西洋參莖葉皂苷對(duì)糖尿病大鼠氧化損傷和血管內(nèi)皮功能的影響

李吉萍，袁 野，張文友

(1. 揚(yáng)州大學(xué)醫(yī)學(xué)院藥理教研室，江蘇 揚(yáng)州 225001；2. 雅安職業(yè)技術(shù)學(xué)院藥學(xué)檢驗(yàn)系，四川 雅安 625000)

糖尿病是當(dāng)今社會(huì)中較常見(jiàn)的一種慢性非感染性疾病，已成為繼惡性腫瘤、心腦血管疾病的第三大致死性疾病，而心血管并發(fā)癥是糖尿病患者死亡的主要原因之一[1]。糖尿病患者主要的臨床表現(xiàn)為體內(nèi)持續(xù)的高血糖，除了血糖異常外，還伴隨著氧化應(yīng)激和血管內(nèi)皮功能的改變。內(nèi)皮功能障礙不僅是糖尿病血管病變的始動(dòng)因素，同時(shí)也是動(dòng)脈粥樣硬化形成的早期表現(xiàn)之一。研究顯示，高糖、高脂、胰島素抵抗以及氧化應(yīng)激均能導(dǎo)致血管內(nèi)皮損傷，并產(chǎn)生功能障礙，加速糖尿病的發(fā)生和發(fā)展[2]。故糖尿病的治療應(yīng)考慮綜合治療的方式，除了降低血糖以使其達(dá)到正常范圍外，如何減少體內(nèi)氧化應(yīng)激以及改善內(nèi)皮功能也非常重要。

中藥防治糖尿病一直是近些年國(guó)內(nèi)外研究的熱點(diǎn)，大量的研究報(bào)道表明中藥在防治糖尿病血管并發(fā)癥中的優(yōu)勢(shì)[3-4]。西洋參又名西洋人參、花旗參、廣東人參，為五加科植物，主要產(chǎn)于美國(guó)、加拿大等國(guó)，我國(guó)在早些年便已引進(jìn)并大面積栽培。因其廣泛的藥理作用和生物活性[5]，國(guó)內(nèi)外不少學(xué)者致力于其使用和開(kāi)發(fā)。近年來(lái)，不少研究均證實(shí)西洋參根、莖、葉、果中的提取物——皂苷和多糖等成分具有明顯的降糖作用[6]，且有文獻(xiàn)報(bào)道，其能夠改善冠心病血糖異?；颊擀录?xì)胞功能[7]。相比現(xiàn)在已經(jīng)上市的其他一些西藥以及相關(guān)中藥提取物，西洋參莖葉皂苷(Panax quinquefolium saponins，PQS)同時(shí)還具有對(duì)大鼠心肌缺血、腦缺血以及抑制腦組織神經(jīng)細(xì)胞凋亡等廣泛的藥理作用[8-9]。

本人前期工作中已發(fā)現(xiàn)PQS對(duì)氧化低密度脂蛋白(oxidized low density lipoprotein，ox-LDL)刺激的離體血管環(huán)損傷有一定的保護(hù)作用[10]，故本次設(shè)立糖尿病大鼠體內(nèi)實(shí)驗(yàn)，研究PQS對(duì)糖尿病大鼠血糖值，血清、心、腎組織中過(guò)氧化脂質(zhì)(lipid peroxide，LPO)和超氧化物歧化酶(superoxide dismutase，SOD)含量變化以及胸主動(dòng)脈內(nèi)皮依賴(lài)性舒張反應(yīng)的影響，探討PQS干預(yù)糖尿病大鼠氧化損傷和血管保護(hù)可能的作用機(jī)制，并為該藥后期的開(kāi)發(fā)利用提供理論依據(jù)。

1 材料

1.1實(shí)驗(yàn)動(dòng)物Wistar大鼠224只，♂，體質(zhì)量180～220 g，購(gòu)于揚(yáng)州大學(xué)比較醫(yī)學(xué)實(shí)驗(yàn)中心，實(shí)驗(yàn)動(dòng)物生產(chǎn)許可證：SCXK(蘇)2012-0004，使用許可證號(hào)：SYXK(蘇)2012-0029。實(shí)驗(yàn)中死亡及不符合實(shí)驗(yàn)要求的動(dòng)物數(shù)為12只。

1.2藥品與試劑西洋參莖葉皂苷，由吉林大學(xué)化學(xué)院天然藥物化學(xué)研究室提供，批號(hào)20150615；Vitamin E，天津市中央藥業(yè)有限公司，批號(hào)150901；鏈脲佐菌素(streptozocin，STZ)，Sigma公司，批號(hào)S-10130； LPO及SOD試劑盒均購(gòu)自上海信裕生物科技有限公司。

1.3儀器BT3000-PLUS型全自動(dòng)生化分析儀，意大利Biotecnica公司；BP110S型電子天平，德國(guó)塞多厲斯公司公司；TGL-16G型臺(tái)式離心機(jī)、TDL-5型臺(tái)式離心機(jī)，上海安亭科學(xué)儀器廠(chǎng)；UV-265FW紫外可見(jiàn)分光光度計(jì)，日本島津公司；張力換能器、二道生理記錄儀，由揚(yáng)州大學(xué)機(jī)能實(shí)驗(yàn)室提供。

2 方法

2.1模型的建立及分組大鼠適應(yīng)性飼養(yǎng)3 d，禁食12 h后，一次性腹腔注射STZ(30 mg·kg-1)誘導(dǎo)糖尿病大鼠模型，正常對(duì)照組注射等量的檸檬酸鹽緩沖液。3 d后尾靜脈取血，測(cè)定血糖，空腹血糖(Fasting blood glucose detection，F(xiàn)BG)>16 mmol·L-1即認(rèn)為模型構(gòu)建成功，再將糖尿病大鼠隨機(jī)分為模型組、PQS組和Vitamin E組。

2.2給藥方法正常對(duì)照組和糖尿病模型組給予生理鹽水灌胃，PQS組按100 mg·kg-1灌胃給藥，Vitamin E按100 μmol·kg-1灌胃給藥，每日1次。連續(xù)給藥4、8、16周后禁食12 h，用乙醚麻醉大鼠，腹主動(dòng)脈采血，制備血清，然后迅速摘取心臟和腎臟置于4℃生理鹽水洗凈殘血，剝?nèi)ケ荒?，精確稱(chēng)重后，用電動(dòng)勻漿器制成10%的組織勻漿，低溫離心，吸取上清后冷凍備用。

2.3生化指標(biāo)檢測(cè)(1)空腹血糖：葡萄糖氧化酶法(操作方法按試劑盒說(shuō)明書(shū))；(2)血漿、心臟、腎組織SOD活性：黃嘌呤氧化酶法(操作方法按試劑盒說(shuō)明書(shū))；(3)血漿、心臟、腎組織LPO含量：TBA比色法(操作方法按試劑盒說(shuō)明書(shū))。

2.4胸主動(dòng)脈離體血管環(huán)舒張反應(yīng)檢測(cè)連續(xù)給藥4、8、16周后，禁食12 h，腹腔注射3%戊巴比妥鈉(30 mg·kg-1)麻醉大鼠，迅速打開(kāi)胸腔取出胸主動(dòng)脈，置于通以95% O2∶5% CO2混合氣體的Krebs-Henseleit液中，仔細(xì)分離血管周?chē)M織，清除血管內(nèi)血液，剪成3 mm長(zhǎng)血管環(huán)，鋼鉤固定于含Krebs-Henseleit液的浴皿中，并通過(guò)張力換能器連于二道生理記錄儀，給予血管環(huán)2 g的靜息張力，平衡90 min后，先以苯腎上腺素(1×10-6mol·L-1)收縮血管環(huán)，然后分別用累加劑量的乙酰膽堿(10-8～10-4.5mol·L-1)舒張血管，記錄血管舒張反應(yīng)，并以硝普鈉作為內(nèi)皮非依賴(lài)性舒張反應(yīng)的對(duì)照。浴皿在整個(gè)實(shí)驗(yàn)過(guò)程中始終通以95% O2∶5% CO2的混合氣體，并保持Krebs-Henseleit液恒溫(37±0.5)℃。

3 結(jié)果

3.1PQS對(duì)糖尿病大鼠血糖水平的影響Tab 1結(jié)果顯示，糖尿病模型組與Vitamin E組大鼠給藥前后血糖與正常對(duì)照組相比明顯升高(P<0.01)；與糖尿病模型組大鼠比較，連續(xù)給予PQS 8～16周后可明顯降低糖尿病大鼠血糖(P<0.05或P<0.01)。

3.2PQS對(duì)糖尿病大鼠血清、心、腎LPO的影響Tab 2、3結(jié)果顯示，糖尿病模型組大鼠給藥前后血清、心、腎組織LPO含量與正常對(duì)照組相比明顯升高(P<0.01)；與糖尿病模型組比較，連續(xù)給予PQS 4～16周后，可明顯降低大鼠血清、心、腎組織LPO含量(P<0.05、P<0.01)；給予陽(yáng)性對(duì)照藥Vitamin E后也可明顯降低糖尿病模型大鼠血清、心、腎組織LPO含量(P<0.01)。

Tab 1 Effect of PQS treatment on blood glucose in rats(±s,n=10,mmol·L-1)

*P<0.05,**P<0.01vscontrol;#P<0.05,##P<0.01vsmodel

Tab 2 Effect of PQS treatment on serum LPO in rats(±s, n=10, mmol·L-1)

**P<0.01vscontrol;##P<0.01vsmodel

Tab 3 Effect of PQS treatment on LPO in heart and kidney of rats(±s, n=10, mmol·kg-1)

*P<0.05,**P<0.01vscontrol;#P<0.05,##P<0.01vsmodel

Tab 4 Effect of PQS treatment on serum SOD in rats(±s, n=10, kU·L-1)

**P<0.01vscontrol;#P<0.05,##P<0.01vsmodel

Tab 5 Effect of PQS treatment on SOD in heart and kidney of rats(±s,n=10, U·g-1)

**P<0.01vscontrol;#P<0.05,##P<0.01vsmodel

3.3PQS對(duì)糖尿病大鼠血清、心、腎SOD的影響Tab 4、5結(jié)果顯示，糖尿病模型組大鼠給藥前后血清、心、腎組織SOD活性與正常對(duì)照組相比明顯降低(P<0.01)；連續(xù)給予PQS 4～16周后，與糖尿病模型組比較，可明顯升高糖尿病模型大鼠血清、心、腎組織SOD活性(P<0.05，P<0.01)；給予陽(yáng)性對(duì)照藥Vitamin E后也可明顯升高糖尿病模型大鼠血清、心、腎組織SOD活性(P<0.05，P<0.01)。

3.4PQS對(duì)糖尿病大鼠胸主動(dòng)脈內(nèi)皮依賴(lài)性舒張反應(yīng)的影響Fig 1A結(jié)果顯示，與正常對(duì)照組比較，模型組大鼠隨時(shí)間推移，胸主動(dòng)脈內(nèi)皮依賴(lài)性舒張反應(yīng)逐漸降低；Fig 1B、1C顯示，糖尿病大鼠長(zhǎng)期給予(8～16周)PQS或陽(yáng)性對(duì)照藥Vitamin E灌胃后，其胸主動(dòng)脈內(nèi)皮依賴(lài)性舒張反應(yīng)明顯提高(P<0.05,P<0.01)，并逐漸趨近正常值。

4 討論

糖尿病是一種多因素引起的內(nèi)分泌代謝紊亂性疾病，可分為1型、2型、妊娠糖尿病和其他特殊類(lèi)型糖尿病。STZ是目前構(gòu)建糖尿病模型常用的化學(xué)藥物，它能選擇性的破壞胰島β細(xì)胞，且其產(chǎn)生的自由基能夠直接損傷胰腺，降低體內(nèi)胰島素水平，破壞體內(nèi)血糖穩(wěn)態(tài)[11]。

近年來(lái)研究表明，糖尿病及其并發(fā)癥的產(chǎn)生與體內(nèi)自由基增多以及氧化應(yīng)激反應(yīng)有關(guān)[12]。人體內(nèi)存在大量的不飽和脂肪酸，可以和氧自由基通過(guò)脂質(zhì)自動(dòng)氧化反應(yīng)生成LPO。LPO是糖尿病的主要特征之一，是脂質(zhì)氧化產(chǎn)生的脂毒性物質(zhì)，其含量高低反映了機(jī)體脂質(zhì)受活性氧和自由基作用后的受損程度。它可以通過(guò)改變膜結(jié)合的酶和受體的活性，使生物膜變性，導(dǎo)致細(xì)胞膜功能損傷，并且對(duì)動(dòng)脈及中樞神經(jīng)系統(tǒng)等都可產(chǎn)生一定的損傷。本實(shí)驗(yàn)結(jié)果顯示，隨著給藥時(shí)間的延長(zhǎng)，PQS組大鼠血清、心和腎組織中LPO含量與模型組大鼠相比明顯下降，表明PQS可以減輕糖尿病大鼠體內(nèi)脂質(zhì)氧化程度。

Fig 1 Effect of PQS on endothelium dependent dilation of thoracic aorta in rats(±s, n=10)

A: After-administration for 4 weeks; B: After-administration for 8 weeks; C: After-administration for 16 weeks.*P<0.05,**P<0.01vscontrol;#P<0.05,##P<0.01vsmodel

在正常的生理?xiàng)l件下，體內(nèi)抗氧化能力與氧自由基產(chǎn)生能力保持相對(duì)平衡，而在糖尿病患者中，持續(xù)的高糖以及游離脂肪酸的刺激會(huì)加速葡萄糖自動(dòng)氧化、多元醇代謝途徑活化等的一系列氧化催化反應(yīng)的發(fā)生，導(dǎo)致體內(nèi)活性氧和LPO等含量增高，而機(jī)體抗氧化酶如SOD等的活性降低，從而使氧化-抗氧化平衡失調(diào)，體內(nèi)氧化產(chǎn)物不能被及時(shí)清除而對(duì)內(nèi)皮細(xì)胞產(chǎn)生損傷[13]。SOD作為機(jī)體內(nèi)重要的氧自由基清除劑，能夠發(fā)揮抗氧化作用，其活性高低反映出機(jī)體清除氧自由基的能力[14]。在糖尿病患者體內(nèi)，高濃度的血糖會(huì)同SOD活性部位的賴(lài)氨酸相結(jié)合并發(fā)生糖基化，導(dǎo)致SOD活性下降，進(jìn)而減弱其將體內(nèi)毒性物質(zhì)超氧陰離子自由基歧化為O2和H2O2的能力，致使自由基堆積，產(chǎn)生的自由基又進(jìn)一步與不飽和脂肪酸反應(yīng)形成LPO，加劇內(nèi)皮細(xì)胞損傷。本研究結(jié)果顯示，與正常對(duì)照組相比，糖尿病模型組大鼠血清、心、腎組織中的SOD活性明顯降低。PQS組與模型組相比較，能夠明顯提高體內(nèi)SOD活性，表明PQS降低糖尿病大鼠血糖可能與其發(fā)揮抗氧化作用和清除氧自由基有關(guān)。

離體血管環(huán)實(shí)驗(yàn)是評(píng)價(jià)血管功能的經(jīng)典實(shí)驗(yàn)，可以用來(lái)反映血管內(nèi)皮依賴(lài)性和非依賴(lài)性的舒張功能。糖尿病產(chǎn)生早期，體內(nèi)血管內(nèi)皮依賴(lài)性的舒張功能即發(fā)生異常[15-16]，如內(nèi)皮細(xì)胞產(chǎn)生的舒張因子NO等的活性降低。本實(shí)驗(yàn)研究表明，與正常對(duì)照組相比較，糖尿病模型組大鼠主動(dòng)脈環(huán)對(duì)Ach的舒張反應(yīng)明顯下降，而經(jīng)過(guò)PQS處理后的大鼠胸主動(dòng)脈血管環(huán)舒張反應(yīng)明顯提高，表明PQS對(duì)血管內(nèi)皮具有保護(hù)作用。

本研究結(jié)果顯示，PQS不僅對(duì)STZ誘導(dǎo)的糖尿病大鼠血糖升高有治療作用，還能明顯抑制脂質(zhì)過(guò)氧化和減輕機(jī)體內(nèi)氧化損傷，并且能夠恢復(fù)血管內(nèi)皮依賴(lài)性舒張功能，對(duì)糖尿病血管并發(fā)癥起到一定的防治作用。提示PQS降糖機(jī)制可能與抑制脂質(zhì)過(guò)氧化、降低體內(nèi)氧化損傷、恢復(fù)血管內(nèi)皮功能有關(guān)，其詳細(xì)的藥理作用和作用機(jī)制還有待深入研究。

(致謝：本實(shí)驗(yàn)是在揚(yáng)州大學(xué)醫(yī)學(xué)院藥理實(shí)驗(yàn)室完成的，謹(jǐn)向全體課題組實(shí)驗(yàn)人員表示衷心感謝。同時(shí)也感謝吉林大學(xué)化學(xué)院天然藥物化學(xué)研究室提供的藥品及各種幫助。)

[1] Yang W, Lu J, Weng J, et al. Prevalence of diabetes among men and women in China[J].NEnglJMed, 2010,362(12):1090-101.

[2] Kim J, Montagnani M, Koh K K, et al. Reciprocal relationships between insulin resistance and endothelial dysfunction[J].Circulation, 2006,113(15):1888-904.

[3] Sohn E, Kim J, Kim C S, et al. Extract of polygonum cuspidatum attenuates diabetic retinopathy by inhibiting the high-mobility group box-1 (HMGB1) signaling pathway in streptozotocin-induced diabetic rats[J].Nutrients, 2016,8(3):140.

[4] 楊海光, 方蓮花, 杜冠華. 芒果苷的藥理作用研究進(jìn)展[J]. 中國(guó)藥理學(xué)通報(bào), 2016,32(1):5-8.

[4] Yang H G, Fang L H, Du G H. Research progress of pharmacological effectsof Mangiferin[J].ChinPharmacolBull, 2016,32(1):5-8.

[5] 王承龍, 殷惠軍, 史大卓, 等. 西洋參莖葉皂苷心血管藥理研究概述[J]. 中藥新藥與臨床藥理, 2006,17(1):76-8.

[5] Wang C L, Yin H J, Shi D Z, et al. [J]. Summary of cardiovascular pharmacological studies on Panax quinquefolium saponins[J].TraditChinDrugResPharmacol, 2006,17(1):76-8.

[6] 張酉珍, 蘇光悅, 夏曉艷, 等. 天然達(dá)瑪烷型皂苷降血糖作用的研究進(jìn)展[J]. 中草藥, 2016,47(15): 2758-63.

[6] Zhang Y Z, Su G Y, Xia X Y, et al. Research progress in hypoglycemic effect of natural dammarane saponins[J].ChinTraditHerbalDrugs, 2016,47(15):2758-63.

[7] 張 穎,陸 曙,劉育英,等. 西洋參莖葉總皂苷對(duì)冠心病血糖異常患者胰島素敏感性的影響[J]. 中國(guó)中西醫(yī)結(jié)合雜志, 2007,12(27):1066-9.

[7] Zhang Y, Lu S, Liu Y Y, et al. Effect of panax Quinquefolius saponin on insulin sensitivity in patients of coronary heart disease with blood glucose abnormality[J].ChinJIntegrTradWestMed, 2007,12(27):1066-9.

[8] 孫 莉,荀 平. 西洋參莖葉皂苷抗大鼠心肌缺血/再灌注損傷的作用及機(jī)制[J]. 中國(guó)實(shí)驗(yàn)方劑學(xué)雜志, 2014,20(24):176-9.

[8] Sun L, Xun P. Protective effects and mechanism of Panax quinquefolius Saponins on myocardial ischemia of rats[J].ChinJExpTraditMedForm, 2014,20(24):176-9.

[9] 關(guān)利新, 翟鳳國(guó), 聶 影, 等. 西洋參莖葉皂苷對(duì)腦缺血大鼠細(xì)胞凋亡及caspase-3表達(dá)的影響[J]. 中藥藥理與臨床, 2008,24(1):30-2.

[9] Guan L X, Zhai F G, Nie Y, et al. Effect of Panax quinquefolium saponins from steams and leaves on neuronal apoptosis and the expression of caspase-3 in focal cerebral ischemia injury rats[J].PharmacolClinChinMaterClinMed, 2008,24(1):30-2.

[10] Li J, Huang M, Teoh H, et al. Panax quinquefolium saponins protects low density lipoproteins from oxidation[J].LifeSci,1998,64(1):53-62.

[11] 劉德慧, 邢翔飛. 2型糖尿病大鼠模型的特點(diǎn)及評(píng)價(jià)[J]. 中國(guó)實(shí)驗(yàn)方劑學(xué)雜志, 2010,16(12):212-4.

[11] Liu D H, Xing X F. Evaluation and characteristic of rat model of type 2 diabetes[J].ChinJExpTraditMedForm, 2010,16(12):212-4.

[12] 王文清, 陶 楓, 陸 灝, 等. 糖尿病中藥抗氧化實(shí)驗(yàn)研究進(jìn)展[J]. 上海中醫(yī)藥大學(xué)學(xué)報(bào), 2012,26(5):105-8.

[12] Wang W Q, Tao F, Lu H, et al. Experimental research progress on antioxidative effect of antidiabetic herbs[J].ActaUnivTraditMedSinPharmacolShanghai, 2012,26(5): 105-8.

[13] Vessby J, Basu S, Mohsen R, et al. Oxidative stress and antioxidant status in type 1 diabetes mellitus[J].JInternMed, 2002,251(1):69-76.

[14] Xiong Z, Liu C, Wang F, et al. Protective effects of breviscapine on ischemic vascular dementia in rats[J].BiolPharmBull, 2006,29(9):1880-5.

[15] Dogra G, Rich L, Stanton K, et al. Endothelium-dependent and independent vasodilation studied at normoglycaemia in type I diabetes mellitus with and without microalbuminuria[J].Diabetologia, 2001,44(5): 593-601.

[16] Caballero A E, Arora S, Saouaf R, et al. Microvascular and macrovascular reactivity is reduced in subjects at risk for type 2 diabetes[J].Diabetes, 1999,48(9):1856-62.