頸迷走神經(jīng)刺激對(duì)大鼠心肌IR炎癥反應(yīng)和細(xì)胞凋亡的影響

雷玉華，趙勁波，張長(zhǎng)江，李元紅

頸迷走神經(jīng)刺激對(duì)大鼠心肌IR炎癥反應(yīng)和細(xì)胞凋亡的影響

雷玉華，趙勁波，張長(zhǎng)江，李元紅

目的探討頸迷走神經(jīng)刺激(CVNS)對(duì)大鼠心肌缺血再灌注(IR)炎癥和細(xì)胞凋亡的影響。方法24只成年雄性SPF級(jí)大鼠(200 g～250 g)，隨機(jī)分為假手術(shù)組(SO，n=8)、缺血再灌注組(I/R，n=8)和頸迷走神經(jīng)刺激+I/R組(CVNS+I/R，n=8)。選用I/R模型(缺血30 min，再灌注4 h)。3組均分離左側(cè)頸迷走神經(jīng)干，僅CVNS+I/R組給予電刺激(10 Hz，2 ms)，電壓以心率降低10%為標(biāo)準(zhǔn)。選用Biopac軟件記錄大鼠再灌注時(shí)肢導(dǎo)心電圖。再灌注4 h后取頸靜脈血和心肌組織，分別檢測(cè)心肌損傷標(biāo)志物：肌酸激酶(CK)和肌鈣蛋白I(cTnI)；炎癥因子：腫瘤壞死因子α(TNF-α)、干擾素γ(INF-γ)和白介素6(IL-6)；凋亡蛋白Caspase-3、Bcl-2和Bax水平，Tunel檢測(cè)凋亡指數(shù)(AI)。結(jié)果與SO組比較，I/R組中CK、cTnI、TNF-α、INF-γ、IL-6、caspase-3和AI顯著增高，Bcl-2/Bax值減小，CVNS可以顯著抑制I/R引起的CK、cTnI、TNF-α、INF-γ、IL-6、caspase-3和AI的增高，增加Bcl-2/Bax比值。結(jié)論CVNS可以通過(guò)抑制大鼠心肌細(xì)胞炎癥反應(yīng)和凋亡減輕心肌IR損傷。

心肌缺血；再灌注損傷；心肌細(xì)胞；炎癥反應(yīng)；細(xì)胞凋亡；大鼠

早期再灌注治療是臨床上治療心肌梗死最有效的方法，然而再灌注治療本身也會(huì)引起心肌細(xì)胞損傷，這種現(xiàn)象成為心肌缺血再灌注(IR)損傷。前期研究證實(shí)，急性心肌缺血而不給予再灌注治療，缺血區(qū)梗死面積達(dá)70%，給予再灌注治療后心肌梗死面積仍有30%，而給予有效的方法預(yù)防再灌注損傷時(shí)，心肌梗死面積僅有5%[1]。可見(jiàn)如何減輕IR損傷，對(duì)挽救病人心肌改善預(yù)后具有重要意義。近年來(lái)隨著我國(guó)急診經(jīng)皮冠脈介入(PCI)治療的增多，如何預(yù)防和治療IR損傷應(yīng)該給予更多的重視。

近年來(lái)研究發(fā)現(xiàn)心肌缺血往往伴隨著自主神經(jīng)失衡，表現(xiàn)為交感神經(jīng)過(guò)度激活，迷走神經(jīng)活性相對(duì)減弱，自主神經(jīng)失衡是加重心肌損傷、誘發(fā)室性心律失常的重要原因[2]。近期很多的研究試圖找到改善自主神經(jīng)失衡的有效方法，如腎動(dòng)脈消融、星狀神經(jīng)節(jié)消融、心臟GP刺激和迷走神經(jīng)刺激等，其中頸迷走神經(jīng)刺激(CVNS)是一種安全且有效的方法[3-4]。迷走神經(jīng)刺激可以顯著抑制炎癥反應(yīng)，減輕心肌損傷[5]。炎癥是心肌IR損傷和心肌細(xì)胞凋亡的重要機(jī)制之一。CVNS是否可以通過(guò)抑制炎癥，減輕心肌細(xì)胞凋亡和心肌損傷，這是本研究設(shè)計(jì)的內(nèi)容。

1 材料與方法

1.1 分組 選用成年雄性SD大鼠(200 g～250 g)，購(gòu)于武漢大學(xué)動(dòng)物實(shí)驗(yàn)中心。將24只大鼠隨機(jī)分為3組。假手術(shù)組(SO組，n=8)：大鼠麻醉后開(kāi)胸，前降支下穿線但不結(jié)扎；缺血再灌注組(I/R組，n=8)：前降支扎閉30 min后，再灌2 h；頸迷走神經(jīng)刺激+缺血再灌注組(VNS+I/R組，n=8)：前降支扎閉時(shí)開(kāi)始給予頸迷走神經(jīng)電刺激，至再灌注2 h結(jié)束。用2%的戊巴比妥鈉(45 mg/kg，ip)麻醉后，將大鼠仰臥固定于鼠板，氣管插管，連接小動(dòng)物呼吸機(jī)(70次/min)，記錄肢導(dǎo)心電圖(BIOPAC，美國(guó))，直至再灌注結(jié)束。開(kāi)胸后，將大鼠前降支與一段帶凹槽的中空乳膠管用5-0線一同結(jié)扎，30 min后剪斷結(jié)扎線，再灌注2 h。結(jié)扎后心尖部變白和心電圖Ⅱ?qū)нBST段抬高表示缺血成功。2 h再灌注后，經(jīng)頸靜脈采血2 mL，靜置后離心，取上清，凍存于-80℃冰箱至檢測(cè)。迅速剪取心臟，清洗后，留取左室心尖區(qū)(梗死+缺血區(qū))心肌，凍存于-80℃冰箱至檢測(cè)。

1.2 心肌損傷標(biāo)志物檢測(cè) 檢測(cè)大鼠血清中CK和cTnI水平，評(píng)價(jià)心肌損傷情況。選用南京建成生物工程所試劑盒，檢測(cè)血清LDH和CTnI水平。

1.3 炎癥因子TNF-α、INF-γ和IL-6檢測(cè) 檢測(cè)心肌組織TNF-α、INF-γ和IL-6的表達(dá)評(píng)價(jià)炎癥反應(yīng)水平。選用武漢建成生物工程所試劑盒，檢測(cè)心肌組織TNF-α、INF-γ和IL-6的表達(dá)水平。

1.4 TUNEL檢測(cè) 采用TUNEL染色評(píng)價(jià)心肌細(xì)胞凋亡率。I/R組和VNS+I/R組中心肌組織經(jīng)固定、包埋、切片、脫蠟和水化后，嚴(yán)格按照TUNEL試劑盒(羅氏應(yīng)用科學(xué)公司，美國(guó))和DAB染色試劑盒(武漢博士德生物工程研究所，中國(guó))說(shuō)明操作，凋亡細(xì)胞核被染成棕色，正常細(xì)胞核為藍(lán)色，在×200倍顯微鏡觀察，計(jì)算凋亡指數(shù)(AI)=棕色核細(xì)胞數(shù)/總細(xì)胞數(shù)×100%。

1.5 Western blot檢測(cè) 采用WB法檢測(cè)凋亡蛋白caspase-3，Bcl-2和Bax的表達(dá)。方法如前所述[6]，簡(jiǎn)言之，采用12%PAGE膠，電泳轉(zhuǎn)膜后，選用5%脫脂奶粉封閉，4℃孵育一抗[抗caspase-3(1∶100稀釋?zhuān)錆h三鷹，中國(guó))，抗Bcl-2(1∶500，santa，美國(guó))，抗Bax(1∶800，bioworld，美國(guó))]過(guò)夜，用相應(yīng)的二抗孵育后，ECL顯色，以β-actin為內(nèi)參，計(jì)算三種凋亡蛋白的相對(duì)表達(dá)量。

2 結(jié) 果

2.1 血清中LDH和cTnI表達(dá) 與SO組比較，I/R組中LDH和cTnI的表達(dá)顯著升高(Plt;0.05)；與I/R組比較，CVNS+I/R組中，LDH和cTnI的表達(dá)顯著下降(Plt;0.05)。詳見(jiàn)表1。

表1 CVNS對(duì)心肌損傷和炎癥因子的影響(±s)

2.2 心肌細(xì)胞炎癥反應(yīng) 與SO比較，I/R組中炎癥因子TNF-α、INF-γ和IL-6的表達(dá)水平顯著升高(Plt;0.05)。與IR組比較，CVNS可以限制抑制TNF-α、INF-γ和IL-6的表達(dá)。詳見(jiàn)表1。

2.3 心肌細(xì)胞凋亡 選用AI和凋亡蛋白(caspase-3，Bcl-2/Bax)表達(dá)水平評(píng)價(jià)心肌細(xì)胞凋亡。與SO組比較，I/R組中AI值和caspase-3表達(dá)顯著增加，Bcl-2/Bax比值減小(Plt;0.05)，而VNS可抑制I/R誘導(dǎo)的AI增加、caspase-3高表達(dá)和Bcl-2/Bax值的減小(Plt;0.05)。詳見(jiàn)表2。

表2 CVNS對(duì)心肌細(xì)胞凋亡的影響(±s)

3 討 論

前期研究證實(shí)，迷走神經(jīng)刺激在多種心血管疾病中均有保護(hù)作用，如缺血性心肌病、心衰和心律失常等[3，7-8]。本研究發(fā)現(xiàn)，CVNS可以顯著抑制心肌損傷標(biāo)志物CK和cTnI的表達(dá)，即減輕心肌IR損傷。這與前期的研究結(jié)果一致[9]。

炎癥是心肌IR損傷的重要機(jī)制之一。近年研究發(fā)現(xiàn)，迷走神經(jīng)和免疫炎癥間可以相互調(diào)控，迷走神經(jīng)刺激可以顯著抑制炎癥反應(yīng)水平[10]。本研究發(fā)現(xiàn)，CVNS可以顯著抑制IR中心肌細(xì)胞的炎癥因子TNF-α、INF-γ和IL-6的表達(dá)，進(jìn)一步印證了上述結(jié)論。究其機(jī)制可能與α7膽堿能受體有關(guān)。Hu等[11]的研究發(fā)現(xiàn)，迷走神經(jīng)刺激對(duì)心肌IR損傷有保護(hù)作用，其機(jī)制與激活α7膽堿能抗炎通路有關(guān)。α7膽堿能受體激活后可以激活下游兩面激酶(JAK)和核因子(NF)κB通路，進(jìn)而抑制炎癥因子TNF-α和IL-6的表達(dá)[12]。 本實(shí)驗(yàn)中CVNS通過(guò)激活α7膽堿能通路抑制心肌IR炎癥反應(yīng)。

心肌細(xì)胞凋亡是I/R損傷的重要機(jī)制之一，研究證實(shí)，通過(guò)基因敲除技術(shù)抑制心肌細(xì)胞凋亡，可以減少I(mǎi)/R中心肌梗死面積，減少程度高達(dá)50%[13]。 Bcl-2家族成員由抗凋亡蛋白(Bcl-2)和促凋亡蛋白(Bax)組成，二者間表達(dá)的平衡決定了心肌細(xì)胞的命運(yùn)。I/R中活性氧的過(guò)度生成和炎癥反應(yīng)的過(guò)度激活可以誘導(dǎo)促凋亡蛋白Bax的過(guò)表達(dá)，Bcl-2/Bax值減小，促發(fā)心肌細(xì)胞凋亡[14]。

迷走神經(jīng)刺激可以顯著增加抗凋亡蛋白Bcl-2表達(dá)，抑制促凋亡蛋白Bax的表達(dá)，增加Bcl-2/Bax值，減少AI值，抑制心肌細(xì)胞凋亡。 VNS可以通過(guò)調(diào)節(jié)Bcl-2/Bax值，抑制I/R誘導(dǎo)的心肌細(xì)胞凋亡。

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2017-03-21)

(本文編輯 王雅潔)

R285.2

A

10.3969/j.issn.1672-1349.2017.21.010

1672-1349(2017)21-2697-03

湖北省恩施土家族苗族自治州中心醫(yī)院 (湖北恩施 445000)

李元紅，E-mail：yuanhongwhu@126.com

信息：雷玉華，趙勁波，張長(zhǎng)江，等.頸迷走神經(jīng)刺激對(duì)大鼠心肌IR炎癥反應(yīng)和細(xì)胞凋亡的影響[J].中西醫(yī)結(jié)合心腦血管病雜志，2017，15(21)：2697-2699.