基于骨肉瘤高表達(dá)抗原PBF CTL表位改造及鑒定*

張建新， 時(shí)冉冉

(1許昌學(xué)院， 河南 許昌 461000； 2漯河醫(yī)學(xué)高等?？茖W(xué)校， 河南 漯河 462002)

基于骨肉瘤高表達(dá)抗原PBF CTL表位改造及鑒定*

張建新1， 時(shí)冉冉2△

(1許昌學(xué)院， 河南 許昌 461000；2漯河醫(yī)學(xué)高等?？茖W(xué)校， 河南 漯河 462002)

目的觀察骨肉瘤高表達(dá)抗原乳頭瘤病毒結(jié)合因子(PBF)的改造表位是否有HLA-A2限制性抗腫瘤能力，開發(fā)基于骨肉瘤的多肽免疫治療。方法首先運(yùn)用RT-PCR和Western blot方法檢測(cè)PBF在骨肉瘤細(xì)胞系U2OS和Saos-2的表達(dá)情況。然后通過NetCTL 1.2、SYFPEITHI和IEDB軟件預(yù)測(cè)打分來選取PBF的HLA-A2限制性表位。替換PBF抗原錨定位點(diǎn)氨基酸獲得改造肽。候選表位肽的合成方法是標(biāo)準(zhǔn)的Fmoc化學(xué)合成法，結(jié)合力實(shí)驗(yàn)用于檢測(cè)候選表位與T2A2細(xì)胞表面HLA-A2分子的結(jié)合能力，ELISPOT實(shí)驗(yàn)檢測(cè)候選表位肽誘導(dǎo)細(xì)胞毒性T淋巴細(xì)胞(CTL)分泌干擾素γ(IFN-γ)的能力，乳酸脫氧酶(LDH)釋放實(shí)驗(yàn)和羧基熒光素琥珀酰亞胺脂(CFSE)細(xì)胞毒實(shí)驗(yàn)檢測(cè)候選肽誘導(dǎo)CTL的能力。結(jié)果PBF在骨肉瘤細(xì)胞系U2OS和Saos-2均有表達(dá)，候選肽P75-1Y2L、P412-1Y、P416-1Y2L9V、P107-1Y和P435-1Y2L具有較好的結(jié)合力，且改造肽與HLA-A2的結(jié)合力高于原肽。ELISPOT實(shí)驗(yàn)結(jié)果顯示表位肽P412、P412-1Y、P416、P416-1Y2L9V和P435-1Y2L誘導(dǎo)的CTL具有分泌IFN-γ的能力；P412-1Y和P416-1Y2L9V誘導(dǎo)特異性T細(xì)胞免疫分泌的IFN-γ略高于原肽。LDH釋放實(shí)驗(yàn)和CFSE細(xì)胞毒實(shí)驗(yàn)結(jié)果顯示表位P412、P412-1Y、P416和P416-1Y2L9V對(duì)U2OS細(xì)胞均有一定的殺傷作用，P412-1Y和P416-1Y2L9V特異性CTLs對(duì)U2OS細(xì)胞殺傷率高于原肽特異性CTLs。結(jié)論P(yáng)BF抗原改造表位P412-1Y和P416-1Y2L9V與天然表位P412和P416相比有更高的HLA-A2分子親和力，保留了原有的免疫原性，并且改造肽抗腫瘤免疫效應(yīng)強(qiáng)于天然表位。P412-1Y和P416-1Y2L9V是優(yōu)秀的PBF抗原的HLA-A*0201限制性CTL候選表位，可以成為新的抗腫瘤多肽免疫治療疫苗的候選表位。

乳頭瘤病毒結(jié)合因子； 表位； 細(xì)胞毒性T淋巴細(xì)胞； 骨肉瘤

骨肉瘤是骨科最常見的原發(fā)性惡性腫瘤。1970年前，骨肉瘤患者的生存率低于20%。輔助化療和手術(shù)治療準(zhǔn)則的建立，使患者五年存活率提高為60%～70%[1-2]。 這些進(jìn)展掩蓋了近年來的輔助免疫治療，盡管使用自身腫瘤疫苗的輔助免疫治療具有一定的治療功效[3-5]， 但是，骨肉瘤患者的存活率在過去10年已經(jīng)進(jìn)入停滯期[6-7]，這又重新激起了免疫治療方法的開展[8-9]。乳頭瘤病毒結(jié)合因子(pa-pillomavirus-binding factor，PBF)被鑒定為調(diào)節(jié)人乳頭瘤病毒8型基因組上的啟動(dòng)子活性的轉(zhuǎn)錄因子[10]。PBF是由自體細(xì)胞毒性T淋巴細(xì)胞(cytoto-xic T-lymphocytes，CTL)克隆識(shí)別的骨肉瘤相關(guān)抗原[11]。 免疫組織化學(xué)分析顯示，92%的骨肉瘤活檢標(biāo)本表達(dá)PBF。 此外，PBF陽性骨肉瘤具有比PBF陰性表達(dá)更差的預(yù)后[12]。 通常，常規(guī)骨肉瘤是間充質(zhì)來源的惡性腫瘤，沒有特定的病因，例如病毒感染。 PBF不僅在人乳頭瘤病毒基因組的轉(zhuǎn)錄中具有某些功能，而且在骨肉瘤[13-14]、先天免疫[15]和脂肪形成[16]的細(xì)胞增殖和凋亡中具有某些功能。本次研究使用NetCTL 1.2、SYFPEITHI和IEDB生物信息學(xué)軟件進(jìn)行綜合預(yù)測(cè)，篩選出綜合打分較高的表位，并對(duì)優(yōu)勢(shì)表位進(jìn)行適當(dāng)替換，通過進(jìn)一步的實(shí)驗(yàn)分析，鑒定篩選出PBF的HLA-A*0201限制性CTL表位[17-19]，為未來構(gòu)建多表位疫苗和重組蛋白融合疫苗打下基礎(chǔ)。

材 料 和 方 法

1材料

T2A2細(xì)胞、U2OS細(xì)胞(HLA-A2+)和Saos-2細(xì)胞(HLA-A2-)由漯河醫(yī)學(xué)高等?？茖W(xué)校分子醫(yī)學(xué)實(shí)驗(yàn)室常規(guī)保存，采用37 ℃、5% CO2、飽和濕度培養(yǎng)條件下常規(guī)培養(yǎng)。外周血單個(gè)核細(xì)胞(peripheral blood mononuclear cells，PBMCs)由HLA-A2+健康供者捐贈(zèng)。HLA-A2+外周血健康供者來自課題組尋找的健康供者。

2方法

2.1PBF 在腫瘤細(xì)胞中的表達(dá) 采用RT-PCR和Western blot法檢測(cè)PBF在骨肉瘤細(xì)胞系U2OS和Saos-2中的表達(dá)情況。參照說明書提取總RNA，反轉(zhuǎn)錄得到cDNA，以cDNA為模板行PCR。擴(kuò)增條件為: 95 ℃預(yù)變性30 s； 95 ℃變性30 s， 63 ℃退火45 s， 72 ℃延伸45 s，共30個(gè)循環(huán)； 72 ℃終止延伸5 min。將PCR產(chǎn)物行1%瓊脂糖凝膠電泳，采用凝膠成像系統(tǒng)觀察結(jié)果，ImageJ軟件測(cè)定各條帶灰度值。PBF的上游引物序列為 5’-TGTGCACAGGTGTCTTTGGT-3’，下游引物序列為5’-CCTGAGCGAAGTTCCCATGT-3’，產(chǎn)物大小278 bp。GAPDH的上游引物序列為5’-GAAGGTGAA GGTCGGAGTC-3’， 下游序列引物為5’-GAAGATGGTGATGGGATTTC-3’，產(chǎn)物大小為226 bp。裂解細(xì)胞提取總蛋白，BCA法定量，行SDS-PAGE并轉(zhuǎn)移PVDF膜。封閉液封閉1 h，加入已稀釋的 I 抗，4 ℃孵育過夜，TBST洗膜3次，加入 II 抗，室溫下孵育1 h， TBST洗膜3次，加入ECL進(jìn)行發(fā)光反應(yīng)。用ImageJ軟件測(cè)定各條帶灰度值。

2.2HLA-A*0201限制性CTL表位肽的預(yù)測(cè) 結(jié)合NetCTL 1.2(http://www.cbs.dtu.dk/services/NetCTL/)、SYFPEITHI(http://www.syfpeithi. de/ bin/MHCServer.dll/EpitopePrediction.htm)和IEDB(http://tools.iedb.org/main/tcell/)軟件對(duì)PBF氨基酸序列的預(yù)測(cè)打分，分別打開這3種預(yù)測(cè)軟件的主頁，進(jìn)入 CTL 表位預(yù)測(cè)界面，本次研究以A2超型為主，參數(shù)設(shè)定為CTL表位限制性 MHC類型——HLA-A*0201。預(yù)測(cè)抗原肽長度nonamers (9 aa)。根據(jù)各個(gè)預(yù)測(cè)軟件所推選的前30個(gè)優(yōu)勢(shì)表位進(jìn)行綜合選擇，選出在各種軟件打分較好的HLA-A*0201限制性表位。

2.3HLA-A*0201限制性CTL表位肽的合成、純化、分析及質(zhì)譜鑒定 候選表位肽由上海生工生物工程有限公司合成，經(jīng)HPLC分析純化后，其純度大于95%，質(zhì)譜分析其相對(duì)分子質(zhì)量符合理論值。

2.4表位肽與HLA-A2分子結(jié)合力實(shí)驗(yàn) 收集T2A2細(xì)胞，用無血清RPMI-1640培養(yǎng)基洗3次，調(diào)整細(xì)胞濃度至1×109/L，鋪于24孔板中，每孔1 mL，每實(shí)驗(yàn)孔加入待測(cè)肽50 mg/L，β2-M 2.5 mg/L，37 ℃、5% CO2共孵育18 h后，冷PBA洗滌3次，加入500 μL稀釋度為1∶100的 I 抗(鼠抗人β2-M)，4 ℃避光靜置40 min。之后冷PBA洗滌3次，加入50 μL稀釋度為1∶50的 II 抗(FITC標(biāo)記的羊抗鼠IgG溶液)，4 ℃靜置40 min，PBA洗滌1次后上流式細(xì)胞儀檢測(cè)。其結(jié)果用熒光指數(shù)(fluorescence index， FI)表示，F(xiàn)I=(表位肽平均熒光強(qiáng)度-背景平均熒光強(qiáng)度)/背景平均熒光強(qiáng)度。FI>1.0表示高等結(jié)合力，1.0>FI>0.5表示中等結(jié)合力，F(xiàn)I<0.5表示低結(jié)合力[20]。

2.5CTL的體外誘導(dǎo) 抽取HLA-A2+健康供者的外周血，將外周血加入含肝素鈉的離心管中，經(jīng)常規(guī)聚蔗糖-泛影葡胺分層液梯度離心，獲取PBMCs，用含10%胎牛血清的IMDM培養(yǎng)基調(diào)整細(xì)胞濃度為1.5×109/L。第2天分別加入10 mg/L的候選肽共培養(yǎng)，第3天加入5×104U/L的rIL-2繼續(xù)培養(yǎng)。每周收集細(xì)胞，1 000 r/min離心10 min，除去上清，加入新鮮的10%胎牛血清的IMDM培養(yǎng)基，同時(shí)加入上述條件的候選肽和rIL-2。刺激3輪后于最后一次刺激的第3天收集細(xì)胞。調(diào)整細(xì)胞濃度作為效應(yīng)細(xì)胞，用無血清IMDM培養(yǎng)基調(diào)整細(xì)胞濃度作為靶細(xì)胞[21]。

2.6干擾素γ(Interferon-γ，IFN-γ)分泌水平檢測(cè) 酶聯(lián)免疫斑點(diǎn)實(shí)驗(yàn)(enzyme-linked immunospot assay，ELISPOT)試劑盒購自達(dá)科為生物技術(shù)有限公司。取出板條，加200 μL無血清的IMDM培養(yǎng)基進(jìn)行封閉，靜置10 min；誘導(dǎo)的CTL作為效應(yīng)細(xì)胞，荷肽的T2A2作為刺激細(xì)胞，細(xì)胞濃度均調(diào)整為2×109/L；設(shè)立對(duì)照孔和實(shí)驗(yàn)孔，37 ℃、5% CO2孵育18 h；傾盡孔中培養(yǎng)基，每孔加入200 μL無菌的去離子水，4 ℃ 裂解細(xì)胞10 min；傾盡孔內(nèi)液體，加入200 μL 1×Washing Buffer進(jìn)行洗滌，洗滌6次，每次停留60 s；加入 100 μL生物素標(biāo)記的抗體，37 ℃ 孵育1 h；傾盡孔內(nèi)液體，加入200 μL 1×Washing Buffer進(jìn)行洗滌，洗滌方法同上，在吸水紙上拍干；加入100 μL酶聯(lián)親和素，37 ℃ 孵育1 h；每孔加入200 μL 1×Washing Buffer進(jìn)行洗滌，洗滌方法同上；加入100 μL現(xiàn)配的AEC顯色液，25 ℃避光靜置30 min；結(jié)束后置于通風(fēng)處，室溫靜置干燥；結(jié)果用 ELISPOT 圖像分析儀計(jì)數(shù) 96 孔板中每孔的斑點(diǎn)數(shù)[22]。

2.7乳酸脫氫酶(lactate dehydrogenase，LDH)釋放實(shí)驗(yàn)檢測(cè)CTL的細(xì)胞毒性 調(diào)整CTL濃度為5×109/L；調(diào)整靶細(xì)胞U2OS細(xì)胞濃度為1×108/L；按50∶1、25∶1和12.5∶1的不同效靶比(effector/target，E/T)鋪于96孔板中，同時(shí)設(shè)立效應(yīng)細(xì)胞自發(fā)釋放組、靶細(xì)胞自發(fā)釋放組、靶細(xì)胞最大釋放組、體積校正組和背景對(duì)照組，每孔終體積為100 μL。37 ℃、5% CO2培養(yǎng)4 h。于孵育結(jié)束前45 min在靶細(xì)胞最大釋放組及體積校正組中加入10 μL裂解液，1 000 r/min離心4 min，轉(zhuǎn)移50 μL上清至另一干凈96孔板中，每孔加入50 μL底物混合液，室溫避光孵育30 min；每孔再加入50 μL終止液。用酶標(biāo)儀檢測(cè)其在490 nm波長處的吸光度(A)。殺傷率(%)=(實(shí)驗(yàn)孔值-效應(yīng)細(xì)胞自發(fā)釋放值-CTL自發(fā)釋放值)/(靶細(xì)胞值-效應(yīng)細(xì)胞自發(fā)釋放值)×100%[23]。

2.8羧基熒光素琥珀酰亞胺酯(carboxyfluorescein succinimidyl ester，CFSE)熒光染色檢測(cè)CTL的細(xì)胞毒性 離心收集靶細(xì)胞，并將細(xì)胞重懸于含1% 胎牛血清的PBS中，并將細(xì)胞濃度調(diào)節(jié)至1×109/L。按下法制備致敏靶細(xì)胞：每1 mL細(xì)胞懸浮液加入0.5 μL 5 mmol/L CFSE，室溫光照孵育4 min；對(duì)照靶細(xì)胞：每1 mL細(xì)胞懸液中加入0.5 μL 100 μmol/L CFSE，室溫光照孵育4 min。將細(xì)胞用5% FCS-PBS洗滌1次，離心并除去上清液，重懸于無血清IMDM培養(yǎng)基中。將效應(yīng)細(xì)胞在無血清IMDM培養(yǎng)基中洗滌1次，并以(1.25～5)×109/L的濃度重懸于無血清IMDM培養(yǎng)基中。將效應(yīng)細(xì)胞(分別為12.5∶1、25∶1和50∶1)與致敏的靶細(xì)胞在離心管中混合，靶細(xì)胞數(shù)為2×104，37 ℃溫育4 h后，用含有1% 胎牛血清和0.1%疊氮化鈉的PBS(FACS緩沖液)處理相同E/T致敏的靶細(xì)胞組和對(duì)照靶細(xì)胞組，并用FACS緩沖液洗滌。離心，重懸在4%多聚甲醛的PBS溶液中，流式細(xì)胞儀檢測(cè)。殺傷率(%)=(對(duì)照樣品中致敏靶細(xì)胞的數(shù)量-測(cè)試樣品中致敏靶細(xì)胞的數(shù)量)/對(duì)照樣品中致敏靶細(xì)胞的數(shù)量×100%。

3統(tǒng)計(jì)學(xué)處理

實(shí)驗(yàn)數(shù)據(jù)用均數(shù)±標(biāo)準(zhǔn)差(mean±SD)表示，多組間均數(shù)比較采用單因素方差分析， 以P<0.05為差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。統(tǒng)計(jì)圖均由GraphPad Prism 5.0軟件繪制。

結(jié) 果

1PBF在骨肉瘤細(xì)胞系中的表達(dá)

分別使用RT-PCR以及Western blot的方法檢測(cè)PBF在骨肉瘤細(xì)胞系中的表達(dá)，從圖1中可以看出，PBF在U2OS和Saos-2骨肉瘤細(xì)胞系中均有表達(dá)。

Figure 1. The mRNA (A) and protein (B) expression of PBF in the osteosarcoma cell lines determined by RT-PCR and Western blot.

圖1骨肉瘤細(xì)胞系中PBF的表達(dá)

2PBFHLA-A2限制性CTL表位的預(yù)測(cè)結(jié)果

依據(jù)NetCTL 1.2、SYFPEITHI和IEDB軟件的結(jié)果，選取在各個(gè)預(yù)測(cè)軟件中分值排名靠前的表位肽，根據(jù)這3個(gè)預(yù)測(cè)軟件進(jìn)行綜合打分，篩選出分值在各個(gè)軟件中打分較好的CTL表位肽，對(duì)篩選的表位肽進(jìn)行氨基酸替換，軟件預(yù)測(cè)的改造表位的打分情況見表1。

表1PBFHLA-A2限制性CTL表位的預(yù)測(cè)結(jié)果

Table 1. Prediction scores of the HLA-A2 restricted epitope peptides derived from PBF

PeptideSequence ScoreIEDBNetCTLSYFPEITHIP75?1Y2LYLPGQKVYV0．51．211326P169MAAMVLTSL0．90．837222P412ALPSFQIPV0．11．362923P412?1YYLPSFQIPV0．21．499723P107WLLEQKLQV0．41．054725P107?1YYLLEQKLQV0．31．350427P416FQIPVSPHI0．20．92614P416?1Y2L9VYLIPVSPHV0．21．418027P289KVLRSIVGI0．70．936222P435SAACSLSPV0．70．900722P435?1Y2LYLACSLSPV0．21．476228HBcAg18?27FLPSDFFPSV0．20．801024

3表位肽/HLA-A2分子結(jié)合力實(shí)驗(yàn)結(jié)果

P75-1Y2L、P412-1Y、P416-1Y2L9V、P107-1Y和P435-1Y2L具有較好的HLA-A2結(jié)合力(FI>1)；經(jīng)過改造后的表位肽明顯提高與MHC分子結(jié)合能力，見表2。

表2候選肽與HLA-A*0201分子結(jié)合力結(jié)果

Table 2. The data of the HLA-A*0201-binding affinity of the candidate peptides derived from PBF

PeptideESI?MS[M+H]+CalculatedObservedFIP75?1Y2L1066．21066．41．32P412971．2972．60．62P412?1Y1063．21062．21．46P107?1Y1133．31134．30．89P4161037．21037．80．86P416?1Y2L9V1024．21024．61．54P1071156．41156．80．67P107?1Y1133．31134．31．68P435833．9834．90．58P435?1Y2L952．1952．61．42HBcAg18?271155．31156．31．66

FI = [mean fluorescence intensity (MFI) of the peptide-MFI background]/MFI background.4IFN-γ分泌水平的檢測(cè)

根據(jù)結(jié)合力的實(shí)驗(yàn)結(jié)果，我們選擇了高結(jié)合力的多肽進(jìn)行實(shí)驗(yàn)，結(jié)果顯示： P412、P412-1Y、P416、P416-1Y2L9V和P435-1Y2L多肽疫苗能檢測(cè)到特異性T細(xì)胞免疫，能分泌較多的IFN-γ；P412-1Y、P416-1Y2L9V和P435-1Y2L誘導(dǎo)特異性T細(xì)胞免疫分泌的IFN-γ略高于原肽，見圖2。

Figure 2. ELISPOT assay to measure IFN-γ release by CTLs induced from PBMCs of healthy donors. CTLs induced by PBS and irrelevant peptide HBcAg18-27were taken as negative control. Mean±SD.n=3.**P<0.01vsPBS group；△P<0.05vsP412 group；▲P<0.05vsP416 group.

圖2ELISPOT法檢測(cè)PBF候選表位肽特異性CTL分泌IFN-γ的能力

5LDH法檢測(cè)細(xì)胞毒性

根據(jù)IFN-γ分泌水平結(jié)果，我們將有效果的P412、P412-1Y、P416和P416-1Y2L9V做進(jìn)一步的免疫活性檢測(cè)。LDH釋放實(shí)驗(yàn)結(jié)果顯示，P412、P412-1Y、P416和P416-1Y2L9V誘導(dǎo)得到的CTL在不同效靶比(12.5∶1、25∶1和50∶1)時(shí)對(duì)PBF表達(dá)陽性的骨肉瘤細(xì)胞系U2OS(HLA-A2+)的殺傷率均明顯高于陰性對(duì)照(PBS)組和無關(guān)肽(HBcAg18-27)組(P<0.01)，見圖3。

6CFSE熒光染色檢測(cè)細(xì)胞毒性的實(shí)驗(yàn)結(jié)果

候選肽所誘導(dǎo)產(chǎn)生的CTL，隨著效靶比的提高殺傷效果相應(yīng)提高。P412和P412-1Y誘導(dǎo)得到的CTL在效靶比為50∶1時(shí)對(duì)荷肽T2A2的殺傷率分別是23.0%和35.2%，P416和P416-1Y2L9V誘導(dǎo)得到的CTL在效靶比為50∶1時(shí)對(duì)荷肽T2A2的殺傷率分別是25.5%和32.3%，見圖4。

Figure 3. Specific lysis of U2OS cells (HLA-A2+) by the CTLs generated from PBMCs of healthy donors. CTLs were induced by PBF-derived peptides and their analogues. A: P412 and P412-1Y; B: P416 and P416-1Y2L9V. The effector/target (E/T) ratios were 12.5∶1, 25∶1 and 50∶1. The levels of LDH release were detected. CTLs induced by PBS and irrelevant peptide HBcAg18-27were used as negative control. Mean±SD.n=3.**P<0.01vsPBS group.

圖3P412和P416候選肽及其類似物誘導(dǎo)得到的CTL在不同效靶比時(shí)對(duì)靶細(xì)胞U2OS的殺傷情況

討 論

骨與軟組織肉瘤在分子靶向治療方面近年來取得了很大的進(jìn)展，但是除了胃腸道間質(zhì)瘤外，其它類型的肉瘤對(duì)分子靶向治療的療效仍不理想，可能是由于藥物針對(duì)的靶點(diǎn)特異性不強(qiáng)和功能不夠關(guān)鍵所致。免疫治療和基因治療在軟組織肉瘤和膠質(zhì)細(xì)胞腫瘤中尚處于研究階段，盡管在動(dòng)物腫瘤模型中取得了很好的結(jié)果，但在臨床上尚未能達(dá)到預(yù)期的結(jié)果，其原因是尚未掌握很好的、控制高度復(fù)雜的免疫系統(tǒng)的方法，因此目前還存在很多問題有待于解決，如何選擇分子靶向治療藥物并克服耐藥、選擇高效的免疫治療和基因治療的靶點(diǎn)、構(gòu)建具有高度特異性和高免疫源性的疫苗、提高基因治療的轉(zhuǎn)染效率、靶向性和安全性等是目前急需解決的問題。深人研究骨科腫瘤發(fā)展的分子機(jī)制將有利于開發(fā)更多、更特異、更有效的新型靶向治療藥物。腫瘤抗原特異性疫苗含有多種表位，包括Th表位、CTL表位和B細(xì)胞表位等，因此免疫原性也強(qiáng)，僅次于腫瘤細(xì)胞疫苗，可誘導(dǎo)特異性CTL產(chǎn)生和抗體產(chǎn)生，殺死靶細(xì)胞，抑制腫瘤生長，使一些腫瘤患者緩解。細(xì)胞毒性T細(xì)胞是T淋巴細(xì)胞的一部分，具有細(xì)胞毒性，在體細(xì)胞免疫中起重要作用，CTL是抗腫瘤免疫的主要效應(yīng)細(xì)胞，同時(shí)還在抗病毒、抗細(xì)菌中作用突出。

Figure 4. Detection of antigen-specific cytotoxicity by FACS-CTL assay. A: P412 and P412-1Y; B: P416 and P416-1Y2L9V. The effector/target (E/T) ratios were 12.5∶1, 25∶1 and 50∶1. CTLs induced by PBS and irrelevant peptide HBcAg18-27were used as negative control.**P<0.01vsPBS group.

圖4CFSE法特異性CTL的體外細(xì)胞毒實(shí)驗(yàn)結(jié)果

在本研究中，我們檢查了腫瘤相關(guān)抗原PBF的HLA-A*0201結(jié)合肽的免疫原性。CTL識(shí)別腫瘤相關(guān)抗原是發(fā)展抗原特異性癌癥免疫治療的首要條件。然而，鑒于在建立自體腫瘤-CTL的技術(shù)難度，基于自體的抗原鑒定主要來自黑素瘤和腎細(xì)胞癌。在其它腫瘤，包括骨和軟組織肉瘤，已經(jīng)使用反向免疫學(xué)方法，并且已經(jīng)定義了來自腫瘤特異性融合基因的抗原肽，例如滑膜肉瘤中的SYT-SSX[24-25]、尤文氏肉瘤中的EWS-FLI1[23]和肺泡橫紋肌肉瘤中的PAX3-FKHR[26-27]。因?yàn)橥ㄟ^反向方法定義的肽不都是在腫瘤細(xì)胞中加工，所以在臨床應(yīng)用之前需要嚴(yán)格評(píng)價(jià)這些合成肽。事實(shí)上，來自12名患有慢性骨髓性白血病[28]，12名患有尤文氏肉瘤[26]和4名患有肺泡橫紋肌肉瘤的患者中，僅在具有尤文氏肉瘤的單個(gè)患者中導(dǎo)致腫瘤緩解。PBF來源的多肽可以進(jìn)一步有效地提高骨肉瘤患者的存活率，特別是對(duì)當(dāng)前化療方案沒有效果的患者?？乖?MHC-I 類分子復(fù)合物的形式表達(dá)于細(xì)胞表面，供特異性 CD8+T 細(xì)胞識(shí)別[28-29]。天然 CTL 表位與 MHC-I 的親和力較弱，也容易引起機(jī)體的免疫耐受，并且在體內(nèi)易受蛋白酶的攻擊水解。針對(duì)這些不足，國內(nèi)外許多學(xué)者采用了不同的方法對(duì)天然 CTL 表位進(jìn)行改造[22]。1993年，Sundara等[30]證明HLA-A2.1結(jié)合基序可以被定位在位置2(P2)的亮氨酸(L)或甲硫氨酸(M)和位置9(P9)的亮氨酸(L)、纈氨酸(V)或異亮氨酸(I)。Tourdot等[31]表明，酪氨酸P1的替代可以提高HLA-A2-限制性表位的免疫原性。

預(yù)測(cè)T細(xì)胞表位的生物信息學(xué)方法很多，在本次研究中，選擇NetCTL 1.2、SYFPEITHI和IEDB等預(yù)測(cè)軟件，綜合這3個(gè)軟件的打分結(jié)果進(jìn)行初步的表位篩選，篩選出的優(yōu)勢(shì)表位，在氨基酸1、2、9位置進(jìn)行適當(dāng)?shù)奶鎿Q，所有的表位進(jìn)行結(jié)合力實(shí)驗(yàn)，從結(jié)合力實(shí)驗(yàn)看出，經(jīng)過氨基酸替換后的表位，可以提高M(jìn)HC分子與表位肽的結(jié)合。隨后對(duì)親和力較高的表位進(jìn)行體外免疫活性檢測(cè)，結(jié)果顯示，P412、P412-1Y、P416和P416-1Y2L9V多肽表位疫苗能檢測(cè)到特異性T細(xì)胞免疫，可以分泌較多的IFN-γ。并且這4條肽對(duì)靶細(xì)胞具有殺傷作用。表位的改造可以增強(qiáng)HLA的結(jié)合能力和T細(xì)胞(抗原)受體(T-cell receptor，TCR)的識(shí)別能力，可以更加有效的打破免疫耐受，氨基酸替換在多肽表位中可以有效地誘導(dǎo)肽特異性CTLs。多肽進(jìn)行修飾可增加多肽在體內(nèi)的半衰期，防止酶類的降解，提高其穩(wěn)定性。對(duì)天然性多肽進(jìn)行修飾是一條值得探索的腫瘤免疫治療途徑。

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(責(zé)任編輯： 盧 萍， 羅 森)

Identification and molecular modification of cytotoxic T-lymphocyte epitopes from osteosarcoma high-expressing antigen PBF

ZHANG Jian-xin1, SHI Ran-ran2

(1XuchangUniversity,Xuchang461000,China;2LuoheMedicalCollege,Luohe462002,China.E-mail:ranranpeptide@163.com)

AIM: To observe whether modified epitopes from osteosarcoma high-expressing antigen papillomavirus-binding factor (PBF) have HLA-A2 restricted antitumor ability， and to develop peptide-based immunotherapy for osteosarcoma.METHODSRT-PCR and Western blot were used to determine the expression of PBF in the osteosarcoma cell lines U2OS and Saos-2. HLA-A2 epitopes from PBF protein were predicted by NetCTL 1.2， SYFPEITHI and IEDB. The modified peptides from PBF containing HLA-A2 binding anchor motifs were designed by replacing the anchor residues. The peptides were synthesized by standard solid-phase methods， and the binding affinity of the peptides to HLA-A*0201 was evaluated by T2A2 cell binding assay. ELISPOT assay was used to investigate the seretion of interferon-γ (IFN-γ) from the peptide-induced specific cytotoxic T-lymphocytes (CTLs). The ability of inducing T-cell response was analyzed by lactate dehydrogenase (LDH) release assay and carboxyfluorescein succinimidyl ester (CFSE) cytotoxicity assayinvitro.RESULTSThe expression of PBF was observed in the U2OS and Saos-2 cells. The candidate peptides P75-1Y2L, P412-1Y, P416-1Y2L9V, P107-1Y and P435-1Y2L showed moderate affinity toward HLA-A2 molecule. The modified peptides showed significantly higher affinity with HLA-A2 than the native peptide. ELISPOT assay showed that P412, P412-1Y, P416, P416-1Y2L9V and P435-1Y2L induced specific CTLs to secrete IFN-γ， and P412-1Y and P416-1Y2L9V induced more secretion of IFN-γ than the native peptide. The CTLs induced by P412, P412-1Y， P416 and P416-1Y2L9V lysed U2OS cells. P412-1Y and P416-1Y2L9V peptide-specific CTLs showed higher cytotoxicity against U2OS cells than the native peptide-specific CTLs.CONCLUSIONCompared with the native peptide, modified epitopes P412-1Y and P416-1Y2L9V have higher binding affinity with HLA-A*0201 and retain immunogenecity. In addition, the anti-tumor immunity effects of modified epitopes P412-1Y and P416-1Y2L9V are stronger than the native peptide. The peptides P412-1Y and P416-1Y2L9V is excellent HLA-A*0201 restricted CTL epitopes from tumor antigen PBF, which could serve as new candidates towards antitumor peptide vaccines.

Papillomavirus-binding factor; Epitopes; Cytotoxic T-lymphocyte; Osteosarcoma

1000- 4718(2017)11- 1993- 07

2017- 05- 04

2017- 06- 06

河南省科技廳科技發(fā)展計(jì)劃項(xiàng)目(No. 142102310203)；漯河醫(yī)學(xué)高等專科學(xué)?？蒲谢鹳Y助項(xiàng)目(No. 2017-S-LMC-3)

△通訊作者 Tel: 0395-2964509; E-mail: ranranpeptide@163.com

R738.1； R392.3

A

10.3969/j.issn.1000- 4718.2017.11.012