澤瀉湯對高脂血癥大鼠脂代謝及PPARα和ACO基因和蛋白表達的影響

韓 雪，張睦清，常 冰，王 茜，郝 蕾，劉 宇，石 鋮，郭秋紅，張一昕

(1. 河北中醫(yī)學院藥學院臨床中藥學教研室，河北 石家莊 050200；2. 河北省中醫(yī)院心血管內(nèi)科，河北 石家莊 050017；3.石家莊市中醫(yī)院心血管內(nèi)科，河北 石家莊 050017)

高脂血癥(hyperlipidemia，HLP)主要是指血漿中膽固醇(total cholesterol，TC)和(或)甘油三酯(triglyceride，TG)水平升高，其本質(zhì)是人體內(nèi)脂質(zhì)代謝、轉(zhuǎn)運的紊亂，屬于代謝性疾病，是導致脂肪肝、冠心病、動脈粥樣硬化等多種心腦血管疾病的重要因素之一[1-2]。近年來，人們攝入脂肪增多，但體力運動減少，使高脂血癥的發(fā)病率日益攀高。中醫(yī)藥在防治高脂血癥方面較西藥有明顯優(yōu)勢，研究發(fā)現(xiàn)[3]，澤瀉、白術作為藥對單獨使用或與他藥配伍使用治療高脂血癥的情況尤其多見。本實驗主要從肝臟過氧化物酶體增殖物激活受體α(peroxisome proliferator activated receptor-α，PPARα)途徑入手，觀察澤瀉湯(Rhizoma Alismatis decoction，RAD)對肝臟PPARα和其下游基因乙酰輔酶A氧化酶(acyl CoA oxidase，ACO)基因和蛋白表達的影響，并對其作用機制進行初步探討。

1 材料

1.1動物健康♂ SD大鼠50只，體質(zhì)量160～180 g，購自河北省實驗動物中心，實驗動物質(zhì)量合格證號為1209029。

1.2藥物澤瀉、白術兩味中藥，購于石家莊市樂仁堂藥店，水煎濃縮至所需濃度。血脂康膠囊(批號：20120701)，以蒸餾水配制所需濃度。

1.3試劑TC、TG、高密度脂蛋白膽固醇(high-density lipoprotein-cholesterol ，HDL-C)、低密度脂蛋白膽固醇(low-density lipoprotein-cholesterol，LDL-C)試劑盒(北京中山生物技術有限公司)；TRIzol(Invitrogen公司)；DEPC(Sigma公司)；RT Reagents、PCR Reagents、DNA Marker(TaKaRa公司)；兔抗PPARα抗體(美國Bioworld公司)、兔抗ACO抗體(美國Santa Cruz公司)。

1.4儀器VANOX AHB-LB型顯微鏡(日本OLYMPUS公司)；RM2345石蠟切片機(LEICA公司)；PE9600型PCR擴增儀(美國PE公司)；凝膠圖像分析系統(tǒng)(法國VL公司BIO-PROFIF)等。

2 方法

2.1動物分組及造模將50只大鼠隨機分為5組，即：空白對照組(Control)、模型對照組(Model)、澤瀉湯高劑量組(H-RAD)、澤瀉湯低劑量組(L-RAD)、血脂康對照組(XZK)，每組10只?？瞻捉M喂飼普通飼料，其余以高脂飼料(參照文獻[4]1.5%膽固醇、0.5%豬膽酸鈉、88%普通飼料、10%豬油)喂飼造模，共4周。

2.2給藥方法及標本采集自造模d 1開始，澤瀉湯各劑量組和血脂康組分別給予相應藥物灌胃，用藥劑量為21.0、10.5、0.2 g·kg-1，空白組和模型組灌服等量蒸餾水，每日1次，用藥體積為10 mL·kg-1。4周末，10%水合氯醛麻醉，股動脈取血，分離血清。同時迅速剖取肝臟，取部分肝組織，液氮凍存，另取大小適宜的肝組織固定于4%多聚甲醛液中。

2.3檢測指標及方法

2.3.1血清脂質(zhì)含量的檢測 酶法測定血清TC、TG、HDL、LDL的含量。

2.3.2肝組織形態(tài)學的觀察 取在4%多聚甲醛中固定的肝組織，HE染色，光鏡下觀察肝組織形態(tài)的改變。

2.3.3肝組織PPARα mRNA、ACO mRNA表達的檢測 采用逆轉(zhuǎn)錄聚合酶鏈式反應(RT-PCR)方法測定肝臟PPARα mRNA和ACO mRNA的表達。細胞總RNA提取采用TRIzol一步法。實驗重復3次，以β-actin作為內(nèi)對照，計算相對含量。

2.3.4肝組織PPARα、ACO蛋白表達的檢測 按照試劑盒說明書，提取肝組織細胞核蛋白，常規(guī)方法進行SDS-PAGE 凝膠電泳，采用半干轉(zhuǎn)的方式轉(zhuǎn)至PVDF膜，小心取出轉(zhuǎn)移膜置于封閉液中，室溫、搖床上緩慢搖動狀態(tài)下封閉2 h。加入一抗孵育過夜，PBST洗滌3次，每次10 min，加入二抗孵育90 min，PBST洗滌3次，每次10 min，應用ECL 發(fā)光試劑盒反應，經(jīng)X線片曝光，顯影液、定影液顯色后，根據(jù)條帶的亮度以及背景情況可以再次選擇曝光時間進行二次曝光。用Tanon Gis軟件分析X線片上的條帶灰度值。

3 結(jié)果

3.1各組大鼠血清脂質(zhì)水平模型組大鼠血清TC、TG和LDL的含量均高于空白組(P<0.01)，HDL含量低于空白組(P<0.01)；用藥后，澤瀉湯各劑量組及血脂康組大鼠血清TC、TG、LDL含量均明顯降低(P<0.01)，HDL含量均明顯升高(P<0.01)。其中，低劑量組TC和TG含量均高于血脂康組和高劑量組(P<0.01);低劑量組的LDL含量高于血脂康組和高劑量組(P<0.01)。見Tab 1。

3.2各組大鼠肝組織形態(tài)學變化如Fig 1所示，空白組大鼠肝小葉清晰可見，肝細胞結(jié)構(gòu)正常，排列成肝索。模型組大鼠肝細胞呈現(xiàn)彌漫性脂肪變性，可見大泡型脂肪滴，細胞核偏離中心。澤瀉湯各劑量組與血脂康組大鼠肝細胞脂肪變性程度均有所減輕。

Tab 1 Content of TC, TG, HDL and LDL in serum of HLP rats(±s，n=10)

##P<0.01vscontrol；**P<0.01vsmodel;△△P<0.01vsXZK

3.3各組大鼠肝組織PPARα和ACOmRNA的表達如Fig 2所示，模型組大鼠PPARα和ACO mRNA的表達均弱于空白組(P<0.01)。用藥后，澤瀉湯各劑量組和血脂康組PPARα和ACO mRNA的表達均強于模型組(P<0.01)。

3.4各組大鼠肝組織PPARα和ACO蛋白的表達如Fig 3所示，模型組大鼠PPARα和ACO的蛋白表達均弱于空白組(P<0.01)。用藥后，澤瀉湯各劑量組和血脂康組PPARα和ACO的蛋白表達均強于模型組(P<0.01)。

4 討論

Fig 1 Effects of RAD on histopathological changes of rat heart stained with HE

A: Control group; B Model group; C: H-RAD 21.0 g·kg-1group; D: L-RAD 10.5 g·kg-1group; E: XZK 0.2 g·kg-1group

Fig 2 Expression of PPARα mRNA and ACO mRNA in hepatic tissues of HLP rats(±s，n=10)

1: Control group; 2: Model group; 3: H-RAD 21.0 g·kg-1group; 4: L-RAD 10.5 g·kg-1group; 5: XZK 0.2 g·kg-1group.##P<0.01vscontrol；**P<0.01vsmodel

Fig 3 The protein expression of PPARα and ACO in hepatic tissues of HLP rats(±s, n=10)

1: Control group; 2: Model group; 3: H-RAD 21.0 g·kg-1group; 4: L-RAD 10.5 g·kg-1group; 5: XZK 0.2 g·kg-1group.##P<0.01vscontrol；**P<0.01vsmodel

高脂血癥為西醫(yī)病名，從中醫(yī)學的理論進行分析，高脂血癥可歸屬“痰濁”、“血瘀”等范疇，尤其是與內(nèi)生痰濁關系密切。筆者認為，高脂血癥的發(fā)病之所以呈逐年上升趨勢，其原因在于生活水平的提高，人們攝入過多的高脂高熱量食物；久坐(臥)少動，身體缺乏鍛煉；工作壓力的增大和欲望的日益增多，情緒失衡，致使肝氣失于條暢等，漸至戧伐正氣，脾失健運，肝失疏泄，氣血津液運行失常，體內(nèi)津液的輸布或代謝出現(xiàn)障礙，則濕聚為飲生痰，痰濕脂濁稽留于里，注入血液，遂致血脂不斷升高。因此，脾虛痰濕內(nèi)盛為本病的主要病理基礎，健脾祛濕消痰為本病標本兼治的有效方法。臨床資料表明[3]，澤瀉與白術作為高頻藥對應用于臨床治療高脂血癥，取得了較好的治療效果。經(jīng)方澤瀉湯原主治“心下有支飲，其人苦冒眩”的病癥，從其組成分析，澤瀉功能利水滲濕消痰，白術有健脾燥濕利水之效，兩藥合用健脾、祛濕、化痰，與高脂血癥的發(fā)病機制頗為吻合，故選用其作為治療高脂血癥的基本方劑開展實驗研究。

由于進食過多的熱量，促進TG的合成導致肥胖，而肥胖者體內(nèi)的脂肪堆積使脂肪分解更加活躍，釋放更多的游離脂肪酸(free fatty acids，F(xiàn)FA)，血中FFA 增加引發(fā)血脂紊亂[5]。PPARs作為核受體超家族的一員，是一類由配體激活的核轉(zhuǎn)錄因子,有3種亞型，包括PPAR-α、PPAR-β/δ及PPAR-γ[6-7]。其中，PPARα在肝細胞中高水平表達，可參與眾多生化反應及生物調(diào)節(jié)過程，調(diào)節(jié)脂類的攝取、氧化和脂肪的生成[8-9]，還可通過調(diào)控基因編碼線粒體脂肪酸β-氧化途徑保護心肌[10]。當PPARα被活化后與配體形成異二聚體[11]，可調(diào)控參與脂代謝的多種基因編碼的蛋白質(zhì)，如脂肪酸轉(zhuǎn)位酶、乙酰輔酶A氧化酶等[12]，從而介導TG和脂肪酸的分解代謝[13]。乙酰輔酶A氧化酶就是其中一個受PPARα調(diào)控的酶，也是β-氧化的關鍵酶，能增強β氧化，減少TG合成所需的乙酰輔酶A酯，進而影響TG的合成。PPARα被激活后，可直接增加脂肪酸的氧化，減少脂肪的積聚，維持內(nèi)環(huán)境的穩(wěn)定[14]，同時激活其下游基因ACO的表達，進而減少TG的合成。

本研究結(jié)果顯示，模型組大鼠血清TC、TG、LDL含量均明顯升高，HDL含量及肝組織PPARα、ACO的基因和蛋白表達明顯降低；治療后，澤瀉湯各劑量組大鼠血清TC、TG、LDL含量明顯降低，而HDL含量及肝細胞PPARα和ACO的表達明顯升高，提示該方具有調(diào)節(jié)血脂作用，其作用機制可能是通過增強PPARα的表達，激活其下游基因ACO的表達，促進脂肪氧化分解，減少脂質(zhì)合成，以調(diào)節(jié)脂質(zhì)代謝，進而達到調(diào)節(jié)血脂的目的，但其深入的作用機制有待進一步探討。

(致謝：本實驗在河北中醫(yī)學院實驗中心開展，感謝各位老師和同學的幫助與支持。)

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