 h，離心后，去離子水、無水乙醇各洗2 次，所得粒子凍干待用。稱取MSNP 12.5 mg 分散在5 mL去離子水中，稱取PEI 25 mg，加5 mL無水乙醇超聲分散，將PEI乙醇溶液逐漸滴加到MSNP水溶液中，攪拌30 min，離心，去離子水、乙醇各洗2次，所得粒子凍干保存。

2.2凝膠電泳測定納米復(fù)合物包封率采用瓊脂糖凝膠電泳法。瓊脂糖濃度1.2%(W/V)，1.0×TAE緩沖電泳液，點樣6個孔，分別為：① siRNA；② 裝載siRNA的納米復(fù)合物；③ 載siRNA的納米復(fù)合物和肝素鈉及10% Triton X-100。點樣5 μL，100 V運(yùn)行10 min，全自動凝膠成像系統(tǒng)分析結(jié)果。

2.3EC-9706細(xì)胞體外增殖實驗采用MTT比色法。將處于對數(shù)生長期的EC-9706細(xì)胞(5×107個/孔)接種在96孔培養(yǎng)板上，常規(guī)培養(yǎng)24 h后，100 nmol·L-1的納米復(fù)合物轉(zhuǎn)染，轉(zhuǎn)染6 h后，更換含10%血清的RPMI 1640培養(yǎng)基，分別作用24、48、72 h，吸棄原培養(yǎng)基，每孔加入10 μL 5 g·L-1的MTT和100 μL 培養(yǎng)基的混合液，繼續(xù)培養(yǎng)4 h后，每孔加入100 μL甲月贊裂解液，孵育使甲月贊結(jié)晶溶解。酶標(biāo)儀測570 nm處各孔的吸光度值(A)，以PBS 為空白對照，計算各組細(xì)胞抑制率。

2.4體外細(xì)胞攝取實驗將經(jīng)滅菌處理的蓋玻片平鋪于6孔培養(yǎng)板的孔中，接種EC-9706 細(xì)胞(5.0×105個/孔)，常規(guī)培養(yǎng)24 h后，用無血清無雙抗的RPMI 1640培養(yǎng)基沖洗1次；加入綠色熒光FAM標(biāo)記siRNA的納米復(fù)合物(終濃度為100 nmol·L-1)轉(zhuǎn)染6 h；對照組加入無血清和無雙抗的培養(yǎng)基。吸棄原培養(yǎng)基，PBS沖洗2次，75%的冰乙醇固定，30 min后吸棄乙醇，取出蓋玻片，放置在載玻片上，熒光顯微鏡下觀察體外細(xì)胞攝取情況。

2.5半定量RT-PCR兩步法測定EC-9706細(xì)胞中ESCCAL_1LncRNA的表達(dá)將EC-9706細(xì)胞(5.0×105個/孔)接種于6孔培養(yǎng)板中，常規(guī)培養(yǎng)24 h后，分別用100 nmol·L-1的siRNA、納米復(fù)合物轉(zhuǎn)染，轉(zhuǎn)染6 h后，更換為含10%血清的RPMI 1640培養(yǎng)基繼續(xù)培養(yǎng)。72 h后，采用TRIzol一步法總RNA提取試劑盒提取總RNA，并進(jìn)行cDNA的合成及PCR的擴(kuò)增。通過Primer5.0軟件設(shè)計2條ESCCAL_1引物序列及2條內(nèi)參GAPDH引物(Tab 1)。PCR反應(yīng)條件為：94℃預(yù)變性5 min，94℃變性30 s，64℃退火30 s，72℃延伸30 s，共循環(huán)34次，72℃延伸7 min，4℃保存。取5 μL擴(kuò)增產(chǎn)物于1.2%的瓊脂糖凝膠分析，凝膠成像系統(tǒng)采集結(jié)果，圖像分析軟件Quantity One分析結(jié)果，計算ESCCAL_1基因LncRNA的相對表達(dá)量。

Tab 1 RT-PCR primer sequences and fragment

3 結(jié)果

3.1MSNP、MSNP-PEI的表征如Fig 1所示，合成的MSNP、MSNP-PEI透射電鏡觀察到MSNP、MSNP-PEI粒子形態(tài)規(guī)則，呈球形，粒徑分布在60～70 nm之間，粒子表面有直徑為3～5 nm的介孔。Tab 2顯示，動態(tài)光散射(DLS)測得MSNP、MSNP-PEI 的粒徑分別為89.9、105 nm，為水合半徑，比干燥后的透射樣品粒徑大些。MSNP 的電勢為-15.28 mV，與PEI 結(jié)合形成MSNP-PEI 后，電勢變?yōu)?34.64 mV，能夠與帶負(fù)電的質(zhì)粒相結(jié)合。

Tab 2 The size and potential of nanoparticles

Fig 1 TEM images(×10)

A:Bare MSNP; B:PEI1.8k-PEG5Kcoated MSNP

3.2載siRNA的靶向脂質(zhì)復(fù)合物的包封率如Fig 2所示，納米復(fù)合物(MSNP-PEI與siRNA 100:1)作用于EC-9706后，納米復(fù)合物組凝膠電泳不顯示游離siRNA的熒光亮帶；單siRNA組凝膠電泳顯示游離siRNA的熒光亮帶。

Fig 2 Encapsulation efficiency of nanocomposites

1：siRNA；2：Nanocomposite

3.3裝載siRNA的靶向納米復(fù)合物體外對EC-9706細(xì)胞增殖的抑制作用如Fig 3所示，siRNA為100 nmol·L-1的納米復(fù)合物分別作用EC-9706細(xì)胞24、48、72 h后，對EC-9706細(xì)胞的增殖均有明顯的抑制作用，與對照組相比，差異有統(tǒng)計學(xué)意義(P<0.05)。

Fig 3 Survival rates of EC-9706 cell action at different time to 100 nmol·L-1 siRNA nanocomposite

*P<0.05vscontrol

3.4裝載siRNA的靶向納米復(fù)合物體外細(xì)胞攝取實驗EC-9706細(xì)胞轉(zhuǎn)染72 h 后，對照組和siRNA組不顯示綠色熒光，載siRNA的靶向納米復(fù)合物顯示明顯的綠色熒光，即載 siRNA 的腫瘤靶向納米復(fù)合物能有效地被EC-9706細(xì)胞攝取而進(jìn)入細(xì)胞(Fig 4)。

3.5裝載siRNA的靶向納米復(fù)合物體外對EC-9706細(xì)胞ESCCAL_1基因表達(dá)的影響載siRNA的腫瘤靶向納米復(fù)合物作用EC-9706細(xì)胞72 h 后，F(xiàn)ig 5的RT-PCR擴(kuò)增產(chǎn)物電泳結(jié)果顯示，靶向ESCCAL_1的納米復(fù)合物組的ESCCAL_1 LncRNA的表達(dá)降低，內(nèi)參GAPDH mRNA水平幾乎沒有變化；載siRNA的腫瘤靶向納米復(fù)合物灰度比值為(28.6±2.2)%，與空白對照組相比，差異有統(tǒng)計學(xué)意義(P<0.05)。即載siRNA 的腫瘤靶向納米復(fù)合物作用72 h后，EC-9706細(xì)胞中ESCCAL_1基因LncRNA的相對表達(dá)量明顯減少。

Fig 4 Uptake of siRNA by EC-9706 cells in vitro

Fig 5 Effect of nanocomposite on expression of ESCCAL_1 LncRNA in EC-9706 cells

*P<0.05vscontrol

4 討論

近年來，隨著基因組測序等技術(shù)的出現(xiàn)，長鏈非編碼RNA逐漸進(jìn)入了人們的視線，并成了基礎(chǔ)研究的熱點[8]。Cao等[3]采用LncRNA陣列技術(shù)，比較食管鱗狀細(xì)胞癌與其臨近正常組織中LncRNAs的表達(dá)差異，選取表達(dá)差異達(dá)30倍、位于8號染色體的第48號上調(diào)LncRNA(chr8:76121095～76189420 reverse strand)，命名為ESCCAL_1(esophageal squamous cell carcinoma associated LncRNA_1)。研究證明ESCCAL_1參與了食管癌的形成過程；敲除ESCCAL_1可增加EC9706細(xì)胞凋亡，降低其侵襲力。這些結(jié)果表明，ESCCAL_1的表達(dá)水平發(fā)生異常改變，可能作為食管癌潛在的藥物靶點[3-4]。

越來越多的研究表明，單分散介孔氧化硅納米顆粒(mesoporous silica nanoparticles,MSNs)作為藥物載體具有獨特優(yōu)勢，已成為近年納米腫瘤藥劑研究的熱點。Tsai等[9]以表面活性劑修飾過的MSNs輸送白藜蘆醇，改善了白藜蘆醇的溶解度，增加了人宮頸癌細(xì)胞HeLa細(xì)胞的內(nèi)吞藥量，提高了該藥物的生物利用度。Hom等[10]采用聚乙烯亞胺與MSNs組裝，輸送siRNA。利用形成的“質(zhì)子海綿效應(yīng)”來保siRNA不被核酸酶降解，并減少siRNA引起的非特異性免疫刺激，成功地沉默了胰腺癌細(xì)胞Panc-1中Akt或K-ras的表達(dá)。Gao等[11]考察不同孔徑的空心MSNs載藥系統(tǒng)對多柔比星耐藥的乳腺癌細(xì)胞MCF-7/ADR的殺傷力，發(fā)現(xiàn)孔徑12.6 nm比3.2 nm的MSNs載藥系統(tǒng)有更強(qiáng)大的殺傷作用。中國科學(xué)技術(shù)大學(xué)王均教授課題組與美國Emory大學(xué)聶書明教授課題組合作，發(fā)明了一種微型“納米航母”藥物遞送體系，實現(xiàn)更加精準(zhǔn)有效的抗腫瘤藥物遞送，研究成果發(fā)表在《美國科學(xué)院院刊》上(PNAS，doi: 10.1073/pnas.1522080113)[12]。本研究使用MSNP-PEI作為ESCCAL_1 siRNA的載體轉(zhuǎn)染EC-9706細(xì)胞，沉默ESCCAL_1 LncRNA，通過RT-PCR證明了ESCCAL_1 siRNA能有效下調(diào)ESCCAL_1基因的表達(dá)，初步驗證MSNP-PEI可以作為基因載體的作用。

本研究制備靶向ESCCAL_1基因的siRNA納米復(fù)合物，并考察其在體外對食管癌EC-9706細(xì)胞的抑制作用。結(jié)果顯示，其介導(dǎo)的siRNA能有效抑制食管癌EC-9706細(xì)胞的體外增殖、能有效沉默EC-9706細(xì)胞中ESCCAL_1 LncRNA。該研究結(jié)果為載siRNA的納米復(fù)合物在腫瘤的基因治療應(yīng)用上提供了有用的實驗依據(jù)。我們將進(jìn)一步深入研究靶向ESCCAL_1基因的siRNA納米復(fù)合物在體內(nèi)的安全性和有效性。

[1] Cao W, Chen X F, Dai H F, et al. Mutation spectra of p53 in geographically localized esophageal cancer groups in China [J].Cancer, 2004,101:834-44.

[2] 李 昀, 張軍航, 安 軍, 等. PLCE1調(diào)控p53誘導(dǎo)食管癌細(xì)胞凋亡的實驗研究[J]. 中國藥理學(xué)通報, 2015,31(1):82-6.

[2] Li Y, Zhang J H, An J, et al. PLCE1 modulates p53 expression and apoptosis in esophageal cancer cells [J].ChinPharmacolBull, 2015,31(1):82-6.

[3〗 Cao W, Wu W, Shi F, et al. Integrated analysis of long noncoding RNA and coding RNA expression in esophageal squamous cell carcinoma [J].IntJGenomics, 2013,2013:480534.

[4〗 Hao Y, Wu W, Shi F, et al. Prediction of long noncoding RNA functions with co-expression network in esophageal squamous cell carcinoma [J].BMCCancer, 2015,15: 168.

[5] Meade B R，Dowdy S F. Enhancing the cellular uptake of siRNA duplexes following noncovalent packaging with protein transduction domain peptides [J].AdvDrugDelivRev，2008，60(4-5) : 530-6.

[6] Slowing I I, Vivero-Escoto J L , Wu C W, et al. Mesoporous silica nanoparticles as controlled release drug delivery and gene transfection carriers [J].AdvDrugDeliveryRev, 2008,60(11): 1278-88.

[7] Lee C H, Lo L W, Mou C Y, et al. Synthesis and characterization of positive-charge functionalized mesoporous silica nanoparticles for oral drug delivery of an anti-inflammatory drug[J].AdvFunctMater, 2008,18(20): 3283-92.

[8] 姜懷德, 李桂林. 長非編碼RNA 的功能研究[J]. 中國藥理學(xué)通報, 2015,31(7): 900-5.

[8] Jiang H D，Li G L. On function of long noncoding RNA[J].ChinPharmacolBull, 2015,31(7) : 900-5.

[9] Tsai C H, Vivero-Escoto J L, Slowing I I, et al. Surfactantassisted controlled release of hydrophobic drugs using anionic surfactant templated mesoporous silica nanoparticles [J].Biomaterials, 2011,32: 6234-44.

[10] Hom C, Lu J, Liong M, et al. Mesoporous silica nanoparticles facilitate delivery of siRNA to shutdown signaling pathways in mammalian cells [J].Small, 2010,6:1185-90.

[11] Gao Y, Chen Y, Ji X, et al. Controlled intracellular release of doxorubicin in multidrug-resistant cancer cells by tuning the shell-pore sizes of mesoporous silica nanoparticles [J].ACSNano, 2011,5: 9788-98.

[12] Li H J, Du J Z, Du X J, et al. Stimuli-responsive clustered nanoparticles for improved tumor penetration and therapeutic efficacy [J].ProcNatlAcadSciUSA, 2016,113(15): 4164-9.