大鼠心肌細(xì)胞H9C2活性氧水平檢測方法探究

丁雨，陳雪梅，吳思思

（四川大學(xué)華西醫(yī)院公共實驗技術(shù)中心，四川 成都 610041）

大鼠心肌細(xì)胞H9C2活性氧水平檢測方法探究

丁雨，陳雪梅，吳思思

（四川大學(xué)華西醫(yī)院公共實驗技術(shù)中心，四川 成都 610041）

目的 比較3種細(xì)胞內(nèi)活性氧（ROS）的檢測方法，分析優(yōu)缺點(diǎn)，篩選1種合適、準(zhǔn)確的檢測大鼠心肌細(xì)胞H9C2缺氧/復(fù)氧（H/R）模型中細(xì)胞內(nèi)活性氧的方法。方法 培養(yǎng)H9C2細(xì)胞，選擇密度合適（80%～90%）的H9C2細(xì)胞進(jìn)行鋪板，加入2，7-雙乙酸二氯熒光素（DCFH-DA）熒光探針孵育，應(yīng)用熒光顯微鏡、流式細(xì)胞儀及熒光酶標(biāo)儀3種方法檢測對照組（正常含氧量培養(yǎng)條件，CON）和實驗組（缺氧復(fù)氧處理，H/R 6h）心肌細(xì)胞的熒光強(qiáng)度，從而反映大鼠心肌細(xì)胞內(nèi)活性氧水平，并利用數(shù)據(jù)分析軟件進(jìn)行統(tǒng)計分析。結(jié)果流式細(xì)胞儀檢測分析結(jié)果：對照組（152 690±34 104）FU/μg，實驗組（325 669±12 755）FU/μg；熒光酶標(biāo)儀檢測分析結(jié)果：對照組（282.3±12.57）FU/μg，實驗組（1 274±37.05）FU/μg。實驗組的 ROS 水平與對照組的ROS水平比較，差異有統(tǒng)計學(xué)意義（P<0.05），實驗組高于對照組，而熒光顯微鏡觀察法無法定量地分析出實驗結(jié)果。結(jié)論 3種ROS檢測方法中，熒光酶標(biāo)儀檢測方法能更好地判斷大鼠心肌細(xì)胞H9C2活性氧水平。

缺氧/復(fù)氧；H9C2細(xì)胞；活性氧

真核細(xì)胞在有氧呼吸過程中，小部分氧不能被完全還原，生成了具有較強(qiáng)氧化作用的活性氧（reactive oxygen species，ROS），包括超氧陰離子（O2-）、羥自由基（HO）、過氧化氫（H2O2）等，正常生命過程中，活性氧維持一個正常水平，具有一定的免疫和信號轉(zhuǎn)導(dǎo)功能，是機(jī)體的有效防御系統(tǒng)[1]。但過多的活性氧存在會對細(xì)胞、機(jī)體造成危害，如在受傷流血過多情況，因供血不足導(dǎo)致機(jī)體處于缺血狀態(tài)，機(jī)體內(nèi)ROS及其反應(yīng)產(chǎn)物增加，抑制蛋白質(zhì)功能，破壞細(xì)胞結(jié)構(gòu)與功能，產(chǎn)生較大危害。ROS作為蛋白質(zhì)氧化損傷的標(biāo)志物，準(zhǔn)確檢測其水平顯得尤為重要。

由于ROS的反應(yīng)活性高，存在時間短，難以捕獲，因此很難直接檢測。在生命科學(xué)中較先使用到了色譜分析、順磁共振和自旋收集等技術(shù)來檢測ROS，這些技術(shù)精度高，但需要購置非常昂貴的儀器，操作時間長很難大規(guī)模推廣，為闡明活性氧的作用機(jī)制，需要不斷尋找新的、敏感的、特異性的檢測工具。近年來，越來越多的研究采用2，7-雙乙酸二氯熒光素（DCFH-DA）熒光探針，且隨著高分辨率的成像系統(tǒng)的發(fā)展，熒光探針以其高敏感性、檢測速度快、操作簡單、數(shù)據(jù)簡化等優(yōu)點(diǎn)，成為了目前檢測ROS水平的最佳工具[2-3]。

隨著DCFH-DA熒光探針應(yīng)用越來越廣泛，不同的熒光檢測手段也越來越多：共聚焦采圖、熒光顯微鏡采圖、流式細(xì)胞儀、分光光度計等，但并不是所有的檢測手段都適用，因此針對不同的樣本探究最適檢測方法尤為必要。

本實驗選擇的熒光染料DCFH-DA，其標(biāo)記細(xì)胞原理是：DCFH-DA本身沒有熒光，具有親脂性，可以自由地穿過細(xì)胞膜，進(jìn)入細(xì)胞后在胞內(nèi)被酯酶水解，去酰基形成有極性的DCFH，而DCFH不能透過細(xì)胞膜，從而很容易被裝載到細(xì)胞內(nèi)。但DCFH不產(chǎn)生熒光，而細(xì)胞內(nèi)存在的ROS能夠氧化DCFH為DCF，在525 nm處檢測到綠色熒光，其DCF形成量與細(xì)胞內(nèi)氧化產(chǎn)物水平呈正相關(guān)，因此，其熒光強(qiáng)度間接代表細(xì)胞內(nèi)過氧化物的水平[4]。

本文利用三氣培養(yǎng)箱復(fù)制大鼠心肌細(xì)胞缺氧模型，采用目前常用的3種檢測方法，對比分析3種方法所得結(jié)果，找出1種或多種適合檢測大鼠心肌細(xì)胞內(nèi)ROS水平的方法。

1 材料與方法

1.1 材料與試劑

大鼠心肌細(xì)胞（H9C2）由四川大學(xué)華西醫(yī)院公共實驗技術(shù)中心保存，DCFH-DA購自美國Sigma公司，胎牛血清購自美國Gibco公司，DMEM高糖培養(yǎng)基、PBS緩沖液購自美國Hyclone公司，BCA定量試劑盒、RIPA裂解液購自廣州碧云天公司，細(xì)胞培養(yǎng)板、細(xì)胞培養(yǎng)瓶及凍存管等購自美國Corning公司。

1.2 儀器與設(shè)備

Synergy Mx多功能熒光酶標(biāo)儀（美國Bio-Tek公司），OBSERVER D1/AX10 cam HRC倒置熒光顯微鏡（德國Zeiss公司），Cytoflex流式細(xì)胞儀（美國Beckman Coulter公司），Integral 10純水儀（美國Millipore公司），二級生物安全柜、三氣培養(yǎng)箱（美國Thermo公司），SX-700高壓滅菌鍋（中國TOMY公司），二氧化碳CO2培養(yǎng)箱（德國Binder公司）。

1.3 方法

1.3.1 細(xì)胞培養(yǎng) 使用High Glucose DMEM（含10%FBS）培養(yǎng) H9C2 細(xì)胞，環(huán)境條件為 37℃、5%CO2，每2天換液1次。用含EDTA的0.25%胰酶消化H9C2細(xì)胞，1 200 r/min離心5 min，棄上清液。用培養(yǎng)基重懸，調(diào)整細(xì)胞濃度至1×105個/ml，將細(xì)胞接種至6孔細(xì)胞培養(yǎng)板中，每孔1 ml；將濃度調(diào)整至5×104個/ml，并接種至12孔板中，每孔1 ml，分別置于細(xì)胞培養(yǎng)箱中培養(yǎng)，37℃、5%CO2、飽和濕度培養(yǎng)。

1.3.2 實驗組缺氧/復(fù)氧處理 培養(yǎng)48 h換液，以后每2天換液1次，至細(xì)胞覆蓋率達(dá)80%后，對照組（CON）細(xì)胞仍放于原培養(yǎng)箱進(jìn)行培養(yǎng)，實驗組[缺氧復(fù)氧處理，缺氧復(fù)氧（hypoxia/reoxygenation，H/R）6 h]細(xì)胞轉(zhuǎn)至三氣培養(yǎng)箱中，缺氧培養(yǎng)6 h后，將實驗組細(xì)胞重新轉(zhuǎn)至普通CO2培養(yǎng)箱中繼續(xù)培養(yǎng)2 h，即復(fù)氧2 h。

1.3.3 細(xì)胞負(fù)載ROS熒光探針 實驗組細(xì)胞培養(yǎng)2 h后，用DCFH-DA作為熒光探針，檢測對照組與實驗組細(xì)胞內(nèi)ROS水平。用High Glucose DMEM（無FBS）稀釋 DCFH-DA，使終濃度達(dá)到 10μm/ml。除去細(xì)胞培養(yǎng)液，分別加入1 ml、0.5 ml稀釋后的DCFH-DA。置于37℃、5%CO2、飽和濕度的細(xì)胞培養(yǎng)箱內(nèi)，孵育20 min。孵育完成后，用High Glucose DMEM（無FBS）洗滌細(xì)胞3次，以充分除去未進(jìn)入細(xì)胞內(nèi)的DCFH-DA，防止液體本底熒光強(qiáng)度過高。對照組、實驗組全部裝載探針結(jié)束后，進(jìn)行細(xì)胞內(nèi)ROS的定性和定量的檢測。

1.3.4 熒光顯微鏡觀察分析細(xì)胞內(nèi)ROS 使用倒置熒光顯微鏡觀察兩組細(xì)胞的熒光強(qiáng)度，并進(jìn)行熒光采圖。

1.3.5 流式細(xì)胞儀檢測細(xì)胞內(nèi)ROS 用0.25%EDTA胰酶消化H9C2細(xì)胞，收集細(xì)胞，PBS洗2次，使用Cytoflex流式細(xì)胞儀檢測各組熒光強(qiáng)度，即細(xì)胞內(nèi)ROS的強(qiáng)度，并使用Cytoflex軟件進(jìn)行分析。平均FL1-A量（Mean FITC-A）可作為ROS強(qiáng)度的定量依據(jù)。

1.3.6 熒光酶標(biāo)儀檢測細(xì)胞內(nèi)ROS 將12孔板置于Synergy Mx多功能熒光酶標(biāo)儀上，設(shè)置參數(shù)直接檢測孔板中H9C2細(xì)胞內(nèi)的熒光強(qiáng)度。冰上，將檢測完的細(xì)胞用RIPA緩沖液裂解細(xì)胞，13 000 r/min離心15 min，收集上清。用BCA法檢測總蛋白含量，熒光值/蛋白質(zhì)量（AFU/μg）使結(jié)果標(biāo)準(zhǔn)化，可作為ROS強(qiáng)度的定量依據(jù)。

1.4 統(tǒng)計學(xué)方法

采用SPSS 22.0軟件進(jìn)行數(shù)據(jù)處理，實驗數(shù)據(jù)采用均數(shù)±標(biāo)準(zhǔn)差（±s）表示，兩組比較采用t檢驗，P<0.05為差異有統(tǒng)計學(xué)意義。

2 結(jié)果

2.1 兩組細(xì)胞熒光強(qiáng)度結(jié)果

用Zeiss倒置熒光顯微鏡觀察對照組和實驗組細(xì)胞的熒光強(qiáng)度，綠色熒光強(qiáng)度直接反映細(xì)胞內(nèi)的ROS水平。同一視野內(nèi)，熒光強(qiáng)度隨著激發(fā)光照射時間的延長而逐漸增強(qiáng)。在軟件參數(shù)完全相同（曝光時間）的情況下，激發(fā)光照射不同時間后熒光強(qiáng)度，結(jié)果見圖1。因此，無法準(zhǔn)確判斷兩組細(xì)胞內(nèi)的真實ROS水平。

圖1 細(xì)胞熒光強(qiáng)度

2.2 流式細(xì)胞儀檢測結(jié)果

用Cytoflex流式細(xì)胞儀檢測兩組細(xì)胞H9C2內(nèi)ROS水平，可見對照組與實驗組曲線位置有明顯區(qū)分，統(tǒng)計平均FITC-A值，得出對照組為（152 690±34 104）FU/μg，實驗組為（325 669±12 755）FU/μg，兩組比較，差異有統(tǒng)計學(xué)意義（P<0.05）。見圖2。

圖2 細(xì)胞內(nèi)ROS水平比較

2.3 多功能酶標(biāo)儀檢測結(jié)果

用Synergy Mx多功能熒光酶標(biāo)儀檢測兩組H9C2細(xì)胞內(nèi)ROS水平，數(shù)據(jù)分析得出實驗組ROS水平[（1 274±37.05）FU/μg]與對照組ROS水平[（282.3±12.57）FU/μg]比較，差異具有統(tǒng)計學(xué)意義（P<0.05），對照組升高。見圖3。

圖3 細(xì)胞內(nèi)ROS水平比較

3 討論

很多疾病在治療時會涉及到手術(shù)治療，如心臟外科手術(shù)，此過程中因暫時失血使機(jī)體處于缺氧狀態(tài)，造成線粒體和非線粒體能量代謝紊亂，加快了氧自由基的產(chǎn)生，且在再灌注時機(jī)體因抗氧化劑不足，進(jìn)一步產(chǎn)生過量的氧自由基。而過量的氧自由基或非特異性氧化損傷DNA、蛋白質(zhì)和脂類，造成體內(nèi)細(xì)胞結(jié)構(gòu)和功能的破壞，導(dǎo)致細(xì)胞消亡；或破壞細(xì)胞之間的粘合作用，從而破壞血管組織，導(dǎo)致血液??；嚴(yán)重者還能造成心肌損傷、收縮失調(diào)（心肌頓抑）、心律不齊以及慢性心血管疾病等，因此缺血性器官損傷是臨床常見的病理生理現(xiàn)象[5-10]。而心臟缺血再灌注（ischemia/reperfusion，I/R）損傷是心臟缺血性疾病和心臟外科手術(shù)后常見的一種病理生理現(xiàn)象，心肌細(xì)胞活性氧的增加是公認(rèn)的I/R損傷的一個重要的病理生理改變標(biāo)志[11]。

體外心肌細(xì)胞H/R模型一直被廣泛應(yīng)用于心臟I/R損傷的研究，對于探討I/R損傷的分子機(jī)制具有重要的意義。而H9C2心肌細(xì)胞來源于大鼠胚胎期的心組織，具有心肌細(xì)胞的許多重要特性和功能，是目前研究心肌細(xì)胞損傷與保護(hù)的常用模型。本實驗應(yīng)用三氣培養(yǎng)箱復(fù)制大鼠心肌細(xì)胞H/R模型，采用熒光顯微鏡觀察、流式細(xì)胞儀檢測、熒光酶標(biāo)儀檢測3種常用檢測方法檢測H9C2細(xì)胞內(nèi)ROS水平，探索更適合大鼠心肌細(xì)胞內(nèi)ROS的檢測方法。

應(yīng)用熒光顯微鏡觀察H9C2細(xì)胞熒光強(qiáng)度，會因某些因素導(dǎo)致無法準(zhǔn)確判斷實驗組與對照組熒光強(qiáng)弱，或是熒光采圖中出現(xiàn)同一視野隨著時間延長熒光強(qiáng)弱出現(xiàn)變化的現(xiàn)象。在采用熒光顯微鏡觀察方法判斷強(qiáng)弱的過程中，需要注意到以下幾點(diǎn)：①摸索合適的染料濃度，選擇較低濃度；②DCFH-DA熒光探針自身具有光敏性，在光照存在下，會發(fā)生被氧化，或是已經(jīng)氧化的產(chǎn)物DCF發(fā)生被還原現(xiàn)象，從而出現(xiàn)熒光增強(qiáng)或衰弱的現(xiàn)象，所以在操作過程中，需要嚴(yán)格的避光操作，或添加抗氧化劑，可避免此種現(xiàn)象[12-15]。

應(yīng)用流式細(xì)胞儀排除光照因素干擾，相較于熒光顯微鏡采圖，流式細(xì)胞儀檢測結(jié)果相對可靠。但是應(yīng)用流式細(xì)胞儀檢測細(xì)胞內(nèi)ROS需注意以下幾個問題：①若處理的細(xì)胞為貼壁細(xì)胞，則需胰酶消化處理，則會導(dǎo)致對照組的熒光強(qiáng)度值相對較高，如本實驗中對照組的流式檢測結(jié)果；②為避免細(xì)胞碎片和死細(xì)胞對實驗結(jié)果的干擾，檢測時需設(shè)法將其區(qū)分，排除此部分信號干擾；③每個樣品測試結(jié)束后，建議用次氯酸鈉沖洗機(jī)器，避免樣本間的相互污染；④樣品應(yīng)在染色后2 h內(nèi)完成上機(jī)檢測操作，避免熒光減弱，影響實驗結(jié)果；⑤設(shè)立陰性對照，可避免細(xì)胞自身熒光對實驗結(jié)果的干擾。

應(yīng)用熒光酶標(biāo)儀檢測細(xì)胞熒光強(qiáng)弱，孵育后直接上機(jī)檢測，避免了其他操作對胞內(nèi)ROS水平的影響，也減少了實驗過程中人為因素的干擾，其準(zhǔn)確性及重復(fù)性更是可靠。在應(yīng)用此方法檢測細(xì)胞內(nèi)ROS需要注意幾個問題：①細(xì)胞培養(yǎng)使用黑色不透明的培養(yǎng)板，避免檢測時孔間干擾；②完成熒光酶標(biāo)儀檢測，進(jìn)行蛋白提取及濃度測定，進(jìn)行熒光值/蛋白質(zhì)量（AFU/μg）標(biāo)準(zhǔn)化。

本實驗應(yīng)用熒光顯微鏡觀察、流式細(xì)胞儀檢測、熒光酶標(biāo)儀檢測H9C2細(xì)胞內(nèi)活性氧水平，流式細(xì)胞儀、熒光酶標(biāo)儀的檢測結(jié)果能夠準(zhǔn)確地反映H9C2細(xì)胞內(nèi)ROS水平。但應(yīng)用熒光酶標(biāo)儀檢測細(xì)胞熒光強(qiáng)弱，相對流式細(xì)胞儀檢測操作更簡便，干擾因素更少，分析結(jié)果相對更準(zhǔn)確。在本實驗結(jié)束后，也利用此方法檢測過其他模型細(xì)胞內(nèi)活性氧的水平，其檢測結(jié)果與相關(guān)文獻(xiàn)一致。

綜上所述，大鼠心肌細(xì)胞H9C2缺氧/復(fù)氧H/R模型中，應(yīng)用熒光酶標(biāo)儀檢測細(xì)胞內(nèi)ROS水平結(jié)果相對更準(zhǔn)確。

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（張蕾 編輯）

Investigation of detection method of ROS in H9C2 cells

Yu Ding,Xue-mei Chen,Si-si Wu
(Core Facility Center of West China Hospital,Sichuan University,Chengdu,Sichuan 610041,China)

Objective To compare three different methods for ROS measurement,and analyze their advantages and shortcomings so as to select a suitable and accurate one for detecting ROS in hypoxia-reoxygenation (H-R)model of rat myocardial cell line H9C2.Methods H9C2 cells were plated in an appropriate confluence(80%-90%).The experimental group(H-R 6 h)was exposed to hypoxia for 6 h followed by reoxygenation for 2 h,the control group(CON)was cultured in normoxic condition.Then DCFH-DA fluorescent probe was added into H9C2 cells.After incubation,the fluorescent intensity was detected by fluorescent microscopy,flow cytometer and fluorescence multiscan.Then these data were analyzed with appropriate analysis software.Results Compared with the control group,the results of flow cytometer[CON(152,690 ± 34,104)FU/μg,H-R 6 h(325,669 ± 12,755)FU/μg]or fluorescence multiscan[CON(282.3 ± 12.57)FU/μg,H-R 6 h(1,274 ± 37.05)FU/μg]showed that the ROS level of the experimental group was significantly higher than that of the control group(P<0.05),but the results from fluorescence microscopy could not distinguish the experimental group from the control group.Conclusions Fluorescence multiscan can better determine the ROS level in H9C2 cells.

hypoxia-reoxygenation;H9C2 cell;ROS

R-332

A

10.3969/j.issn.1005-8982.2017.25.002

1005-8982（2017）25-0008-05

2016-11-16

吳思思，E-mail：sisigia@163.com；Tel：028-85164124