銀杏內(nèi)酯B對心肌缺血再灌注損傷大鼠保護(hù)作用的研究

孟劍鋒

（河北省邢臺市人民醫(yī)院，河北 邢臺 054031）

銀杏內(nèi)酯B對心肌缺血再灌注損傷大鼠保護(hù)作用的研究

孟劍鋒

（河北省邢臺市人民醫(yī)院，河北 邢臺 054031）

目的觀察銀杏內(nèi)酯B對心肌缺血再灌注損傷大鼠的保護(hù)作用并初步探討其可能的作用機(jī)制。方法采用夾閉左冠狀動脈前降支的方法制備大鼠心肌缺血再灌注模型；設(shè)假手術(shù)組、模型組和銀杏內(nèi)酯B（15、30、60 mg/kg）組，每組20只。監(jiān)測各組大鼠心電圖波動變化；通過高頻率超聲影像系統(tǒng)檢測舒張末期左室內(nèi)徑（LVIDd）和收縮末期左室內(nèi)徑（LVIDs）、短軸縮短率（FS）、射血分?jǐn)?shù)（EF）、每搏輸出量（SV）；TTC 染色法檢測心肌梗死面積，生化分析法測定血清中心肌酶含量；HE染色法觀察心肌組織病理變化；末端標(biāo)記法（TUNEL）觀察細(xì)胞凋亡狀況。結(jié)果與模型組比較，銀杏內(nèi)酯B（15、30、60 mg/kg）組心電圖明顯改善，以銀杏內(nèi)酯 B 60 mg/kg 組最為顯著；銀杏內(nèi)酯 B（30、60 mg/kg）組 LVIDd、LVIDs顯著減?。≒<0.05），F(xiàn)S 顯著提高（P<0.01），EF、SV 顯著升高（P<0.01）；心肌組織梗死面積顯著降低（P<0.05 或P<0.01），血清心肌酶（AST、CPK、LDH）含量顯著降低（P<0.05或P<0.01）；心肌組織病變明顯改善，心肌組織凋亡細(xì)胞數(shù)明顯減少、凋亡指數(shù)（AI）顯著降低（P<0.01）。結(jié)論銀杏內(nèi)酯B對心肌缺血再灌注損傷具有一定的保護(hù)作用。

銀杏內(nèi)酯B 心肌缺血再灌注 心電圖 超聲 凋亡

銀杏葉為我國傳統(tǒng)中藥品種，《本草綱目》和《中藥志》中均有記載，其性味甘，苦，澀平，具有益心斂肺、化濕止瀉之功效?，F(xiàn)代藥學(xué)研究發(fā)現(xiàn)，萜內(nèi)酯類化合物為銀杏葉的主要有效成分，包括銀杏內(nèi)酯A、B、C、M和白果內(nèi)酯。研究表明銀杏內(nèi)酯為血小板活化因子（PAF）拮抗劑，活性最強(qiáng)的為銀杏內(nèi)酯 B（GB），既往研究發(fā)現(xiàn)銀杏內(nèi)酯B具有抗凋亡、抗氧化等多種藥理學(xué)作用［1-4］。本實(shí)驗(yàn)通過建立心肌缺血再灌注損傷大鼠模型，通過監(jiān)測心電圖波動、血液流變學(xué)、梗死面積、心肌酶含量、組織病變以及細(xì)胞凋亡等指標(biāo)變化，探討銀杏內(nèi)酯B對心肌缺血再灌注損傷的保護(hù)作用。

1 材料與方法

1.1 實(shí)驗(yàn)動物 實(shí)驗(yàn)用大鼠品系SD大鼠，清潔級，雄性，鼠齡8周齡，體質(zhì)量220～260 g，購自河北省實(shí)驗(yàn)動物中心，動物許可證號：SCXK（冀）2013-1-003。

1.2 藥物與試劑 銀杏內(nèi)酯B購自美國Sigma公司；TTC購自美國Sigma公司；TUNEL試劑盒購自南京建成生物工程研究所；AST、CPK、LDH試劑盒購自北京博奧森生物技術(shù)有限公司。

1.3 分組與造模 將100只實(shí)驗(yàn)用大鼠隨機(jī)分為假手術(shù)組，模型組，銀杏內(nèi)酯 B（15、30、60 mg/kg）組，每組20只。參照徐叔云等［5］報(bào)道的實(shí)驗(yàn)方法，通過夾閉左冠狀動脈前降支30 min的方法建立心肌缺血再灌注損傷大鼠模型，實(shí)驗(yàn)過程實(shí)施心電圖監(jiān)測，心電圖示ST段抬高或T波高聳為心肌缺血，夾閉30 min后恢復(fù)血流灌注，抬高的ST段降低或高聳的T波得以恢復(fù)表示心肌再灌注成功。假手術(shù)組行手術(shù)通路但不夾閉冠狀動脈。

1.4 給藥方法 銀杏內(nèi)酯 B（15、30、60 mg/kg）組腹腔注射給藥治療，每日1次，療程7 d。假手術(shù)組，模型組同步腹腔注射生理鹽水，每日1次。各組均造模后即刻給藥。

1.5 標(biāo)本采集與檢測 1）超聲檢測。各組隨機(jī)取10只大鼠，采用Vevo770高分辨率超聲影像系統(tǒng)于取材前行超聲檢測。于左側(cè)胸骨旁取左室乳頭肌水平短軸切面，測量舒張末期左室內(nèi)徑（LVIDd）、收縮末期左室內(nèi)徑（LVIDs）、短軸縮短率（FS）、射血分?jǐn)?shù)（EF）、每搏輸出量（SV），所有檢測指標(biāo)均取連續(xù)3個心動周期的平均值。2）TCC染色法測定心肌組織梗死面積。取心臟組織置-20℃凍存20 min后切片，2%TTC溶液（恒溫37℃、避光）孵育15 min，灰白色為梗死區(qū)，采用醫(yī)用圖像分析系統(tǒng)分析心肌組織梗死面積。3）血清中心肌酶含量的測定。經(jīng)腹主動脈取血并離心（1500 r/min，10 min）取血清，通過生化分析儀測定血清中心肌酶（AST、CPK、LDH）含量。4）心肌組織病變及心肌細(xì)胞凋亡的觀察。取心臟組織并置于4%多聚甲醛溶液中72 h進(jìn)行固定，經(jīng)常規(guī)脫水、石蠟包埋、切片和脫蠟水化處理后，HE染色并通過倒置光學(xué)顯微鏡觀察心肌組織病變，TUNEL染色后通過倒置光學(xué)顯微鏡觀察各組大鼠心肌細(xì)胞凋亡狀況。凋亡指數(shù)（AI）計(jì)算：每張TUNEL染色切片選取不重疊的6個視野，分別計(jì)數(shù)每個視野中的細(xì)胞總數(shù)和凋亡細(xì)胞數(shù)，各組取平均值后計(jì)算 AI：AI（%）=（陽性細(xì)胞數(shù)/細(xì)胞總數(shù)）×100%

1.6 統(tǒng)計(jì)學(xué)處理 應(yīng)用SPSS15.0統(tǒng)計(jì)軟件。計(jì)量資料以（±s）表示，組間均數(shù)兩兩比較采用t檢驗(yàn)，計(jì)數(shù)資料采用χ2檢驗(yàn)。P<0.05為差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

2 結(jié) 果

2.1 各組心電圖監(jiān)測結(jié)果比較 與假手術(shù)組大鼠比較，模型組及銀杏內(nèi)酯B各劑量組大鼠結(jié)扎左冠狀動脈前降支后出現(xiàn)左心室前壁呈灰白，而后逐漸呈現(xiàn)紫紺的癥狀，心電圖示ST段抬高或T波高聳，提示急性心肌梗死大鼠模型造模成功。經(jīng)銀杏內(nèi)酯B干預(yù)治療7 d后，缺血再灌注損傷大鼠心電圖波形明顯改善，其中銀杏內(nèi)酯B 60 mg/kg組心電圖波形基本恢復(fù)正常。見圖1。

圖1 各組大鼠心電圖

2.2 各組大鼠超聲檢測結(jié)果比較 見表1。與假手術(shù)組大鼠比較，模型組大鼠LVIDd、LVIDs顯著升高（P<0.05 或P<0.01），F(xiàn)S、EF、SV 顯著降低（P<0.01）；而與模型組比較，銀杏內(nèi)酯 B 30、60 mg/kg組 LVIDd、LVIDs顯著減小 （P<0.05），F(xiàn)S 顯著提高 （P<0.01），EF、SV 顯著升高（P<0.05或P<0.01）。

表1 各組大鼠超聲檢測結(jié)果比較（±s）

表1 各組大鼠超聲檢測結(jié)果比較（±s）

與假手術(shù)組比較，*P＜0.05，**P＜0.01；與模型組比較，△P＜0.05，△△P＜0.01。下同。

組 別 n假手術(shù)組 10模型組 10銀杏內(nèi)酯B 15 mg/kg組 10 EF（%） SV（μL）72.81±7.34 190.25±24.80 29.37±4.50** 78.14±17.65**33.74±4.83 86.40±19.27銀杏內(nèi)酯 B 30 mg/kg組 10 6.87±0.22△ 5.47±0.35△ 26.08±5.42△△ 36.29±5.16△ 107.53±18.24△銀杏內(nèi)酯 B 60 mg/kg組 10 6.74±0.26△ 5.03±0.31△△ 28.62±5.83△△ 46.03±7.24△△ 119.02±21.51△△LVIDd（mm） LVIDs（mm） FS（%）6.68±0.25 3.90±0.28 42.95±7.16 7.23±0.27* 6.18±0.39** 15.34±3.28**7.01±0.30 5.92±0.43 18.71±4.15

2.3 各組心肌組織梗死面積測定結(jié)果比較 見表2。模型組心肌組織梗死面積較假手術(shù)組顯著升高（P<0.01）；銀杏內(nèi)酯B 30、60 mg/kg組梗死面積與模型組比較，顯著降低（P<0.05或P<0.01）。

表2 各組大鼠血清心肌酶含量及心梗面積比較（±s）

表2 各組大鼠血清心肌酶含量及心梗面積比較（±s）

?

2.4 各組心肌酶含量比較 見表2。模型組血清心肌酶（AST、CPK、LDH）含量較模型組均顯著升高（P<0.01）；與模型組比較，銀杏內(nèi)酯B 30、60 mg/kg組血清AST、CPK、LDH含量均顯著降低（P<0.05或P<0.01）。

2.5 各組心肌組織病變觀察結(jié)果比較 見圖2。經(jīng)HE染色后觀察病理切片，假手術(shù)組心肌組織結(jié)構(gòu)、細(xì)胞形態(tài)均未見明顯異常；模型組心肌組織呈現(xiàn)肌原纖維斷裂、排列紊亂，心肌細(xì)胞呈空泡變性，細(xì)胞質(zhì)著色不均，胞核深染等病理性改變；與模型組比較，銀杏內(nèi)酯B 15、30、60 mg/kg組心肌缺血再灌注損傷大鼠心肌組織病變呈現(xiàn)不同程度改善，以銀杏內(nèi)酯B 60 mg/kg組效果最為顯著。

圖2 各組大鼠心肌組織形態(tài)（HE染色，200倍）

2.6 心肌細(xì)胞凋亡狀況觀察結(jié)果 經(jīng)TUNEL染色后觀察，模型組心肌細(xì)胞凋亡數(shù)量較假手術(shù)組明顯增多；與模型組比較，銀杏內(nèi)酯B 15、30、60 mg/kg組心肌細(xì)胞凋亡數(shù)量明顯減少，以銀杏內(nèi)酯B 60 mg/kg組最為顯著，見圖 3。 模型組心肌細(xì)胞 AI［（57.42±9.76）%］較假手術(shù)組 AI（0）顯著升高（P<0.01）；銀杏內(nèi)酯 B 15、30、60 mg/kg 組 AI分別為 （46.08±7.93）%、（39.32±7.58）%、（26.72±5.89）%；與模型組比較，銀杏內(nèi)酯 B 30、60 mg/kg組AI顯著降低（P<0.05或P<0.01）。

3 討 論

隨著高血壓、高血脂等基礎(chǔ)疾病發(fā)病率的提高，冠狀動脈粥樣硬化性心臟?。–HD）以及由其所引發(fā)的急性心肌梗死（AMI）發(fā)病率逐年升高，嚴(yán)重危害著人類的生命健康［6-7］。及時(shí)通過藥物或介入手術(shù)溶栓以實(shí)現(xiàn)血流恢復(fù)灌注是目前臨床上治療AMI的主要方案，但缺血再灌注損傷并發(fā)癥嚴(yán)重影響著AMI預(yù)后。缺血再灌注損傷病理機(jī)制非常復(fù)雜，既往研究發(fā)現(xiàn)心功能異常、氧化應(yīng)激損傷、炎癥反應(yīng)以及繼發(fā)性心肌細(xì)胞凋亡是缺血再灌注損傷發(fā)生發(fā)展的重要病理機(jī)制［8-12］，這也為我們研發(fā)能夠有效降低缺血再灌注損傷的新型藥物提供了思路。

圖3 各組大鼠心肌細(xì)胞凋亡狀況（TUNEL，400倍）

心電圖ST段抬高或T波高聳是急性心梗死的典型表現(xiàn)，本研究采用結(jié)扎左冠狀動脈前降支的方法制備急性心肌梗死大鼠模型，造模過程全程實(shí)施心電圖監(jiān)測，發(fā)現(xiàn)結(jié)扎左冠狀動脈前降支后出現(xiàn)左心室前壁呈灰白、紫紺的癥狀，心電圖示ST段抬高或T波高聳，提示造模成功。該造模方法操作簡單、成功率高且與臨床AMI癥狀接近，是目前AMI動物實(shí)驗(yàn)研究常用的造模方法［13］。銀杏內(nèi)酯B是我國傳統(tǒng)中藥銀杏葉的主要活性成分之一，具有抗凋亡、抗氧化、抗炎等多種藥理學(xué)作用［1-4，14-15］。本實(shí)驗(yàn)研究發(fā)現(xiàn)：經(jīng)銀杏內(nèi)酯 B 治療能夠有效改善心肌缺血再灌注損傷大鼠心電圖波形，有效降低 LVIDd 和 LVIDs，提高 FS、EF、SV；顯著降低血清心肌酶（AST、CPK、LDH）含量，改善心肌組織病變，減小心肌組織梗死面積，提示銀杏內(nèi)酯B對心肌缺血再灌注損傷具有一定的保護(hù)作用。

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R285.5

A

1004-745X（2017）11-1977-03

10.3969/j.issn.1004-745X.2017.11.028

2017-05-06）