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    千金藤素通過(guò)調(diào)節(jié)miR-150和miR-182促進(jìn)A549細(xì)胞凋亡*

    2017-11-22 03:16:42郝瑞敏謝書陽(yáng)韓婉虹閻云飛孫允霄李有杰
    中國(guó)病理生理雜志 2017年11期
    關(guān)鍵詞:千金調(diào)控引物

    郝瑞敏, 謝書陽(yáng), 韓婉虹, 閻云飛, 孫允霄, 岳 真, 馬 穎, 李有杰

    (濱州醫(yī)學(xué)院山東省高校腫瘤分子生物學(xué)重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室, 生物化學(xué)與分子生物學(xué)教研室, 山東 煙臺(tái) 264003)

    千金藤素通過(guò)調(diào)節(jié)miR-150和miR-182促進(jìn)A549細(xì)胞凋亡*

    郝瑞敏, 謝書陽(yáng), 韓婉虹, 閻云飛, 孫允霄, 岳 真, 馬 穎, 李有杰△

    (濱州醫(yī)學(xué)院山東省高校腫瘤分子生物學(xué)重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室, 生物化學(xué)與分子生物學(xué)教研室, 山東 煙臺(tái) 264003)

    目的探討千金藤素對(duì)人肺癌A549細(xì)胞生長(zhǎng)的影響及可能機(jī)制。方法千金藤素處理A549細(xì)胞后,采用MTT法檢測(cè)細(xì)胞生長(zhǎng)抑制率;倒置顯微鏡觀察細(xì)胞形態(tài)變化;流式細(xì)胞術(shù)檢測(cè)細(xì)胞凋亡;real-time PCR檢測(cè)微小RNA(miR)-150、miR-182、p53 mRNA和FOXO1 mRNA的表達(dá)變化;通過(guò)軟件預(yù)測(cè)miR-150和miR-182的下游靶基因;采用Western blot法分析細(xì)胞中p53和FOXO1蛋白表達(dá)的變化。結(jié)果在千金藤素作用下,A549細(xì)胞生長(zhǎng)受到抑制,凋亡率明顯增加;千金藤素作用后,細(xì)胞內(nèi)miR-150和miR-182的表達(dá)水平顯著下降;在10 μmol/L的千金藤素作用后,細(xì)胞內(nèi)p53和FOXO1的表達(dá)水平升高,而在30 μmol/L時(shí),細(xì)胞內(nèi)p53和FOXO1的表達(dá)水平降低;在細(xì)胞內(nèi)轉(zhuǎn)染miR-150后,p53表達(dá)明顯減少,而轉(zhuǎn)染miR-182后,F(xiàn)OXO1表達(dá)顯著降低。結(jié)論千金藤素能夠抑制A549細(xì)胞生長(zhǎng),促進(jìn)A549細(xì)胞凋亡,可能是通過(guò)抑制miR-150和miR-182表達(dá)發(fā)揮作用;而miR-150和miR-182可能分別通過(guò)下調(diào)p53和FOXO1的表達(dá)發(fā)揮作用。

    千金藤素; 微小RNA-150; 微小RNA-182; p53; FOXO1

    千金藤素(cepharanthine,CEP)是從千金藤屬植物千金藤、地不容和白藥子中提取出的一種雙芐基異喹啉類生物堿。千金藤素通過(guò)刺激動(dòng)物網(wǎng)狀內(nèi)皮系統(tǒng)、活化造血組織和促進(jìn)骨髓組織增生,起到促進(jìn)白細(xì)胞升高的作用,在臨床上主要用于治療矽肺和癌癥患者化療后白細(xì)胞減少[1]。也有研究結(jié)果表明,千金藤素可以通過(guò)衰減炎癥、脂質(zhì)過(guò)氧化和細(xì)胞遷移和增殖,發(fā)揮有效的抗動(dòng)脈粥樣硬化作用[2]。此外,還可通過(guò)克服P糖蛋白介導(dǎo)的藥物外排,逆轉(zhuǎn)惡性腫瘤細(xì)胞的抗藥性,從而提高治療效果[3]。

    微小RNA(microRNA,miRNA,miR)是一類短小的非編碼小RNA,長(zhǎng)約18~25個(gè)堿基[4]。它可以通過(guò)與相應(yīng)mRNA的3′非翻譯區(qū)(3′untranslated region,3′UTR)完全或不完全結(jié)合,導(dǎo)致mRNA的降解或抑制mRNA的翻譯,起到轉(zhuǎn)錄后調(diào)控基因表達(dá)的作用。真核生物內(nèi)源性的miRNA是高度保守的,對(duì)細(xì)胞增殖、分化和凋亡等基本生命活動(dòng)的過(guò)程具有重要調(diào)控作用[5]。一種miRNA可以調(diào)控多個(gè)基因的表達(dá),而多個(gè)miRNA也可以調(diào)控同一個(gè)基因的表達(dá)[6]。本研究觀察千金藤素對(duì)肺癌A549細(xì)胞的生長(zhǎng)影響,通過(guò)檢測(cè)細(xì)胞內(nèi)miRNA的表達(dá)情況,探討千金藤素能否通過(guò)調(diào)節(jié)miRNA的表達(dá),進(jìn)一步影響肺癌細(xì)胞生長(zhǎng)。

    材 料 和 方 法

    1材料

    千金藤素、胰蛋白酶、MTT和DMSO購(gòu)自Sigma;肺癌細(xì)胞株A549購(gòu)自中科院上海細(xì)胞生物學(xué)研究所;RPMI-1640培養(yǎng)基和胎牛血清購(gòu)自Gibco;Lipofectamine 2000購(gòu)自Invitrogen;miRNA提取試劑盒和real-time PCR試劑購(gòu)自TaKaRa;Annexin V-FITC/PI 購(gòu)自南京凱基生物公司;反轉(zhuǎn)錄試劑盒購(gòu)自Fermentas;兔抗人單克隆抗體購(gòu)自BioWorld;羊抗兔IgG購(gòu)自北京中杉金橋公司;miR-150和miR-182 mimics由上海吉瑪公司合成;其它試劑為國(guó)產(chǎn)分析純。

    2主要方法

    2.1細(xì)胞培養(yǎng) 將凍存的A549細(xì)胞復(fù)蘇后,接種于培養(yǎng)瓶中,加入含有10%胎牛血清的RPMI-1640培養(yǎng)基中,置于37 ℃、5% CO2飽和濕度環(huán)境中培養(yǎng),2 d傳代 1 次,取對(duì)數(shù)生長(zhǎng)期細(xì)胞進(jìn)行實(shí)驗(yàn)。

    2.2MTT法檢測(cè)細(xì)胞活力 將生長(zhǎng)狀況良好處于對(duì)數(shù)生長(zhǎng)期的A549細(xì)胞接種到96孔板中,每孔接種5.0×103個(gè)細(xì)胞,加入100 μL培養(yǎng)液,周圍孔用無(wú)菌PBS填充。培養(yǎng)24 h后用不同濃度(10、20和30 μmol/L)的千金藤素處理細(xì)胞。藥物作用24 h后,用含0.5% MTT的培養(yǎng)基繼續(xù)培養(yǎng)4 h,吸去培養(yǎng)基,每孔加入100 μL DMSO,置酶標(biāo)儀中振蕩5 min,使結(jié)晶物充分溶解,于570 nm波長(zhǎng)處測(cè)量各孔吸光度(A)值,按照下述公式計(jì)算細(xì)胞活力抑制率:細(xì)胞活力抑制率(%)=(A對(duì)照組-A實(shí)驗(yàn)組)/A對(duì)照組。

    2.3倒置顯微鏡觀察細(xì)胞形態(tài) 用不同濃度(10、20和30 μmol/L)千金藤素作用細(xì)胞24 h后,使用倒置顯微鏡觀察A549細(xì)胞的形態(tài)變化。

    2.4流式細(xì)胞術(shù)檢測(cè)細(xì)胞凋亡率 將生長(zhǎng)狀況良好處于對(duì)數(shù)生長(zhǎng)期的A549細(xì)胞接種到6孔板中,每孔接種2.0×105細(xì)胞,加入2 mL培養(yǎng)液,培養(yǎng)24 h后用0 μmol/L、10 μmol/L、20 μmol/L和30 μmol/L的千金藤素處理細(xì)胞,藥物作用24 h后,收集細(xì)胞。用不含EDTA的胰酶消化6孔板細(xì)胞,1 500 r/min離心5 min,用無(wú)菌PBS洗滌2次,1 500 r/min離心5 min。加入400 μL 1×Binding Buffer重懸細(xì)胞;加入4 μL AnnexinⅤ-FITC混勻后,再加入4 μL propidium iodide混勻。室溫下避光反應(yīng)5~15 min。1 h內(nèi)上機(jī)檢測(cè)細(xì)胞凋亡情況。

    2.5Real-time PCR檢測(cè)細(xì)胞內(nèi)miR-150和miR-182的表達(dá) 收集細(xì)胞,應(yīng)用miRNA提取試劑盒提取miRNA;通過(guò)瓊脂糖凝膠電泳檢測(cè)提取的miRNA的純度,加尾并反轉(zhuǎn)錄得到cDNA,反轉(zhuǎn)錄引物為5’-AACATGTACAGTCCATGGATGT30- 3’;通過(guò)real-time PCR檢測(cè)細(xì)胞內(nèi)miR-150和miR-182的表達(dá)水平。miR-150的上游引物為5’-TCCCAACCCTTATACCAGT-3’;miR-182的上游引物為5’-GGCAATGGTAGAACTCACACT-3’; 人 5S rRNA 的上游引物為5’-GCCATACCACCCTGAACG-3’;共同下游引物為5’-AACATGTACAGTCCATGGATG-3’。PCR 的擴(kuò)增條件為 94 ℃ 30 s、54 ℃ 30 s、72 ℃ 30 s,各擴(kuò)增40個(gè)循環(huán),在每個(gè)循環(huán)的 72 ℃時(shí)測(cè)定熒光量。

    2.6Real-time PCR檢測(cè)細(xì)胞內(nèi)p53和FOXO1的表達(dá) 收集細(xì)胞,提取總RNA;通過(guò)瓊脂糖凝膠電泳檢測(cè)提取的總RNA的純度,反轉(zhuǎn)錄得到cDNA;通過(guò)實(shí)時(shí)定量PCR檢測(cè)細(xì)胞內(nèi)p53和FOXO1的表達(dá)水平,引物及擴(kuò)增長(zhǎng)度見表1。

    表1 引物序列

    2.7miR-150和miR-182轉(zhuǎn)染A549細(xì)胞 將生長(zhǎng)狀況良好處于對(duì)數(shù)生長(zhǎng)期的A549細(xì)胞接種到6孔板中,用Lipofectamine 2000轉(zhuǎn)染miR-150、miR-182和negative control mimics入細(xì)胞,繼續(xù)培養(yǎng)24 h。

    2.8Western blot檢測(cè)細(xì)胞內(nèi)p53和FOXO1蛋白的表達(dá) 轉(zhuǎn)染miR-150、miR-182和negative control mimics 24 h后收集細(xì)胞,加入適量裂解液和蛋白酶抑制劑,冰上裂解20~30 min,12 000 r/min離心10 min。吸上清液于新的EP管中,加入5×SDS上樣緩沖液,90 ℃煮10 min;電泳結(jié)束后,用轉(zhuǎn)膜儀將蛋白轉(zhuǎn)至PVDF膜;用5%的奶粉將膜封閉2 h;洗膜后加 I 抗,4 ℃過(guò)夜;洗膜,加 II 抗,4 ℃ 2 h;加化學(xué)發(fā)光反應(yīng)混合液,反應(yīng)后進(jìn)行曝光。

    3統(tǒng)計(jì)學(xué)處理

    采用SPSS 17.0統(tǒng)計(jì)軟件進(jìn)行結(jié)果分析。數(shù)據(jù)均采用均數(shù)±標(biāo)準(zhǔn)差(mean±SD)表示,多組間比較采用單因素方差分析(one-way ANOVA),組間兩兩比較采用最小顯著性差異法(LSD法),以P<0.05為差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

    結(jié) 果

    1光鏡下觀察A549細(xì)胞的形態(tài)學(xué)變化

    光鏡下觀察發(fā)現(xiàn),不同濃度千金藤素作用于A549細(xì)胞24 h后,隨著藥物濃度的升高,細(xì)胞體積變小,數(shù)目減少,細(xì)胞皺縮變圓,貼壁不牢,死細(xì)胞增多,見圖1。

    Figure 1. The morphology of A549 cells treated with different concentrations of CEP under inverted microscope (×100).

    圖1倒置顯微鏡下觀察A549細(xì)胞的形態(tài)

    2千金藤素可使A549細(xì)胞活力抑制率升高

    不同濃度千金藤素作用于A549細(xì)胞24 h后,細(xì)胞生長(zhǎng)受到抑制(P<0.01),并且隨藥物濃度的升高,抑制作用更明顯,見圖2。

    3千金藤素可使A549細(xì)胞凋亡率增高

    千金藤素作用于A549細(xì)胞24 h后,隨著藥物濃度的升高,胞凋亡率升高。表明千金藤素可以誘導(dǎo)A549細(xì)胞凋亡,見圖3。

    4千金藤素可下調(diào)A549細(xì)胞內(nèi)miR-150和miR-182的表達(dá)

    在千金藤素作用后,與對(duì)照組相比,細(xì)胞內(nèi)miR-150和miR-182的表達(dá)水平均顯著下降(P<0.01)。這一結(jié)果提示miR-150和miR-182這2種miRNA均具有癌基因的功能,千金藤素使A549細(xì)胞凋亡增多可能是通過(guò)降低miR-150和miR-182的表達(dá)而發(fā)揮作用的,見圖4。

    Figure 2. The effect of CEP on A549 cell growth detected by MTT assay. Mean±SD.n=3.**P<0.01vs0 μmol/L group.

    圖2MTT法檢測(cè)千金藤素對(duì)A549細(xì)胞活力的影響

    Figure 3. The effect of CEP on the apoptotic rate of A549 cells detected by flow cytometry. Mean±SD.n=3.**P<0.01vs0 μmol/L group.

    圖3流式細(xì)胞術(shù)檢測(cè)千金藤素對(duì)A549細(xì)胞凋亡率的影響

    Figure 4. The effect of CEP on the expression of miR-150 and miR-182 in the A549 cells. Mean±SD.n=3.**P<0.01vs0 μmol/L group.

    圖4千金藤素對(duì)A549細(xì)胞中miR-150和miR-182表達(dá)的影響

    5低濃度千金藤素上調(diào)A549細(xì)胞內(nèi)p53和FOXO1的mRNA表達(dá)

    在10 μmol/L千金藤素作用后,與對(duì)照組相比,細(xì)胞內(nèi)p53和FOXO1的表達(dá)水平升高(P<0.01);而在30 μmol/L時(shí),細(xì)胞內(nèi)p53和FOXO1的表達(dá)水平降低(P<0.01)。這一結(jié)果提示千金藤素在低濃度時(shí)可能通過(guò)上調(diào)細(xì)胞內(nèi)p53和FOXO1的表達(dá)而發(fā)揮作用;藥物濃度升高到30 μmol/L后,細(xì)胞內(nèi)p53和FOXO1的表達(dá)反而降低,其機(jī)制有待進(jìn)一步探討,見圖5。

    6miR-150可抑制p53蛋白表達(dá),miR-182可抑制FOXO1蛋白表達(dá)

    通過(guò)TargetScan (http://www.targetscan.org/)microRNA.org (http://www.microrna.org/)和 miRBase(http://www.mirbase.org/)等預(yù)測(cè)軟件分析發(fā)現(xiàn)p53和FOXO1的3′UTR區(qū)分別存在miR-150和miR-182的調(diào)節(jié)位點(diǎn),見圖6。在轉(zhuǎn)染miR-150后,檢測(cè)到細(xì)胞內(nèi)p53蛋白的表達(dá)降低;而轉(zhuǎn)染miR-182后,細(xì)胞內(nèi)FOXO1蛋白的表達(dá)降低,提示miR-150和miR-182可能分別通過(guò)調(diào)控抑癌基因p53和FOXO1的表達(dá)而促進(jìn)細(xì)胞的生長(zhǎng),見圖7。

    Figure 5. The effect of CEP on the mRNA expression of p53 and FOXO1 in the A549 cells. Mean±SD.n=3.**P<0.01vs0 μmol/L group.

    圖5千金藤素對(duì)A549細(xì)胞中p53和FOXO1表達(dá)的影響

    Figure 6. The results of bioinformatic analysis to predict the target genes of miR-150 and miR-182 by the software searching.

    圖6生物信息學(xué)軟件預(yù)測(cè)miR-150和miR-182的靶基因

    討 論

    千金藤素具有抗腫瘤和抗炎等功能,研究發(fā)現(xiàn),千金藤素可以刺激巨噬細(xì)胞產(chǎn)生IL-1從而發(fā)揮抗腫瘤的功能[7-8]。本研究表明,千金藤素可以抑制肺癌A549細(xì)胞生長(zhǎng),促進(jìn)其凋亡。miRNA 是一段由 18~25 個(gè)核苷酸組成的小片段RNA,廣泛存在于真核生物中,在基因表達(dá)調(diào)控中發(fā)揮重要作用,為疾病的生物學(xué)防治提供一個(gè)新的方向。miR-1284在胃癌細(xì)胞中發(fā)揮抑癌基因的功能,其機(jī)制可能通過(guò)調(diào)控其靶基因JAG1的表達(dá)以發(fā)揮作用[9]。胡明等[10]研究發(fā)現(xiàn)過(guò)表達(dá) miR-486-5p可促進(jìn)氧化應(yīng)激引起的人骨髓間充質(zhì)干細(xì)胞凋亡,進(jìn)一步研究發(fā)現(xiàn)它可能參與調(diào)控 Akt 通路。

    Figure 7. The related protein levels in the A549 cells. Mean±SD.n=3.**P<0.01vsblank or negative control group.

    圖7各組A549細(xì)胞相關(guān)蛋白表達(dá)的比較

    本研究嘗試從miRNA角度探討千金藤素在促A549細(xì)胞凋亡中的機(jī)制,發(fā)現(xiàn)miR-150和miR-182在千金藤素作用后表達(dá)降低,推測(cè)可能是通過(guò)影響具有癌基因功能的miRNA而發(fā)揮作用的。為明確機(jī)制,研究進(jìn)一步通過(guò)生物信息學(xué)軟件預(yù)測(cè)到miR-150可能調(diào)控的靶基因包括p53等,miR-182的下游基因包括FOXO1等。

    miR-150與多種腫瘤的發(fā)生發(fā)展相關(guān),Wu等[11]研究發(fā)現(xiàn)miR-150可以負(fù)性調(diào)控凋亡相關(guān)基因EGR2,從而促進(jìn)胃癌細(xì)胞的增殖。還有研究發(fā)現(xiàn),miR-150的表達(dá)升高是腫瘤浸潤(rùn)深度的危險(xiǎn)因素,此外,miR-150的表達(dá)水平與直腸腫瘤患者的總生存期和對(duì)化療的反應(yīng)有關(guān)[12]。本研究發(fā)現(xiàn),A549細(xì)胞內(nèi)過(guò)表達(dá)miR-150可以促進(jìn)細(xì)胞的增殖,其機(jī)制是通過(guò)下調(diào)p53蛋白而發(fā)揮作用。

    miR-182在多種腫瘤中作為癌基因存在,Li等[13]在結(jié)腸癌中的研究發(fā)現(xiàn)miR-182在腫瘤組織中的表達(dá)水平顯著高于臨近正常組織,且miR-182可以降低FOXO1的表達(dá)。無(wú)論在乳腺癌還是結(jié)腸癌中miR-182均促進(jìn)腫瘤細(xì)胞的遷移和侵襲[14-15]。Wallis等[16]研究發(fā)現(xiàn)miR-182在侵襲性前列腺癌中表達(dá)升高,miR-182表達(dá)導(dǎo)致腫瘤細(xì)胞體外增殖、遷移和侵襲增加,進(jìn)一步的機(jī)制研究發(fā)現(xiàn),miR-182可能通過(guò)抑制FOXO1發(fā)揮作用。本研究首次在A549細(xì)胞中探討了miR-182對(duì)FOXO1的表達(dá)調(diào)控作用,結(jié)果與其它腫瘤中的研究結(jié)論一致。

    綜上所述,千金藤素促進(jìn)肺癌細(xì)胞A549凋亡可能是通過(guò)抑制miR-150和miR-182的表達(dá)實(shí)現(xiàn)的;miR-150可抑制靶基因p53的表達(dá),而miR-182可下調(diào)靶基因FOXO1的表達(dá),在A549細(xì)胞中,二者均具有癌基因的功能。這些研究結(jié)果的發(fā)現(xiàn),為肺腺癌的生物學(xué)防治提供了一個(gè)新的潛在靶點(diǎn),值得深入研究。

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    (責(zé)任編輯: 林白霜, 羅 森)

    Cepharanthine promotes A549 cell apoptosis by regulating miR-150 and miR-182

    HAO Rui-min, XIE Shu-yang, HAN Wan-hong, YAN Yun-fei, SUN Yun-xiao, YUE Zhen, MA Ying, LI You-jie

    (KeyLaboratoryofTumourMolecularBiologyinShandongProvincialUniversities,DepartmentofBiochemistryandMolecularBiology,BinzhouMedicalUniversity,Yantai264003,China.E-mail:youjie1979@163.com)

    AIM: To investigate the effect of cepharanthine on the growth of human lung carcinoma A549 cells and the underlying mechanism.METHODSAfter A549 cells were treated with cepharanthine, the growth inhibitory rate was detected by MTT assay. The cell morphological changes were observed under light microscope. The apoptosis of the A549 cells was analyzed by flow cytometry. The expression of microRNA (miR)-150, miR-182, p53 mRNA and FOXO1 mRNA were detected by real-time PCR. The downstream target genes were predicted by software, and the expression of p53 and FOXO1 was determined by Western blot.RESULTSAfter cepharanthine treatment, the growth of A549 cells was inhibited, the apoptosis rate was significantly increased, and the expression levels of miR-150 and miR-182 were significantly decreased. With cepharanthine treatment at 10 μmol/L, the expression levels of p53 and FOXO1 were elevated; however, with cepharanthine at 30 μmol/L, the expression levels of p53 and FOXO1 were decreased. After transfection with miR-150, the expression of p53 was significantly decreased, while the expression of FOXO1 was significantly decreased after transfection with miR-182.CONCLUSIONCepharanthine inhibits the growth of A549 cells and promotes the apoptosis of A549 cells by inhibiting the expression of miR-150 and miR-182. miR-150 and miR-182 may down-regulate the expression of p53 and FOXO1, respectively.

    Cepharanthine; MicroRNA-150; MicroRNA-182; p53; FOXO1

    1000- 4718(2017)11- 1987- 06

    2017- 04- 24

    2017- 06- 13

    國(guó)家自然科學(xué)基金資助項(xiàng)目(No. 31371321);山東省自然科學(xué)基金資助項(xiàng)目(No. ZR2014HQ079; No. ZR2013HL003; No. ZR2014HL056);山東省高??萍加?jì)劃(No. J13LE11)

    △通訊作者 Tel: 0535-6913211; E-mail: youjie1979@163.com

    R363; R285.5

    A

    10.3969/j.issn.1000- 4718.2017.11.011

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