止顫湯參與帕金森病大鼠自噬途徑中P62調(diào)節(jié)α-突觸核蛋白的研究

黃寧?kù)o，Wei Jianning，李文濤

止顫湯參與帕金森病大鼠自噬途徑中P62調(diào)節(jié)α-突觸核蛋白的研究

黃寧?kù)o，Wei Jianning，李文濤

目的觀察止顫湯調(diào)節(jié)帕金森病(PD)大鼠自噬途徑中P62與α-突觸核蛋白(α-Syn)表達(dá)的研究。方法采用lactacystin注射于大鼠腦部黑質(zhì)造成PD模型，實(shí)驗(yàn)設(shè)立對(duì)照組、PD模型組、中藥組，并采用Western blot及PCR法觀察3組大鼠P62與α-Syn的表達(dá)情況。結(jié)果免疫印跡顯示，P62及α-Syn在對(duì)照組、模型組、中藥組的含量為(0.27±0.03，0.23±0.03；0.73±0.07，0.51±0.02；0.38±0.16，0.37±0.03)，模型組較對(duì)照組明顯升高(Plt;0.01)，中藥組與對(duì)照組相比基本接近(Pgt;0.05)。與模型組相比有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(Plt;0.01)；PCR結(jié)果提示，P62及α-Syn在3組的含量為(0.45±0.05，0.17±0.07；8.93±1.68，10.81±1.9；2.66±0.96，1.65±0.76)，模型組的含量較對(duì)照組明顯上升(Plt;0.01)，中藥組與模型組相比數(shù)值下降，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(Plt;0.05)。結(jié)論止顫湯可以調(diào)節(jié)自噬途徑中的P62蛋白，降低α-Syn的表達(dá)，可能是止顫湯治療帕金森病的機(jī)制。

帕金森?。恢诡潨?；自噬；P62；α-突觸核蛋白；大鼠

帕金森病(Parkinson’s disease，PD)是最常見(jiàn)的慢性神經(jīng)系統(tǒng)退行性病變之一[1]，美國(guó)有100萬(wàn)人口患有此種疾病，而且以每年新增5萬(wàn)多新病例的速度增加，據(jù)統(tǒng)計(jì)，65歲以上人群中，帕金森病有1%發(fā)病率，隨著人口老齡化，帕金森病病人越來(lái)越多。目前在治療上，左旋多巴替代療法在緩解PD病人癥狀上有一定療效，但同時(shí)也會(huì)出現(xiàn)一些嚴(yán)重的毒副作用，且不能有效阻止病情的發(fā)展。而外科手術(shù)有創(chuàng)傷，代價(jià)昂貴，適應(yīng)對(duì)象受限，不是一種理想方法。神經(jīng)移植治療或基因治療PD目前都只是處于臨床前研究階段。因此，PD已成為神經(jīng)領(lǐng)域研究熱點(diǎn)。

研究顯示，PD的中樞神經(jīng)系統(tǒng)中可以見(jiàn)到α-突觸核蛋白(α-Synuclein)[2]的異常聚集，這是由于承擔(dān)清除異常蛋白的自噬途徑?jīng)]有正常發(fā)揮代謝α-Syn的功能。自噬目前被認(rèn)為是參與了PD發(fā)病。調(diào)節(jié)自噬可能是治療PD的一個(gè)有效方法。而P62參與體內(nèi)自噬蛋白降解過(guò)程，前期研究中也提示，當(dāng)藥物阻斷自噬途徑時(shí)，通過(guò)不同方式均檢測(cè)到P62的表達(dá)有所增加，已有文獻(xiàn)報(bào)道，P62的缺失增加了α-Syn這個(gè)病理特征[3]。開(kāi)發(fā)調(diào)節(jié)自噬，針對(duì)α-Syn及其相關(guān)靶點(diǎn)的藥物，可能是控制PD進(jìn)程的有效途徑。本研究試圖運(yùn)用中藥止顫湯治療PD大鼠，觀察大鼠大腦黑質(zhì)中P62與α-Syn的含量變化，從而進(jìn)一步驗(yàn)證P62與α-Syn的關(guān)聯(lián)，探討中醫(yī)藥從自噬途徑對(duì)PD的調(diào)節(jié)作用。

1 材料與方法

1．1 藥物組成及制備 止顫湯為上海市中醫(yī)醫(yī)院名老中醫(yī)李如奎教授經(jīng)驗(yàn)方，劑量：黃芪15 g，丹參9 g，鉤藤18 g，知母12 g，白芍12 g，制大黃15 g，升麻9 g。加水煎煮2次，第1次加6倍量水，煎煮1 h；第2次加4倍量水，煎煮45 min，煎液分別濾過(guò)，合并濃縮至生藥1.28 g/mL，攪勻，分裝即得。

1．2 實(shí)驗(yàn)動(dòng)物 成年雄性SD大鼠18只，體質(zhì)量180 g～220 g。

1.3 帕金森病大鼠模型制備 將18只大鼠隨機(jī)分為實(shí)驗(yàn)組(12只)與對(duì)照組(6只)。實(shí)驗(yàn)組所有動(dòng)物均經(jīng)反復(fù)行為測(cè)試后，確認(rèn)其無(wú)旋轉(zhuǎn)行為后進(jìn)行實(shí)驗(yàn)。腹腔注射2%戊巴比妥鈉(45 mg/kg)麻醉，顱平位固定于腦立體定位儀上。大鼠頭部局部常規(guī)消毒后，剪開(kāi)頭皮，剝離骨膜，參照包新民等[4]所著大鼠腦立體定位圖譜確定左側(cè)黑質(zhì)致密部(SNC)和黑質(zhì)紋狀體通路(VTA)兩坐標(biāo)：①SNC前囟后5．0 mm，矢狀縫左側(cè)1．7 mm，顱骨表面下7．6 mm。②VTA前囟后4．6 mm，矢狀縫左側(cè)0．9 mm，顱骨表面下7．5 mm；并根據(jù)大鼠體重和頭顱大小在規(guī)定范圍內(nèi)確定具體坐標(biāo)，并用三棱針進(jìn)行標(biāo)記，用牙科鉆小心鉆透顱骨，按確定坐標(biāo)將微量注射器緩慢進(jìn)入預(yù)定深度。實(shí)驗(yàn)組向每點(diǎn)注射lactacystin 8 μg(4 μL)，對(duì)照組則注射等體積生理鹽水，深度以針孔斜面中點(diǎn)為參照點(diǎn)，以顱骨下硬腦膜處為零點(diǎn)，以1 μL/min的速度緩慢旋轉(zhuǎn)推藥，注射完畢后留針10 min，緩慢退針，術(shù)后常規(guī)縫合傷口，連續(xù)腹腔注射青霉素104U/(kg·d )，持續(xù)1周以防感染，局部傷口每日碘酒消毒1次，7 d后拆線。

1.4 模型成功評(píng)價(jià)標(biāo)準(zhǔn) 術(shù)后1 周起，每隔7 d于09：00時(shí)進(jìn)行行為學(xué)檢測(cè)，阿撲嗎啡(APO)0．5 mg/kg腹腔注射。在直徑為40 C1TI的塑料盆中觀察大鼠的旋轉(zhuǎn)行為。記錄注射后5 min大鼠的旋轉(zhuǎn)次數(shù)，同時(shí)觀察其行為學(xué)變化，連續(xù)測(cè)試3周。若連續(xù)觀察30 min，大鼠恒定向右側(cè)旋轉(zhuǎn)，平均轉(zhuǎn)速gt;7 r/min，視為成功PD模型大鼠；若小于7 r/min的右轉(zhuǎn)鼠或左轉(zhuǎn)鼠、不轉(zhuǎn)鼠均被淘汰。

1.5 分組與給藥 將造模成功的12只實(shí)驗(yàn)組PD模型大鼠采用隨機(jī)數(shù)字法，篩選出模型組和中藥組各6只，其余6只腦內(nèi)注射生理鹽水未出現(xiàn)旋轉(zhuǎn)行為的大鼠作為對(duì)照組。中藥組用止顫湯灌胃，PD大鼠每公斤體重給藥量按成年人(60 kg)每公斤體重劑量的10倍計(jì)算，溶于生理鹽水中，1．2 mL/100 g灌胃，給藥時(shí)間為09：00～10：00，每日1次。每周稱體重一次，按體重調(diào)整給藥量，連續(xù)給藥4 周。模型組和對(duì)照組每日按體重給予等量生理鹽水灌胃。

1.6 觀察指標(biāo)

1.6.1 Western Blot檢測(cè)細(xì)胞內(nèi)P62及α-Synuclein蛋白表達(dá) 斷頭處死動(dòng)物，迅速取腦并在冰盒上分離紋狀體區(qū)，將其分裝于液氮中凍存。將液氮中的腦組織樣本取去融化，胞漿裂解液提取組織胞漿蛋白，測(cè)蛋白濃度后分裝置于-70℃保存上樣前加入5×SDS加樣緩沖液煮沸10 min，20 g蛋白質(zhì)樣品用10%SDS-PAGE分離后，350 mA恒流濕法電轉(zhuǎn)移1 h至硝酸纖維素膜(NC膜)，5%脫脂奶粉室溫封閉1 h。

P62的檢測(cè)：用第一抗體在4 ℃溫育過(guò)夜。以下抗體：抗兔LC3B(1∶500)，抗小鼠β-actin(1∶1000)，抗兔P62 / SQSTM1，抗小鼠ubiquitin。充分洗滌后，在室溫用二抗孵育1 h，所用的二抗是的抗兔(1∶5 000)和抗小鼠(1∶10 000)進(jìn)行檢測(cè)。

α-Synuclein的檢測(cè)：滴加抗α-synuclein(1∶500)，抗ubiquitin(1∶500)過(guò)夜，TBS洗膜3次，滴加Cy3標(biāo)記(發(fā)紅光)的抗小鼠二抗稀釋液(1∶500)室溫孵育1 h，洗膜3次，滴加免疫印跡發(fā)光試劑(ECL試劑)于NC膜上，室溫反應(yīng)5 min。在暗室內(nèi)曝光，沖洗膠片。

1.6.2 RT-PCR檢測(cè)細(xì)胞內(nèi)P62及α-Synuclein mRNA表達(dá) 將組織樣本排放在管架，室溫待解凍，依次將各組組織(剪取米粒大小)轉(zhuǎn)移至12×55 mm去核酶試管中，依次每一管中加入1 mL Trizol(預(yù)冷)。電動(dòng)勻漿器(轉(zhuǎn)速10 000 r/min)處理(30～45) s。每標(biāo)本間處理后用酒精(75%乙醇的配置∶1倍的DEPC處理水加3倍的無(wú)水乙醇)棉球擦拭，DEPC處理水清洗。各管中加入氯仿200 μL，激烈振蕩15 s，4℃，12 000 r/min，離心10 min 。小心吸出水層加入依次編號(hào)的Eppendorf管中，再加入二倍體積的異丙醇(約600 μL)，混勻，置于-20℃冰箱，30 min，4 ℃，10 000 r/min，離心10 min。棄上清留沉淀。用650 μL 75%乙醇洗滌沉淀，4℃，8 000 r/min，離心5 min，棄上清留沉淀。重復(fù)步驟一遍，充分吸盡殘留液，打開(kāi)管蓋，干式恒溫器65℃，(5～10)min，烘干，20 μL DEPC處理水，溶解RNA，-20℃冰箱，保存，待用。并進(jìn)行逆轉(zhuǎn)錄及PCR。

2 結(jié) 果

2.1 兩組Western blot比較 對(duì)照組P62的含量為0.27±0.03，模型組的含量為0.73±0.07，數(shù)值較對(duì)照組明顯升高(Plt;0.01)，中藥組為0.38±0.16，與對(duì)照組相比基本接近，差異無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(Pgt;0.05)。與模型組相比有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(Plt;0.01)；對(duì)照組α-syn含量為0.23±0.03，模型組的含量為0.51±0.02，數(shù)值比對(duì)照組明顯上升(Plt;0.01)，中藥組為0.37±0.03，與對(duì)照組相比基本接近(Pgt;0.05)。與模型組相比有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(Plt;0.01)。詳見(jiàn)圖1。

注：n為對(duì)照組；中為中藥組；M為模型組。

2.2 兩組PCR檢測(cè) 對(duì)照組P62的含量為0.45±0.05，模型組的含量為8.93±1.68，較對(duì)照組明顯上升(Plt;0.01)，而中藥組為2.66±0.96，與模型組相比數(shù)值下降(Plt;0.05)。對(duì)照組α-syn的含量為0.17±0.07，模型組的含量為10.81±1.9，較對(duì)照組有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(Plt;0.01)，而中藥組為1.65±0.76，與模型組相比數(shù)值下降，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(Plt;0.05)。

3 討 論

帕金森病是威脅老年社會(huì)人類健康的重大疾病。目前藥物及手術(shù)、基因治療都不是非常理想的選擇，由于其發(fā)病率增加及其不可根治性等特點(diǎn)，PD已成為神經(jīng)領(lǐng)域研究熱點(diǎn)。

有研究表明，PD等神經(jīng)退行性疾病都是以異常蛋白質(zhì)在中樞神經(jīng)系統(tǒng)大量積聚為特征。帕金森病具有蛋白聚集體在胞內(nèi)沉積、路易小體及路易神經(jīng)突的特點(diǎn)，α-Synuclein(α-突觸核蛋白)[2]是組成它們的主要成分。有報(bào)道顯示，過(guò)度表達(dá)、異常修飾或者突變?chǔ)?Syn能損傷黑質(zhì)，也有很多研究證明了突變的α-Synuclein如沒(méi)有被及時(shí)清除，導(dǎo)致在細(xì)胞內(nèi)聚集，形成寡聚體，就會(huì)發(fā)生PD[5-6]。黑質(zhì)致密部神經(jīng)細(xì)胞體內(nèi)的α-Synuclein異常聚集是PD的病理形態(tài)學(xué)標(biāo)志。

眾多研究表明，α-Synuclein蛋白溶酶體途徑降解主要通過(guò)自噬途徑中的巨自噬方式[7-10]。自噬是細(xì)胞內(nèi)過(guò)多或異常的細(xì)胞器及其周圍的蛋白質(zhì)和部分細(xì)胞質(zhì)被雙層膜所包裹形成自噬體，隨后自噬體與溶酶體融合并且降解其所包裹的內(nèi)容物[11-12]。在哺乳動(dòng)物細(xì)胞中，蛋白質(zhì)的降解信號(hào)都是泛素化。為了使目標(biāo)蛋白發(fā)生自噬性降解，P62作為泛素化修飾的靶蛋白能夠結(jié)合到自噬受體上[13]，并可以與自噬體膜蛋白LC3相互作用，從而能夠把泛素化的蛋白質(zhì)運(yùn)送到自噬體內(nèi)降解，而它本身也通過(guò)自噬系統(tǒng)代謝[14]。目前文獻(xiàn)報(bào)道，自噬積極參與了PD的發(fā)病[15]，前期的神經(jīng)變性疾病研究中也提示[16]，P62與自噬途徑關(guān)系密切，一旦自噬系統(tǒng)阻斷，P62含量就會(huì)提高。因此開(kāi)發(fā)調(diào)節(jié)自噬，針對(duì)α-Synuclein及其相關(guān)靶點(diǎn)的藥物，可能是控制PD進(jìn)程的有效途徑。

可以說(shuō)自噬是一個(gè)機(jī)體凈化機(jī)制，通過(guò)降解胞質(zhì)內(nèi)受損的結(jié)構(gòu)，來(lái)改善微環(huán)境，維持細(xì)胞的動(dòng)態(tài)平衡。這與從中醫(yī)角度，在機(jī)體臟腑功能失調(diào)下內(nèi)生邪熱痰濁瘀血之實(shí)邪的自我清除，以維持內(nèi)環(huán)境的陰陽(yáng)平衡的機(jī)制是相一致的。而中醫(yī)藥歷來(lái)重視整體調(diào)理，中藥組方配伍靈活，對(duì)疾病可兼顧局部和整體，多途徑、多靶點(diǎn)地進(jìn)行綜合干預(yù)。本次研究通過(guò)中藥干預(yù)自噬途徑中的P62，加強(qiáng)α-Syn的代謝，從而治療PD。中醫(yī)藥治療帕金森病大鼠，觀察大鼠的α-synuclein的表達(dá)，但是對(duì)于自噬系統(tǒng)中的P62蛋白并未涉及[17]。

本實(shí)驗(yàn)采用的止顫湯是名老中醫(yī)李如奎教授的經(jīng)方，多年運(yùn)用于臨床上頗有療效[18]，也有多項(xiàng)課題提示對(duì)PD大鼠的腦內(nèi)細(xì)胞微環(huán)境有所改善[19]。故此次用止顫湯治療帕金森病大鼠，觀察對(duì)照組、造模組及中藥組的P62與α-Syn，免疫印跡顯示，P62及α-syn在3組含量為0.27±0.03，0.23±0.03；0.73±0.07，0.51±0.02；0.38±0.16，0.37±0.03，模型組較對(duì)照組明顯升高(Plt;0.01)，而運(yùn)用止顫湯的中藥組為與對(duì)照組相比基本接近(Pgt;0.05)。而與模型組相比有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(Plt;0.01)；同樣，PCR結(jié)果提示，P62及α-syn在3組的含量為(0.45±0.05，0.17±0.07；8.93±1.68，10.81±1.9；2.66±0.96，1.65±0.76)，模型組的含量為較對(duì)照組明顯上升(Plt;0.01)，中藥組為與模型組相比數(shù)值下降，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(Plt;0.05)。PCR與免疫印跡結(jié)果類似，P62與α-Syn在PD模型組的含量較對(duì)照組顯著升高，有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(Plt;0.01)。α-Syn作為帕金森病的異常蛋白將會(huì)被檢測(cè)到異常的聚集。而同樣在自噬途徑中扮演重要角色的P62也在造模成功后數(shù)值上升，這可能也與PD的自噬途徑受損后P62的聚集有關(guān)。在運(yùn)用止顫湯后，兩者中藥組的含量較模型組下降，甚至接近于對(duì)照組，提示止顫湯有增強(qiáng)自噬功能，調(diào)節(jié)P62蛋白，從而清除α-Syn。

但自噬途徑中，止顫湯是否完全通過(guò)P62對(duì)α-Syn進(jìn)行調(diào)節(jié)的作用機(jī)制尚未完全明確，需要進(jìn)行更進(jìn)一步的探討研究，這將對(duì)中醫(yī)藥治療帕金森病帶來(lái)更確切的治療依據(jù)。

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2016-10-14)

(本文編輯 王雅潔)

The Observation of Zhichan Decoction on P62 Adjusting α-Synuclein in Autophagy of Parkinsonian Rats

Huang Ningjing， Wei Jianning， Li Wentao

Shanghai Hosipital of Traditional Chinese Medicine， Shanghai 200071， China

Li Wentao

ObjectiveTo study the effects of Zhichan decoction (ZCD) on P62 adjusting α-synuclein in autophagy of Parkinsonian rats.MethodsThe rat mode1 of Parkinson disease (PD) was induced by lactacystin injection in substantia nigra of brain. Twelve lactacystin-lesioned rats were modeled successfully and randomly divided into 2 groups： model group treated with saline， and ZCD group treated with ZCD，respectively. Other 6 rats with sham-operation were served as controls．Rats were sacrificed，and western blotting techniques polymerase chain reaction (PCR) techniques were used to measure the expression of P62 and α-synuclein in striatum.ResultsWestern blotting showed that the P62 and α-synuclein were 0.27±0.03，0.23±0.03 in control group， 0.73±0.07，0.51±0.02 in model group， 0.38±0.16，0.37±0.03 in ZCD group，respectively.The expressions of P62 and α-synuclein increased in model group， which were higher than that in control group and ZCD group (Plt;0.01). PCR results showed the P62 and α-synuclein were 0.45±0.05，0.17±0.07 in model group， 8.93±1.68，10.81±1.9 in model group， 2.66±0.96，1.65±0.76 in ZCD group，respectively. The P62 and α-synuclein increased in model group， which were higher than that in control group (Plt;0.01).Compared with model group， the P62 and α-synuclein decreased in ZCD group (Plt;0.05).ConclusionZCD can adjust the P62 protein to reduce α-synuclein，which maybe the mechanism of ZCD on PD.

Parkinson’s disease；Zhichan decoction；autophagy；P62；α-synuclein；rats

R285.5

A

10.3969/j.issn.1672-1349.2017.21.008

1672-1349(2017)21-2689-04

上海市衛(wèi)生局科教處青年項(xiàng)目(No.20134Y164)

上海市中醫(yī)醫(yī)院(上海 200071)

李文濤，E-mail：1132@szy.sh.cn

信息：黃寧?kù)o，Wei Jianning，李文濤.止顫湯參與帕金森病大鼠自噬途徑中P62調(diào)節(jié)α-突觸核蛋白的研究[J].中西醫(yī)結(jié)合心腦血管病雜志，2017，15(21)：2689-2692.