CKLF1-C19多肽對TGF-β誘導(dǎo)原代人肺成纖維細(xì)胞向肌成纖維細(xì)胞轉(zhuǎn)化的干預(yù)作用*

龍 航， 譚亞夏△， 邱 源， 石燕情， 汪延生， 黃潔虹, 周文良

(1廣州醫(yī)科大學(xué)附屬第一醫(yī)院廣州呼吸疾病研究所, 國家呼吸疾病重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室， 2中山大學(xué)生命科學(xué)院， 廣東廣州 510000)

CKLF1-C19多肽對TGF-β誘導(dǎo)原代人肺成纖維細(xì)胞向肌成纖維細(xì)胞轉(zhuǎn)化的干預(yù)作用*

龍 航1， 譚亞夏1△， 邱 源1， 石燕情1， 汪延生1， 黃潔虹2, 周文良2

(1廣州醫(yī)科大學(xué)附屬第一醫(yī)院廣州呼吸疾病研究所, 國家呼吸疾病重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室，2中山大學(xué)生命科學(xué)院， 廣東廣州 510000)

目的探討CKLF1-C19多肽(C19)對TGF-β誘導(dǎo)原代人肺成纖維細(xì)胞(LFB)向肌成纖維細(xì)胞(MFB)轉(zhuǎn)化的干預(yù)作用。方法培養(yǎng)原代人肺成纖維細(xì)胞并鑒定。用適宜的TGF-β濃度處理LFB，制備LFB向MFB轉(zhuǎn)化的細(xì)胞模型。隨后將實(shí)驗(yàn)分為對照組、TGF-β(5 μg/L)組及4個濃度(1、0.1、0.01、0.001 mg/L)C19與TGF-β合用組。以細(xì)胞生長狀態(tài)、細(xì)胞增殖率、α-平滑肌肌動蛋白(α-SMA)及I型膠原蛋白(collagen I)的表達(dá)變化為觀察指標(biāo)。結(jié)果經(jīng)顯微鏡檢測，證實(shí)成功培養(yǎng)出原代人LFB。5 μg/L TGF-β明顯刺激LFB增殖及α-SMA和collagen I 表達(dá)(P<0.05)。與TGF-β組相比，C19-0.01 mg/L+TGF-β及C19-0.001 mg/L+TGF-β組LFB的細(xì)胞增殖率、α-SMA和collagen I 的mRNA及α-SMA的蛋白表達(dá)均明顯降低(P<0.05)。結(jié)論0.01 mg/L及0.001 mg/L的CKF1-C19多肽對TGF-β誘導(dǎo)的LFB向MFB轉(zhuǎn)化有一定的抑制作用，可在一定程度上抑制氣道重塑和纖維化的發(fā)生。

CKLF1-C19多肽； 肺成纖維細(xì)胞； 肌成纖維細(xì)胞； 氣道重塑

趨化因子樣因子1(chemokine-like factor 1，CKLF1)是我國北京大學(xué)人類疾病基因研究中心學(xué)者首次在國際上發(fā)現(xiàn)并報道的一個新的人類細(xì)胞因子[1]，其相關(guān)研究已獲多項中國、美國、歐洲及國際發(fā)明專利授權(quán)。CKLF1的cDNA含有530個堿基，編碼99個氨基酸，具有趨化因子CC亞家族的相似結(jié)構(gòu)[2]，在白細(xì)胞及肺組織中均呈高表達(dá)，具有對多種白細(xì)胞的趨化作用[1]。CKLF1的功能受體是CC 趨化因子受體 4(C-C chemokine receptor 4，CCR4)[2]。本課題組的前期研究發(fā)現(xiàn)，哮喘病人的外周單個核細(xì)胞及肺組織中CKLF1表達(dá)明顯增強(qiáng)，將CKLF1基因轉(zhuǎn)入小鼠體內(nèi)可引起小鼠氣道上皮損傷脫落、成纖維細(xì)胞增生、上皮下基底膜增厚及膠原沉積等類似中重度哮喘樣的氣道重塑及肺纖維化樣病變[3-5]。北大人類疾病基因研究中心學(xué)者們進(jìn)一步研究發(fā)現(xiàn)，CKLF1在果蠅S2細(xì)胞中表達(dá)時，可分泌2種成熟的多肽，即CKLF1-C19及CKLF1-C27多肽，簡稱C19與C27[6]。C19及C27亦有輕度的對白細(xì)胞的趨化作用，2者亦通過CCR4受體發(fā)揮作用[6]。進(jìn)一步的研究發(fā)現(xiàn)，C19可減輕哮喘小鼠的氣道嗜酸粒細(xì)胞募集及肺部炎癥反應(yīng)，更能明顯降低氣道高反應(yīng)性及氣道阻力；將C19用于特應(yīng)性皮炎的小鼠，病理結(jié)果顯示小鼠表皮增厚、細(xì)胞間水腫和真皮血管炎性細(xì)胞浸潤均減少，肉眼可見小鼠皮損紅斑及水腫減輕、鱗屑減少，提示C19是CKLF1的拮抗劑[7-8]。推測其作用機(jī)理為：C19與CCR4結(jié)合，競爭性地抑制了CKLF1及其它CCR4配體與 CCR4的結(jié)合，從而減輕了CKLF1及其它炎癥因子導(dǎo)致的炎癥[7]。眾所周知，人肺成纖維細(xì)胞(human lung fibroblast，LFB)可在轉(zhuǎn)化生長因子-β(transforming growth factor-β，TGF-β)作用下分化為肌成纖維細(xì)胞(myofibroblast，MFB)，后者可分泌膠原(collagen)和α平滑肌肌動蛋白(α-smooth muscle actin，α-SMA)，具有一定的收縮潛能，是氣道高反應(yīng)性和氣道阻力發(fā)生的病理生理機(jī)制之一[9-10]。因此我們假設(shè)，C19降低氣道高反應(yīng)性及氣道阻力的另一機(jī)制可能是通過抑制LFB向MFB轉(zhuǎn)化，減少collagen和α-SMA的分泌，從而減弱了氣道收縮能力。為驗(yàn)證這一假設(shè)，本研究將制備TGF-β誘導(dǎo)的LFB增殖與分化模型，并觀察不同濃度的C19對TGF-β誘導(dǎo)原代人LFB向MFB轉(zhuǎn)化的抑制作用。

材 料 和 方 法

1材料

DMEM高糖培養(yǎng)基、胎牛血清、HBSS(HyClone)；青霉素/鏈霉素、0.05%胰酶-EDTA(Gibco)；SYBR Green real-time PCR Master Mix檢測試劑盒(TOYOBO)；Trizol試劑(Invitrogen)；Prime Script RT-PCR Kit(TaKaRa)；ECL化學(xué)發(fā)光試劑盒(Tanon)；C19(北京大學(xué)王應(yīng)教授惠贈)；牛血清蛋白、丙烯酰胺(廣州展晨生物科技有限公司)；Trisbase(MDBio)；SDS(威佳科技有限公司)；α-SMA單克隆抗體(博士德)；兔抗波形蛋白(vimentin)單克隆抗體(Abcam)；兔抗角蛋白(keratin)單克隆抗體(Cell Signaling Technology)； HRP-山羊抗兔、抗鼠 II 抗(Earthox)；抗GAPDH抗體(Thermo Scientific)；MTT試劑盒(北京碧云天生物技術(shù)研究所)。

2方法

2.1原代人肺成纖維細(xì)胞培養(yǎng) 取肺部手術(shù)患者新鮮正常肺組織標(biāo)本，用無菌PBS反復(fù)漂洗數(shù)遍，直至組織塊無明顯殘留血漬。將組織剪成1 mm×1 mm×1 mm的小塊，分散貼于培養(yǎng)皿中，待組織塊貼緊皿壁后緩緩加入含20%胎牛血清、1%雙抗的DMEM高糖培養(yǎng)液，置于37℃、5%CO2的培養(yǎng)箱中，每2 d換液1次。待培養(yǎng)皿中細(xì)胞覆蓋率達(dá)80%時用0.05%胰酶消化傳代至細(xì)胞培養(yǎng)瓶中繼續(xù)培養(yǎng)。

2.2原代人肺成纖維細(xì)胞免疫熒光鑒定 待細(xì)胞培養(yǎng)瓶中細(xì)胞密度達(dá)80%時，將其消化后接種于6孔板，隔日換液，2 d后移除各孔培養(yǎng)基，用PBS洗5 min、3次。向各孔加入4%多聚甲醛，室溫固定2 h。移除多聚甲醛，加入含0.3% Triton X-100的PBS，穿膜處理20 min。PBS洗3次之后，用5% BSA室溫封閉30 min。 I 抗(1∶100稀釋)4℃過夜。PBS洗3次， II 抗(1∶100稀釋)室溫避光孵育1 h。室溫孵育DAPI 5 min，PBS洗3次之后滴入10 μL防熒光萃滅劑，迅速封片，置于熒光顯微鏡下觀察拍照。

2.3TGF-β誘導(dǎo)原代LFB向MFB轉(zhuǎn)化的細(xì)胞模型建立 將成功鑒定的LFB調(diào)整濃度為1×109/L，接種于6孔板，待細(xì)胞覆蓋率達(dá)70%時，將完全培養(yǎng)基更換為無血清培養(yǎng)基，培養(yǎng)24 h后，除對照(control)組外，其余2組分別加入5 μg/L和10 μg/L 的TGF-β，每24 h于光鏡下觀察記錄一次細(xì)胞生長情況變化。用MTT比色法檢測計算細(xì)胞增殖率。48 h后用RT-qPCR檢測每組α-SMA和collagen I的表達(dá)量。

2.4C19干預(yù)LFB向MFB轉(zhuǎn)化 按2.3方法接種細(xì)胞于6孔板，設(shè)置分組為對照組、TGF-β(5 μg/L)組、4個濃度(1 mg/L、0.1 mg/L、0.01 mg/L、0.001 mg/L)C19與TGF-β合用組。將完全培養(yǎng)基置換為無血清培養(yǎng)基24 h后，分別向4個濃度C19與TGF-β合用組加入相應(yīng)濃度的C19，24 h后除對照組外，各組均加入5 μg/L的TGF-β，繼續(xù)培養(yǎng)48 h，每24 h于光鏡下觀察記錄1次細(xì)胞生長情況變化，用MTT法檢測計算細(xì)胞增殖率。48 h后用RT-qPCR和Western blot法檢測各組細(xì)胞中α-SMA和collagen I的表達(dá)情況。

2.5MTT法測定細(xì)胞增殖率 按照前述方法分組，并按照文獻(xiàn)所述方法[11-12]，將細(xì)胞按照每孔1×104的密度接種于96孔板，每組設(shè)置3個復(fù)孔。按照試劑盒說明書配置MTT工作液(5 g/L)，每孔加入10 μL MTT溶液，在37 ℃、5% CO2的細(xì)胞培養(yǎng)箱內(nèi)孵育4 h，每孔加入100 μL 甲瓚溶解液，在37 ℃、5% CO2的細(xì)胞培養(yǎng)箱內(nèi)繼續(xù)孵育，直至在光學(xué)顯微鏡下觀察到甲瓚全部溶解。使用酶標(biāo)儀于570 nm波長處測各組吸光度(A)值。計算各組細(xì)胞增殖率，計算公式為：增殖率=(A實(shí)驗(yàn)組-A對照組)×100%。

2.6RT-qPCR 將每組細(xì)胞分別用Trizol法提取總RNA，檢測各組RNA濃度，按照試劑盒說明書步驟進(jìn)行逆轉(zhuǎn)錄反應(yīng)和qPCR反應(yīng)，以次黃嘌呤-鳥嘌呤磷酸核糖基轉(zhuǎn)移酶-1(hypoxanthine-guanine phosphoribosyl-transferase-1，HPRT1)為內(nèi)參照。各基因引物見表1。

表1 引物序列

2.7Western blot法檢測蛋白水平 分別裂解6組細(xì)胞，提取總蛋白，采用BCA試劑盒檢測蛋白濃度。配置10%分離膠和4%濃縮膠，將電泳液加至電泳槽中標(biāo)準(zhǔn)位置后上樣，先以90 V電泳，待樣品跑至濃縮膠與分離膠的交界處時改為110 V恒壓繼續(xù)電泳，至溴酚藍(lán)跑至分離膠底部，電泳結(jié)束，進(jìn)行轉(zhuǎn)膜。用180 mA電流轉(zhuǎn)膜2 h，5%BSA室溫封閉1 h。稀釋抗體，加入α-SMA I 抗(1∶200)，4℃過夜，TBST洗5 min、3次，山羊抗兔 II 抗(1∶1 000)室溫孵育 2 h，TBST洗3次之后使用ECL化學(xué)發(fā)光法顯示蛋白印跡并進(jìn)行后續(xù)檢測。

3統(tǒng)計學(xué)處理

使用Graphpad 5.0軟件作圖，用SPSS 22.0軟件進(jìn)行統(tǒng)計分析。實(shí)驗(yàn)均重復(fù)3次或以上，實(shí)驗(yàn)結(jié)果用均數(shù)±標(biāo)準(zhǔn)差(mean±SD)表示。多組間比較采用單因素方差分析，方差齊者用SNK檢驗(yàn)進(jìn)行兩兩比較，方差不齊者用Games-Howell 檢驗(yàn)進(jìn)行兩兩比較，以P<0.05為差異有統(tǒng)計學(xué)意義。

結(jié) 果

1人原代LFB細(xì)胞形態(tài)及鑒定

成熟的LFB細(xì)胞呈長梭形，數(shù)目多，胞體較大，細(xì)胞間連接不清(圖1)。Vimentin是LFB胞漿中的標(biāo)志蛋白，故使用免疫熒光染色法檢測vimentin，即可鑒定成纖維細(xì)胞。于熒光顯微鏡中可觀察到成纖維細(xì)胞標(biāo)志物vimentin的特異熒光，而沒有觀察到keratin特異性熒光(圖2)。由此可鑒定培養(yǎng)出的細(xì)胞為人LFB。

2TGF-β誘導(dǎo)原代人LFB向MFB轉(zhuǎn)化的細(xì)胞模型的建立

2.1TGF-β誘導(dǎo)原代人LFB向MFB轉(zhuǎn)化過程中細(xì)胞生長情況變化 經(jīng)過5 μg/L和10 μg/L 的TGF-β處理24 h、48 h后，光鏡下觀察可見，與對照組相比，TGF-β組細(xì)胞呈現(xiàn)出明顯的增殖和形態(tài)變化，細(xì)胞密度明顯增加，呈旋渦樣增長(圖3)。MTT結(jié)果顯示，TGF-β組細(xì)胞增殖速度明顯增快(P<0.05)，但2個劑量TGF-β組間無明顯區(qū)別(圖4)。

Figure 1. Primary cultured human lung fibroblasts(×200).

圖1正常狀態(tài)下原代培養(yǎng)24h后的人肺LFB

Figure 2. The normal lung fibroblasts showed keratin negative and vimentin positive immunofluorescence labeling.

圖2原代人LFB的鑒定

2.2TGF-β誘導(dǎo)原代人LFB向MFB轉(zhuǎn)化過程中α-SMA和collagen I mRNA的表達(dá) RT-qPCR結(jié)果顯示，與對照組相比，2個濃度TGF-β組的α-SMA、collagen I mRNA表達(dá)量均明顯增加(P<0.05)，但TGF-β的2個劑量組間差異無統(tǒng)計學(xué)顯著性(圖5)。故在隨后的實(shí)驗(yàn)中我們選擇5 μg/L作為TGF-β的實(shí)驗(yàn)劑量。

Figure 3. The morphological changes of the lung fibroblasts treated with TGF-β (×200).

圖3TGF-β處理24h或48h后LFB的生長情況

Figure 4. The cell proliferation rate of the LFB treated with 5 μg/L and 10 μg/L TGF-β for 24 h or 48 h. Mean±SD.n= 3.*P<0.05vscontrol group;#P<0.05vs5 μg/L TGF-β-24 h group;△P<0.05vs10 μg/L TGF-β-24 h group.

圖4TGF-β處理24h或48h后LFB細(xì)胞的活力

3C19對TGF-β誘導(dǎo)原代人LFB向MFB轉(zhuǎn)化的影響

3.1C19對LFB向MFB轉(zhuǎn)化過程中細(xì)胞生長情況的影響 光鏡下可見，與對照組相比，C19干預(yù)組與TGF-β組均有細(xì)胞數(shù)量增加。1 mg/L、0.1 mg/L 2個濃度C19預(yù)給藥組細(xì)胞密度明顯較對照組增加并呈旋渦樣生長，而0.01 mg/L、0.001 mg/L 2組的細(xì)胞形態(tài)變化不明顯，尤其0.01 mg/L C19干預(yù)組的細(xì)胞形態(tài)幾乎無變化，與對照組非常接近，見圖6。

3.2C19對LFB向MFB轉(zhuǎn)化過程中細(xì)胞增殖率的影響 如圖7 MTT實(shí)驗(yàn)結(jié)果所示，與對照組相比，4個濃度C19干預(yù)組及TGF-β組，細(xì)胞數(shù)量明顯增多；與TGF-β組相比，0.01 mg/L、0.001 mg/L 2個 濃度C19干預(yù)組細(xì)胞增殖率下降(P<0.05)。

Figure 5. The mRNA expression of α-SMA and collagen I in the TGF-β treated LFB. Mean±SD.n= 3.*P<0.05vscontrol group.

圖5TGF-β誘導(dǎo)原代人LFB向MFB轉(zhuǎn)化過程中α-SMA和collagenI的mRNA表達(dá)

Figure 6. The effect of C19 on cell growth of LFB induced by TGF-β (×200).

圖6C19對TGF-β誘導(dǎo)原代人LFB96h后向MFB轉(zhuǎn)化中細(xì)胞生長情況的影響

3.3C19對LFB向MFB轉(zhuǎn)化過程中α-SMA與 collagenⅠmRNA表達(dá)的影響 RT-qPCR實(shí)驗(yàn)結(jié)果顯示，0.01 mg/L、0.001 mg/L 濃度C19干預(yù)能夠明顯下調(diào) α-SMA mRNA的表達(dá)(P<0.05), 0.1、0.01、0.001 mg/L C19干預(yù)均能下調(diào)collagenⅠmRNA的表達(dá)(P<0.05)，以0.01 mg/L C19干預(yù)組下調(diào)最為明顯，與 α-SMA mRNA的變化趨勢一致，見圖8。

Figure 7. The effect of C19 on cell proliferation rate of LFB induced by TGF-β. Mean±SD.n=3.*P<0.05vscontrol group；#P<0.05vsTGF-β group.

圖7C19對TGF-β誘導(dǎo)原代人LFB96h后增殖率的影響

Figure 8. The mRNA level of α-SMA and collagen I. Mean±SD.n= 3.*P<0.05vscontrol group；#P<0.05vsTGF-β group.

圖8C19對經(jīng)TGF-β誘導(dǎo)的LFB中α-SMA和CollagenⅠmRNA表達(dá)的影響

3.4C19對TGF-β誘導(dǎo)原代人LFB向MFB轉(zhuǎn)化過程中α-SMA蛋白的表達(dá) Western blot結(jié)果顯示，與對照組相比，TGF-β組與4個濃度C19干預(yù)組的α-SMA表達(dá)量都有增加(P<0.05)。與TGF-β相比，1、0.1 mg/L C19干預(yù)組α-SMA的表達(dá)差異無統(tǒng)計學(xué)顯著性，而0.01、0.001 mg/L干預(yù)組α-SMA的表達(dá)量明顯減少(P<0.05)，與RT-qPCR趨勢一致，見圖9。

Figure 9. The protein expression of α-SMA. Mean±SD.n= 3.*P<0.05vscontrol group；#P<0.05vsTGF-β group.

圖9C19對TGF-β誘導(dǎo)的LFB中α-SMA蛋白表達(dá)的影響

討 論

支氣管哮喘的本質(zhì)是慢性氣道炎癥，其臨床特征是氣道高反應(yīng)性。哮喘的另一主要病理變化為氣道結(jié)構(gòu)重塑，包括成纖維細(xì)胞增殖與分化，上皮下膠原沉積和纖維化等病變，而在氣道結(jié)構(gòu)重塑和纖維化的發(fā)生發(fā)展中TGF-β起著重要的作用[10, 13]。TGF-β能夠直接促進(jìn)LFB大量地轉(zhuǎn)化為MFB[9]，促進(jìn)膠原生成和平滑肌增生[10]。α-SMA是MFB的特征性標(biāo)志物[14]，動物實(shí)驗(yàn)發(fā)現(xiàn)，α-SMA含量的增加可以反映TGF-β促進(jìn)MFB的增殖與分化，加入TGF-β抗體后， MFB的增殖與分化則被明顯抑制[15]。此外，MFB大量分泌細(xì)胞外基質(zhì)(extracellular matrix，ECM)是氣道重塑的另一特征[16]， collagenⅠ是ECM的重要結(jié)構(gòu)蛋白成分，尤其是在氣道重塑后期，大量collagenⅠ沉積，形成不可逆的病理改變[17]。因此，本研究中，我們首先采用TGF-β誘導(dǎo)原代人LFB向MFB分化，并以α-SMA和collagenⅠ的高表達(dá)作為LFB向MFB分化的標(biāo)志。

CKLF1是我國學(xué)者2001年首次在國際上報道的新細(xì)胞因子，其后國內(nèi)外學(xué)者對其進(jìn)行了系列研究[18]。研究顯示CKLF1的C端具有2個分泌型多肽，即C19與C27[6]。動物實(shí)驗(yàn)表明，C19可減輕哮喘模型小鼠的氣道阻力[7]，我們推測C19可能通過抑制TGF-β對LFB的轉(zhuǎn)化促進(jìn)作用，使氣道重塑發(fā)生逆轉(zhuǎn)，進(jìn)而降低了氣道阻力。因此在本研究中，我們采用TGF-β誘導(dǎo)原代LFB向MFB轉(zhuǎn)化，并用4個濃度的C19對其進(jìn)行干預(yù)，結(jié)果顯示經(jīng)TGF-β刺激后的LFB細(xì)胞密度明顯增加，呈旋渦樣生長，且MFB的標(biāo)志物α-SMA、collagenⅠ在mRNA及蛋白水平均表達(dá)增加，表明LFB大量增殖與分化；而預(yù)先用0.01 mg/L與0.001 mg/L濃度的 C19處理的各組細(xì)胞生長速度較緩，細(xì)胞形態(tài)無明顯變化，α-SMA和collagenⅠ表達(dá)減少，表明C19能夠部分抑制TGF-β誘導(dǎo)的人原代LFB向MFB轉(zhuǎn)化，其中，以0.01 mg/L劑量C19干預(yù)作用最為明顯。

本研究首次證明了C19可通過抑制TGF-β誘導(dǎo)LFB向MFB轉(zhuǎn)化的功能，降低肺成纖維細(xì)胞的增殖和α-SMA及collagenⅠ的生成，并推測該作用是C19多肽降低支氣管哮喘小鼠氣道阻力的作用機(jī)制之一。C19是來源于人體的內(nèi)源性蛋白, 僅有19個氨基酸[6]，用于人體不易誘導(dǎo)機(jī)體產(chǎn)生免疫應(yīng)答反應(yīng)，且多肽藥物擁有良好的特異性和耐受性，這對人體來說就有了一定的安全性保障和長期用藥的基礎(chǔ)[19-20]。因此本研究不僅首次闡明了C19具有抑制TGF-β誘導(dǎo)LFB向MFB轉(zhuǎn)化的功能，也為具有我國自主知識產(chǎn)權(quán)的候選新藥C19的開發(fā)利用提供了進(jìn)一步的實(shí)驗(yàn)依據(jù)。

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(責(zé)任編輯： 陳妙玲， 余小慧)

Effect of CKLF1-C19 polypeptide on differentiation of human lung fibroblast into myofibroblast induced by TGF-β

LONG Hang1, TAN Ya-xia1, QIU Yuan1, SHI Yan-qing1, WANG Yan-sheng1, HUANG Jie-hong2, ZHOU Wen-liang2

(1StateKeyLaboratoryofRespiratoryDisease,GuangzhouInstituteofRespiratoryDiseases,FirstAffiliatedHospitalofGuangzhouMedicalUniversity,2SchoolofLifeSciences,SunYat-senUniversity,Guangzhou510000,China.E-mail:yaxiatan@vip.163.com)

AIM: To investigate the effect of CKLF1-C19 polypeptide (C19) on differentiation of human lung fibroblast (LFB) into myofibroblast (MFB) induced by TGF-β.METHODSLFBs were cultured and identified. LFBs were treated with TGF-β (5 μg/L) to establish the cell model of LFB differentiate into MFB. The LFBs were divided into 6 experimental groups including control group, TGF-β group, and TGF-β plus different doses (1， 0.1， 0.01， 0.001 mg/L) C19 groups. The cell morphology, cell proliferation rate, and the expression of α smooth muscle actin (α-SMA) and collagen I were observed.RESULTSHuman primary LFB was successfully cultured and was confirmed by the method of immunofluorescence. TGF-β at 5 μg/L induced proliferation and differentiation of LFB. The mRNA levels of α-SMA and collagen I in TGF-β group were higher than that in control group (P<0.05).The cell proliferation rates, mRNA levels of α-SMA and collagen I ， and the protein expression of α-SMA in 0.01 mg/L+TGF-β group and 0.001 mg/L+TGF-β group were markedly lower than those in TGF-β group (P<0.05).CONCLUSIONC19 at 0.01 mg/L and 0.001 mg/L effectively inhibits differentiation of LFB into MFB induced by TGF-β, thus inhibiting the process of airway remodeling and fibrosis to some extent.

CKLF1-C19 polypeptide; Lung fibroblasts; Myofibroblasts; Airway remodeling

1000- 4718(2017)11- 2047- 06

2017- 03- 15

2017- 10- 13

廣州呼吸疾病國家重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室開放課題(No. SKLRD2010； No. SKLRD2014)

△通訊作者 Tel: 020-83062892； E-mail: yaxiatan@vip.163.com

R363.2+1

A

10.3969/j.issn.1000- 4718.2017.11.020