淫羊藿次苷Ⅱ改善自發(fā)性高血壓大鼠左心室心肌細(xì)胞凋亡

吳雨婷，付 舒，岳 云，錢志強(qiáng)，李葉麗，楊丹莉

(基礎(chǔ)藥理教育部重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室暨特色民族藥教育部國際合作聯(lián)合實(shí)驗(yàn)室，遵義醫(yī)學(xué)院，貴州 遵義 563003)

高血壓是嚴(yán)重危害人類健康的心血管疾病之一，目前對它的治療既強(qiáng)調(diào)降低血壓，又要注重靶器官的保護(hù)[1]。高血壓心臟病是代償負(fù)荷所繼發(fā)的病理過程，是高血壓患者的主要并發(fā)癥之一[2]。因心肌細(xì)胞屬于永久細(xì)胞，為保證循環(huán)血量、增強(qiáng)心肌收縮力，在高血壓初期心肌細(xì)胞主要以肥大的形式代償，但同時(shí)也會使心肌耗氧、耗能增加；若負(fù)荷持續(xù)增加，冠狀動脈供血減少，心肌缺血缺氧，導(dǎo)致心肌細(xì)胞凋亡增多，病理性重構(gòu)加重。心肌細(xì)胞凋亡是心肌代償性肥厚向心力衰竭過渡的重要機(jī)制之一[3]。因此，降低血壓和減少心肌細(xì)胞凋亡是改善高血壓心臟病心室重構(gòu)的重要策略。

淫羊藿是我國傳統(tǒng)中草藥，具有“補(bǔ)腎陽，益氣力，強(qiáng)心力”等藥理功效。黃酮類化合物淫羊藿苷是淫羊藿的主要活性成分之一?，F(xiàn)代藥代動力學(xué)研究表明，淫羊藿苷在腸道1～2 h內(nèi)完全轉(zhuǎn)化為淫羊藿次苷Ⅱ(icariside Ⅱ, ICS Ⅱ)[4]。據(jù)報(bào)道，ICS Ⅱ可以抑制H2O2誘導(dǎo)的PC12細(xì)胞凋亡[5]。但關(guān)于ICS Ⅱ?qū)π募〖?xì)胞凋亡的研究鮮有報(bào)道。因此，本研究以自發(fā)性高血壓大鼠(spontaneously hypertensive rat, SHR)為研究對象，觀察ICS Ⅱ是否能夠改善SHR左室心肌細(xì)胞凋亡，并初步探討其可能機(jī)制。

1 材料與方法

1.1藥品、試劑與儀器淫羊藿次苷Ⅱ購自南京澤朗醫(yī)藥有限公司(純度≥ 98%)；原位細(xì)胞凋亡檢測試劑盒( TdT-mediated dUTP Nick-End Labeling, TUNEL)，德國Roche公司；熒光混合物、RNA逆轉(zhuǎn)錄試劑盒、引物(GAPDH、Bax、Bcl-2)購自TaKaRa生物工程公司；Bcl-2、Bax、cleaved-caspase-3兔抗鼠一抗購自美國Abcam公司； GAPDH小鼠抗大鼠抗體購自武漢三鷹生物技術(shù)有限公司；辣根過氧化物酶(HRP)標(biāo)記的山羊抗兔、山羊抗小鼠IgG購自江蘇碧云天生物技術(shù)研究所。光學(xué)顯微鏡及照相系統(tǒng)，日本Olympus公司； RNA逆轉(zhuǎn)錄儀，德國Eppendorf公司；i-mark酶標(biāo)儀、real-time RT-PCR擴(kuò)增儀、Mini PROTEAN3電泳儀、Mini Trans-Blot轉(zhuǎn)移系統(tǒng)以及CCD成像系統(tǒng)，均為美國Bio-Rad公司產(chǎn)品。

1.2實(shí)驗(yàn)動物及分組13周齡♂ SHR 30只、WKY 6只均購自北京維通利華實(shí)驗(yàn)動物技術(shù)有限公司，許可證號: SCXK ( 京) 2012-0001。SHR隨機(jī)分為模型組、ICS Ⅱ低、中、高劑量組和陽性藥組(n=6)，WKY作為空白對照組(n=6)。ICS Ⅱ低、中、高劑量組分別給予ICS Ⅱ 4 、8、16 mg·kg-1(ig, qd)，至26周齡，陽性藥組給予氯沙坦 20 mg·kg-1，WKY和SHR組給予等體積的雙蒸水。

1.3大鼠血壓測定采用 Kent Scientific CODA 測量大鼠在避光、安靜環(huán)境下的鼠尾血壓。

1.4左心質(zhì)量指數(shù)的計(jì)算給藥12周后，稱大鼠體重，用7%水合氯醛(0.35 g·kg-1)腹腔注射麻醉，取出心臟，分離左心室，計(jì)算左心質(zhì)量指數(shù)=左心室 (g) /體重(g)×100。

1.5左心室病理學(xué)觀察將左心室組織置于4%甲醛中固定48 h，脫水、包埋制成蠟塊。切片后行HE染色，在光學(xué)顯微鏡下觀察左心室組織的病理學(xué)變化。

1.6左心室心肌細(xì)胞凋亡檢測上述心臟蠟塊切片、脫蠟，采用終濃度為 20 mg·L-1的蛋白激酶K破膜、3% H2O2消除內(nèi)源性過氧化物酶后，經(jīng)TUNEL法染色，具體操作參照試劑盒說明書。最后用中性樹膠封片，在光學(xué)顯微鏡下觀察各組心肌細(xì)胞凋亡情況，正常細(xì)胞和凋亡細(xì)胞的細(xì)胞核分別被染成藍(lán)色和棕黃色。

1.7real-timeRT-PCR法檢測左心室組織Bcl-2、BaxmRNA水平取各組左心室組織，置于TRIzol中提取總RNA，經(jīng)兩步法-聚合酶鏈反應(yīng)分別檢測GAPDH、Bcl-2、Bax mRNA的水平。所檢測基因的引物序列參照 GenBank 中大鼠GAPDH、Bcl-2、Bax序列設(shè)計(jì)(Tab 1)。目的基因表達(dá)用相對定量法，以PCR擴(kuò)增過程中熒光信號強(qiáng)度達(dá)到閾值所需要的循環(huán)數(shù)(cycle threshold，Ct值) 為統(tǒng)計(jì)參數(shù)，依次計(jì)算下列數(shù)據(jù)，Ct值的平均值= ( Ctl + Ct2) /2( 重復(fù)管)；dCt = Ct值的平均值-中間值(相同檢測基因的不同樣品 Ct 值的平均值中居中的值)；基因的表達(dá) = 2-dCt；相對定量=目的基因的表達(dá)/內(nèi)參基因的表達(dá)×100，將 WKY 組的mRNA表達(dá)設(shè)為100。

1.8Westernblot法檢測左心室組織中Bcl-2、Bax、cleaved-caspase-3蛋白的表達(dá)取各組大鼠冰凍左室組織 300 mg，剪碎后放入 1 mL RIPA 裂解液中，加入PMSF、蛋白磷酸酶抑制劑各 10 μL，冰上勻漿后靜置 30 min， 4℃下 12 000 r·min-1離心20 min，取上清液，BCA法測定樣本濃度。每孔上樣量為10 μL(含30 μg蛋白)，SDS-聚丙烯酰胺凝膠電泳。電泳后轉(zhuǎn)至PVDF膜，5%蛋白封閉液封閉 2.5 h，TBST洗膜 10 min×3次，一抗GAPDH (1∶10 000)、Bcl-2 (1∶1 000)、Bax(1∶1 000)、cleaved-caspase-3(1∶2 000) 4℃過夜，TBST洗膜10 min×3次，二抗(1∶2 000)常溫浸泡1.5 h，ECL 化學(xué)發(fā)光顯色，CCD 成像系統(tǒng)獲取圖像。

2 結(jié)果

2.1大鼠血壓的變化如Tab 2所示，26周齡SHR血壓較WKY明顯升高(P<0.05)，收縮壓是WKY的1.36倍，舒張壓是WKY的1.53倍；與SHR組相比，ICS Ⅱ中、高劑量組和陽性藥組收縮壓分別下降了9.6%、16.6%、20.9%(P<0.05)；舒張壓分別下降了13.6%、27.3%、35.3%(P<0.05)。以上結(jié)果表明ICS Ⅱ具有降低SHR血壓的作用。

Tab 1 Primer pairs used in real time RT-PCR

Tab 2 Effect of ICS Ⅱ on SHR blood pressure and left ventricular mass index(n=4)

#P<0.05vsWKY;*P<0.05vsSHR

Fig 1 Effects of ICS Ⅱ on left ventricular pathology in SHR (×400) A: WKY; B: SHR; C: ICS Ⅱ-L; D: ICS Ⅱ-M; E: ICS Ⅱ-H; F: Losartan

Fig 2 Effects of ICS Ⅱ on apoptosis in left ventricular myocytes (×400) A: WKY; B: SHR; C: ICS Ⅱ-L; D: ICS Ⅱ-M; E: ICS Ⅱ-H; F: Losartan

2.2大鼠左心質(zhì)量指數(shù)的變化與WKY組相比，SHR組左心質(zhì)量指數(shù)升高(P<0.05)；與SHR組相比，ICS Ⅱ中、高劑量及陽性藥組左心質(zhì)量指數(shù)明顯下降(P<0.05)，見Tab 2。

2.3大鼠左心室病理學(xué)變化HE染色顯示，WKY組心肌細(xì)胞大小正常、細(xì)胞排列規(guī)則；與其相比，SHR組心肌細(xì)胞肥大明顯且排列紊亂，可見肌絲斷裂。與SHR組相比，ICS Ⅱ組和陽性藥組細(xì)胞肥大減輕且細(xì)胞排列趨于整齊，并且以ICS Ⅱ中、高劑量及陽性藥組效果更為明顯，見Fig 1。

2.4左心室心肌細(xì)胞凋亡檢測TUNEL染色顯示，與WKY組相比，SHR組心肌細(xì)胞凋亡明顯增多；而與SHR組相比，ICS Ⅱ各劑量組和陽性藥組心肌細(xì)胞凋亡不同程度減少。表明ICS Ⅱ能減少SHR心肌細(xì)胞凋亡，見Fig 2。

2.5大鼠左心組織中Bcl-2、BaxmRNA水平與WKY組相比，SHR組Bax mRNA水平明顯上調(diào)(P<0.05)，Bcl-2 mRNA水平明顯下調(diào)(P<0.05)；經(jīng)ICS Ⅱ和氯沙坦處理后，Bcl-2 mRNA水平明顯上調(diào)(P<0.05)，Bax mRNA水平下調(diào)(P<0.05)，見Fig 3。

2.6大鼠左心組織中Bcl-2、Bax、cleaved-caspase-3蛋白的表達(dá)與WKY組相比，SHR組Bax、cleaved-caspase-3蛋白表達(dá)明顯上調(diào)，Bcl-2蛋白表達(dá)下調(diào)，Bax/Bcl-2比值升高(P<0.05)；而給予ICS Ⅱ各劑量及氯沙坦治療后，Bax、cleaved-caspase-3水平下調(diào)，Bcl-2蛋白表達(dá)上調(diào)，Bax/Bcl-2比值降低(P<0.05)，見Fig 4。

Fig 3 Effects of ICS Ⅱ on left ventricular Bcl-2 and Bax mRNA levels(n=6)

#P<0.05vsWKY;*P<0.05vsSHR

Fig 4 Effect of ICS Ⅱ on expression of Bcl-2, Bax, cleaved- caspase-3 proteins and Bax/Bcl-2 in left ventricle(n=3)

#P<0.05vsWKY;*P<0.05vsSHR

3 討論

SHR在第6～8周屬于高血壓前期，在12～14周發(fā)展為持續(xù)性高血壓，隨著疾病進(jìn)展出現(xiàn)高血壓終末靶器官損傷的許多特征，如心室重構(gòu)、心力衰竭等[6]。在本研究中，26周SHR已有明顯的動脈性高血壓，收縮壓和舒張壓分別是WKY的1.36倍和1.53倍，而ICS Ⅱ能降低SHR血壓，且以中高劑量效果明顯。病理染色結(jié)果顯示，與WKY組相比，SHR組心肌細(xì)胞肥大明顯且排列紊亂，可見肌絲斷裂，同時(shí)左心質(zhì)量指數(shù)也明顯升高，表明26周齡SHR已出現(xiàn)心室重構(gòu)，這也與本課題組以往研究的報(bào)道一致[7]。而與SHR組比較，ICS Ⅱ中、高劑量和陽性藥氯沙坦心肌細(xì)胞排列趨于整齊，心肌細(xì)胞肥大不同程度改善，且左心質(zhì)量指數(shù)下降。故ICS Ⅱ具有改善SHR心室重構(gòu)的作用，其機(jī)制可能部分與其降低動脈血壓有關(guān)。

心肌細(xì)胞僅在胚胎時(shí)期進(jìn)行分裂，當(dāng)負(fù)荷增加時(shí)主要是以肥大的形式代償。當(dāng)負(fù)荷持續(xù)增加超過這種代償能力時(shí)，可導(dǎo)致心肌細(xì)胞凋亡。大量研究指出，8周齡以上的SHR均有心肌細(xì)胞凋亡，16周齡后其凋亡明顯加速，且細(xì)胞凋亡水平與左心室重塑之間具有明顯相關(guān)性[6,8-9]。本研究TUNEL染色結(jié)果顯示，模型組心肌細(xì)胞凋亡數(shù)明顯增多，而ICS Ⅱ各劑量及陽性藥組心肌細(xì)胞凋亡減少。提示ICS Ⅱ具有抑制心肌細(xì)胞凋亡的作用。

大量報(bào)道指出，線粒體凋亡途徑在高血壓心臟重塑中起重要作用[10-11]。一直以來，Bcl-2家族都受到了廣泛關(guān)注，它包括促凋亡家族和抗凋亡家族。促凋亡Bcl-2家族包括含有BH3-only結(jié)構(gòu)域的蛋白(如Bim、Bid、Bad)和多結(jié)構(gòu)域蛋白(如Bax、Bak)。在受到凋亡信號刺激時(shí)， BH3-only蛋白被激活，直接或間接促進(jìn)Bax/Bak寡聚，使線粒體外膜通透性改變和細(xì)胞色素C釋放，釋放入細(xì)胞質(zhì)的細(xì)胞色素C又可導(dǎo)致caspase-3裂解活化，執(zhí)行細(xì)胞凋亡；抗凋亡Bcl-2家族主要通過與促凋亡家族成員形成異源二聚體，維持線粒體膜的通透性以抑制細(xì)胞色素C的釋放，從而減輕細(xì)胞凋亡[12-14]?？沟蛲龊痛俚蛲黾易宓鞍资Ш馐羌?xì)胞凋亡的關(guān)鍵因素。在本項(xiàng)研究中，與WKY相比，SHR左心組織中促凋亡蛋白Bax mRNA和蛋白的表達(dá)上調(diào)，執(zhí)行凋亡的cleaved-caspase-3蛋白上調(diào)，而抗凋亡蛋白Bcl-2 mRNA和蛋白的表達(dá)明顯下調(diào)，Bax/Bcl-2比值升高，以上結(jié)果表明線粒體凋亡途徑是SHR心肌細(xì)胞凋亡的途徑之一。而經(jīng)ICS Ⅱ處理后，抗凋亡蛋白Bcl-2 mRNA和蛋白表達(dá)明顯上調(diào)，而Bax mRNA水平和Bax、cleaved-caspase-3蛋白表達(dá)均下調(diào)，Bax/Bcl-2比值降低，提示ICS Ⅱ可以通過抑制線粒體凋亡途徑減輕SHR心肌細(xì)胞凋亡。

綜上，ICS Ⅱ可減輕SHR左心室心肌細(xì)胞凋亡，其機(jī)制與其降低血壓和抑制線粒體凋亡途徑相關(guān)。

(致謝：本實(shí)驗(yàn)在遵義醫(yī)學(xué)院基礎(chǔ)藥理教育部重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室暨特色民族藥教育部國際合作聯(lián)合實(shí)驗(yàn)室完成，感謝藥理學(xué)教研室的支持和幫助，感謝朱玲、孫瑞敏、吳芹、黃波提供的幫助!)

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