懷地黃塊根中菊花心與非菊花心部位的化學(xué)質(zhì)量特征比較

謝彩俠　張苗　李雅靜　耿曉桐　王豐青　張重義

[摘要]利用HPLC對懷地黃“北京1號”生育期內(nèi)塊根中菊花心、非菊花心及整體塊根三部位中梓醇、毛蕊花糖苷、地黃苷A、地黃苷D、益母草苷進行含量測定，并結(jié)合其HPLC指紋圖譜進行整體化學(xué)質(zhì)量特征比較。結(jié)果表明，生育期內(nèi)懷地黃主要成分含量變化趨勢不同；各成分在菊花心與非菊花心部位富集量差別較大。梓醇、毛蕊花糖苷與地黃苷D在菊花心與非菊花心中的分布相對均勻，非菊花心部位地黃苷A的含量明顯高于菊花心部位，而菊花心部位益母草苷的含量則明顯高于非菊花心部位；地黃菊花心、非菊花心及整體塊根3部位的HPLC指紋圖譜色譜行為基本一致，但是化學(xué)成分含量相差較大；通過聚類分析，懷地黃菊花心部位與非菊花心部位、整體塊根明顯被分為2類。因此，懷地黃菊花心與非菊花心部位化學(xué)質(zhì)量特征存在明顯差異。該研究為懷地黃的質(zhì)量評價和道地性的揭示提供依據(jù)。

[關(guān)鍵詞]菊花心； 化學(xué)成分； 道地性； HPLC指紋圖譜； 主成分分析； 聚類分析

[Abstract]An HPLC method was established to determine the contents of catalpol， acteoside， rehmaionoside A， rehmaionoside D， leonuride in three part of Rehmanni glutinosa in Beijing No1 variety R glutinosa during the growth period， This method， in combination with its HPLC fingerprint was used to evaluate its overall quality characteristicsThe results showed that：① the content of main components of R glutinosa varied in different growth stages ；② there was a great difference of the content of main components between theradial striations and the nonradial striations； ③ the two sections almost have the same content distribution of catalpol， acteoside and rehmaionoside D； ④the content of rehmaionoside A in nonradial striations was higher than that in radial striations，while the content of leonuride in radial striations was higher than that in nonradial striations； ⑤the HPLC fingerprint of radial striations， nonradial striations and whole root tuber were basically identical， except for the big difference in the content of chemical components The result of clustering displayed that the radial striations， nonradial striations， and whole root were divided into two groups In conclusion， there was a significant difference in the quality characteristics of radial striations and nonradial striations of R glutinosa This research provides a reference for quality evaluation and geoherbalism of R glutinosa.

[Key words]radial striations； chemical composition； geoherbalism； HPLC fingerprints； PCA； cluster analysis

地黃為玄參科植物地黃Rehmannia glutinosa Libosch的新鮮或干燥塊根，始載于《神農(nóng)本草經(jīng)》，被列為上品，為著名的“四大懷藥”之一，被廣泛應(yīng)用于臨床，對免疫、造血、心血管及神經(jīng)系統(tǒng)均有顯著療效。

地黃在我國有悠久的藥用歷史，始栽于北魏時期，至今已有1 500多年的歷史[1]。明朝李時珍總結(jié)說：“今人惟以懷慶地黃為上，亦各處隨時興廢不同爾”；另 《本草從新》言：“以懷慶肥大而短，糯體細(xì)皮，菊花心者佳”[23]。清光緒26年（1900年），武陟年產(chǎn)地黃20萬kg，該縣地黃特點是橫切面有“菊花心”，這是歷代藥商鑒定地道貨的標(biāo)志[4]。菊花心作為地黃道地藥材標(biāo)志性特征被大家所熟知，那么菊花心的存在與形成對地黃整體質(zhì)量是否有一定的影響呢？現(xiàn)代研究發(fā)現(xiàn)，道地產(chǎn)區(qū)的懷地黃橫切面有菊花心，同時有效成分梓醇的含量也都高于其他產(chǎn)區(qū)；懷地黃木質(zhì)部所占面積越大，梓醇與毛蕊花糖苷含量越高，多糖的含量則越低；另外也有研究表明懷地黃皮部中梓醇和毛蕊花糖苷的含量比木質(zhì)部的都要高[57]。以上研究僅僅對菊花心與非菊花心部位中的梓醇和毛蕊花糖苷2種有效成分在的含量差異進行分析，且研究結(jié)果不甚一致，也未能對懷地黃菊花心與非菊花心的質(zhì)量特征做出整體評價。基于此，本研究以懷地黃“北京1號”品種為研究對象，分析生育期內(nèi)地黃整體塊根、菊花心及非菊花心中梓醇、毛蕊花糖苷、益母草苷、地黃苷A、地黃苷D等指標(biāo)性成分的動態(tài)變化，并結(jié)合其HPLC指紋圖譜對其進行整體質(zhì)量特征分析，為研究地黃菊花心與其質(zhì)量的相關(guān)性和地黃道地性的揭示提供科學(xué)依據(jù)。endprint

1材料

11儀器

FW100型高速萬能粉碎機；Waters2695型高效液相色譜儀；AL 204型分析天平；CPA225D型1/10萬分析天平；1013AB型電熱鼓風(fēng)干燥箱；KQ500DE型數(shù)控超聲波清洗器；DZKW4電子恒溫水浴鍋。

12試劑與試藥

甲醇、乙腈、磷酸、甲酸均為色譜純；中美純水；自制蒸餾水。毛蕊花糖苷及梓醇對照品均購于成都曼斯特生物科技有限公司，批號分別為MUST13122711，MUST14122411；地黃苷A、地黃苷D、益母草苷對照品均購于四川省維克奇生物科技有限公司，批號分別為81720050，81720083，52949834。

13藥材

試驗在地黃道地產(chǎn)區(qū)河南溫縣武德鎮(zhèn)亢村（35°3′31″N，113°7′17″E）懷藥種植基地進行。種植材料（種栽）分別于2016年4月中下旬種植。選取至少10年未種植過地黃，地勢平坦，土壤為沙壤土，肥力較好的地塊。種栽選取直徑2～4 cm的地黃塊根，掰成長約15～2 cm的小段。起壟種植，壟寬40 cm，壟高15 cm，壟間距30 cm，雙行種植。栽培管理同一般大田。于2016年7月10日、7月30日、8月20日、9月10日、9月30日、10月10日、10月20日、10月30日和11月10日分別取地黃植株的塊根，每次隨機選取10株長勢一致的植株。

2方法與結(jié)果

21樣品信息及處理方法

將新鮮地黃的塊根洗凈，除去泥沙，切成約5 mm的小塊。從9月10號起，分地黃塊根（KG）為菊花心（JHX）與非菊花心（FJHX）2部分；于55 ℃干燥后打粉過3號篩，粉末至干燥器中備用。樣品信息見表1。

22指標(biāo)性成分含量測定

221梓醇、毛蕊花糖苷含量測定

根據(jù)《中國藥典》2015年版相關(guān)項進行[8]。對梓醇、毛蕊花糖苷含量測定進行了方法學(xué)考察，重復(fù)性試驗、精密度試驗、穩(wěn)定性試驗以及加樣回收率試驗，結(jié)果各項考察均符合含量測定要求，梓醇與毛蕊花糖苷對照品及供試品HPLC圖見圖1。

222地黃苷A、地黃苷D及益母草苷含量測定

2221色譜條件Dikma Diamonsil C18色譜柱（46 mm×250 mm，5 μm）；流動相乙腈水（4∶96）；流速1 mL·min-1；檢測波長205 nm；柱溫30 ℃；進樣量20 μL。

2222混合對照品溶液的制備精密稱取適量地黃苷A、地黃苷D、益母草苷對照品置于5 mL量瓶中，用流動相溶解并定容，用022 μm的微孔濾膜過濾，即得混合對照品溶液。

2223供試品溶液的制備取本品粉末05 g，精密稱定，置具塞錐形瓶中，加60%甲醇50 mL，稱重，超聲提取40 min，放冷，再次稱重，用60%甲醇補足失重，過濾，取續(xù)濾液20 mL，50 ℃水浴蒸干，用流動相定容至10 mL量瓶中，022 μm微孔濾膜濾過，即得。

2224線性關(guān)系考察精密吸取2222項對混合照品溶液02，04，08，12，10，12 mL，分別置于5 mL量瓶中，用流動相定容，制得6個不同質(zhì)量濃度的對照品溶液。取上述對照品溶液，按2221項下色譜條件進樣，測定峰面積，以峰面積積分值（Y）為縱坐標(biāo)，對照品質(zhì)量濃度（X）為橫坐標(biāo)繪制標(biāo)準(zhǔn)曲線，計算回歸方程。結(jié)果見表2。

2225精密度考察精密吸取同一供試品溶液按2221項色譜條件連續(xù)進樣6次，記錄峰面積，結(jié)果地黃苷A、地黃苷D、益母草苷的峰面積RSD分別為 13%，11%，098%，表明儀器的精密度良好。

2226穩(wěn)定性考察精密吸取同一供試品溶液按2221項色譜條件于4，8，12，16，20，24 h連續(xù)進樣6次，記錄峰面積，結(jié)果地黃苷A、地黃苷D、益母草苷的峰面積RSD分別為097%，12%，16%，表明供試品溶液在24 h內(nèi)穩(wěn)定。

2227重復(fù)性考察稱同一樣品6份，按2223項分別制得供試品溶液，再按2221項下色譜條件進樣，記錄峰面積，結(jié)果地黃苷A、地黃苷D、益母草苷的含量RSD分別為13%，15%，069%，說明該方法重復(fù)性良好。

2228加樣回收率試驗精密稱定已知含量的樣品9份，每份025 g，分別置于100 mL錐形瓶中，精密加入一定量的地黃苷A、地黃苷D、益母草苷對照品，按2223項方法制備供試品溶液，再按2221項色譜條件進樣，記錄峰面積并計算加樣回收率，結(jié)果地黃苷A、地黃苷D、益母草苷平均加樣回收率分別為1000%，9996%，9961%，RSD分別為16%，29%，24%。

2229樣品的含量測定取各樣品按2223項制備供試品溶液，按2221項色譜條件進樣，對照品及供試品HPLC圖見圖2。

1地黃苷D； 2 地黃苷A； 3 益母草苷； A 對照品色譜圖； B 供試品色譜圖。

圖2地黃苷A、地黃苷D、益母草苷對照品及供試品HPLC圖

Fig2The chromatogram of reference substance and sample for rehmaionoside A，rehmaionoside D and leonuride

223指標(biāo)性成分含量測定結(jié)果及分析

生育期內(nèi)地黃菊花心與非菊花心中成分含量的變化與塊根中趨勢相符，且各成分在地黃菊花心與非菊花心部位分布并不均勻。益母草苷的含量在生育期內(nèi)菊花心部位均明顯高于非菊花心部位，差異達兩倍之多；梓醇、地黃苷D、地黃苷A的含量非菊花心部位明顯高于菊花心部位，但菊花心中地黃苷A的含量從10月下旬開始急劇上升；毛蕊花糖苷含量在菊花心與非菊花心中分布情況波動較大，前期非菊花心部位毛蕊花糖苷含量高于菊花心部位，但地黃采收期前后，菊花心中毛蕊花糖苷含量急劇升高，見表3，圖3～7。endprint

23HPLC指紋圖譜的建立與分析

231供試品溶液的制備

取樣品粉末約08 g，精密稱定，置具塞錐形瓶中，精密加入50 mL甲醇，稱重，靜置過夜，超聲處理30 min，放冷，再稱重，用甲醇補足失重。搖勻，過濾，取20 mL續(xù)濾液置蒸發(fā)皿中65 ℃蒸干，20%甲醇溶解并定容至10 mL量瓶中，022 μm微孔濾膜過濾，即得。

232對照品溶液的制備

分別精密稱取適量梓醇、毛蕊花糖苷、地黃苷A、地黃苷D、益母草苷對照品置5 mL量瓶中，用20%甲醇溶解并定容，即得各對照品溶液。

233色譜條件

Athena C18色譜柱（46 mm×250 mm，5 μm）；檢測波長205 nm；流速10 mL·min-1；柱溫30 ℃；進樣量20 μL；流動相為乙腈（A）001%醋酸水溶液（B）梯度洗脫（0～5 min，3%A；5～20 min，3%～5%A；20～75 min，5%～22%A；75～90 min，22%～28%A）。

234方法學(xué)考察

2341精密度試驗精密吸取同一供試品溶液（S8）20 μL，連續(xù)進樣5次，計算各個共有峰的相對保留時間、相對峰面積以及RSD，結(jié)果顯示相對保留時間 RSD<30%，相對峰面積 RSD<50%，說明該儀器精密度良好。

2342重復(fù)性試驗取同一批（S8）樣品5份，按照232項方法制備供試品溶液，連續(xù)進樣，計算各個共有峰相的對保留時間、相對峰面積以及RSD，結(jié)果顯示，相對保留時間 RSD<30%，相對峰面積 RSD<50%，說明該方法重復(fù)性良好。

2343穩(wěn)定性試驗精密吸取同一供試品溶液（S8）20 μL，分別在 0，4，8，12，24 h進行測定，計算各個共有峰的相對保留時間、相對峰面積以及RSD，結(jié)果顯示，相對保留時間 RSD<30%，相對峰面積 RSD<50%，說明樣品在24 h內(nèi)穩(wěn)定性良好。

235HPLC指紋圖譜的建立

將222項配制的對照品溶液按233項色譜條件分別進樣，確定對照品的位置；將21批樣品供試品溶液按233項色譜條件分別進樣，記錄色譜圖，各對照品以及樣品的指紋圖譜疊加圖見圖8。

236對照圖譜的生成

采用國家藥典委員會頒布的《中藥色譜指紋圖譜相似度評價系統(tǒng)》（2004 A版） 對21批樣品

A對照品色譜圖； B 樣品色譜疊加圖； a 梓醇； b 地黃苷D； c 地黃苷A； d 益母草苷； e毛蕊花糖苷。

圖8對照品色譜圖及21批樣品疊加色譜

Fig8The chromatogram of reference substance and superposition chromatogram for 21 batches of samples

HPLC圖進行圖譜擬合，設(shè)定時間窗寬度為03，選擇S1為參照圖譜，采用中位數(shù)法生成對照圖譜，共標(biāo)定20個共有峰，見圖9。

237地黃樣品的主成分分析

以21批樣品的20個共有峰峰面積及保留時間為信息量，采用SPSS 190統(tǒng)計軟件對其進行主成分分析，得到主成分的特征值和方差貢獻率見表4，碎石圖見圖10，以特征值1為提取標(biāo)準(zhǔn)，得到前5個成分方差貢獻率綜合達到83363%，它們代表了這21批樣品指紋圖譜中大部分信息內(nèi)容，同時結(jié)合碎石圖可見主成分分析中特征值的變化情況，說明前5個主成分的分析結(jié)果基本顯示出了不同批次樣品之間的相似度和差異性。第1主成分主要反映了色譜峰12、11、13、益母草苷、16、10的信息，第2主

成分主要反映了色譜峰毛蕊花糖苷、10、18、梓醇的信息，第3主成分主要反映了色譜峰19，2，4的信息，第4主成分主要反映了色譜峰1、地黃苷A的信息，第5主成分主要反映了地黃苷D的信息，見表5。

238地黃樣品的聚類分析

以21批地黃樣品5個主成分所表達色譜峰峰面積及保留時間為原始數(shù)據(jù)，SPSS 190軟件對樣

品進行系統(tǒng)聚類分析，以歐式距離平方和作為樣本的測度，相似性矩陣為統(tǒng)計量方法，最近鄰元素、平方Euclidean及Z得分為分類標(biāo)準(zhǔn)，聚類結(jié)果見圖11。

由圖11知，當(dāng)歐氏距離平方和為10時，樣品被分為5類，其中樣品s1和s2被單獨分為2類，樣品s3和s16被分為一類，樣品s17～s21被歸為一類，樣品s4～s15被歸為一類。s1，s2，s3樣品為7月份到8月初的地黃塊根樣品，這一時期地黃的生長中心在地上部分，但地下部分塊根處于膨大初期到快

速膨大期的過渡時期，氣溫的不斷升高，使地黃塊根各種代謝活動開始慢慢啟動，所產(chǎn)生的次生代謝產(chǎn)物也隨著生育期的進程而不斷的發(fā)生變化，致使3個時期的地黃塊根樣品差別較大而被明顯區(qū)分開來；樣品s16為910地黃菊花心樣品，此時期地黃塊根進入明顯膨大期，但菊花心處于膨大初期，所占比例較小，次生代謝活動并不活躍。從聚類分析結(jié)果可以看出，地黃菊花心部位與整體塊根、非菊花心部位被分為了兩大類，這與前期指標(biāo)性成分在不同部位分布及富集結(jié)果有一定的契合度與相關(guān)性。

3討論

懷地黃為我國大宗藥材的道地品種，其個大、質(zhì)量優(yōu)，大多數(shù)中醫(yī)藥著作都把懷慶地黃作專條列出，《中藥大辭典》更將懷地黃作為地黃的變種予以強調(diào)[9]。文獻記載將“菊花心的存在與否”做為判斷地黃質(zhì)量優(yōu)劣及道地性的一個形態(tài)特征。為了進一步分析其內(nèi)在特征，本研究對地黃“北京1號”品種菊花心、非菊花心及塊根部位中毛蕊花糖苷、梓醇、地黃苷A、地黃苷D及益母草苷的含量進行分析，發(fā)現(xiàn)不同成分在菊花心與非菊花心部位富集量有差異并具有一定的規(guī)律性，同時通過聚類分析，懷地黃塊根中菊花心部位與非菊花心部位、整體塊根被分為兩類，以上都說明了懷地黃菊花心與非菊花心部位化學(xué)質(zhì)量特征存在明顯差異。菊花心為地黃塊根的木質(zhì)部，非菊花心則為其周皮與次生韌皮部，木質(zhì)部主要負(fù)責(zé)輸送水分，韌皮部主要負(fù)責(zé)輸送養(yǎng)分（有機物）等，因此，正常情況下非菊花心中次生代謝產(chǎn)物的量一般要高于菊花心，但實驗結(jié)果表明，梓醇、毛蕊花糖苷與地黃苷D在菊花心與非菊花心部位的分布相對均勻，地黃苷A的含量非菊花心部位明顯高于菊花心部位，而益母草苷的含量則菊花心部位明顯高于非菊花心部位，這一發(fā)現(xiàn)不僅可以為地黃有效成分組織化學(xué)的定位提供參考，而且也提出了新的問題，地黃次生代謝產(chǎn)物在塊根不同組織的富集與地黃塊根的發(fā)育及質(zhì)量特征的形成有何聯(lián)系？地黃中各有效成分在不同品種地黃菊花心與非菊花心部位的含量高低及相對比例是否具有相同的規(guī)律？菊花心的特征和質(zhì)量與地黃的道地性之間存在什么樣的關(guān)系？這些問題都有待于后期進一步研究。endprint

地黃的主要成分有多種苷類、多糖類、氨基酸及少量的β谷甾醇等，以苷類為主，在苷類中又以環(huán)烯醚萜苷為主，其中主要是梓醇、地黃苷A、地黃苷D、益母草苷、桃葉珊瑚苷等。環(huán)烯醚萜苷類是地黃發(fā)揮藥理作用的主要物質(zhì)基礎(chǔ)，具有廣泛的生物活性。文獻研究表明地黃苷A，D等環(huán)烯醚萜苷類，具有較好的免疫活性，對骨髓造血及外周血細(xì)胞細(xì)胞增殖具有促進作用，增強免疫功能等藥理作用，且熱穩(wěn)定性強，在炮制加工過程中幾乎不被分解[1011] 。地黃中梓醇含量最高，益母草苷、地黃苷A、地黃苷D是僅次于梓醇含量的環(huán)烯醚萜苷類成分，王慧森等[12]曾在大鼠含藥血清中發(fā)現(xiàn)梓醇、地黃苷D與益母草苷均以原型入血。但2015年版《中國藥典》中僅將“梓醇”這一種環(huán)烯醚萜苷類成分作為評價地黃質(zhì)量是否合格的指標(biāo)之一，地黃中其他環(huán)烯醚萜苷類成分對地黃的臨床療效有沒有影響？僅僅用梓醇這一指標(biāo)是否可以完全反映地黃質(zhì)量的優(yōu)劣呢？本實驗發(fā)現(xiàn)益母草苷含量在菊花心部位富集量遠(yuǎn)高于非菊花心部位，益母草苷含量的高低與地黃的質(zhì)量是否有一定的相關(guān)性？前人將菊花心的存在與否作為判斷道地地黃的特征是否與菊花心中益母草苷的含量高有一定的關(guān)系呢？

中藥藥效是在多種有效成分相互協(xié)同作用下產(chǎn)生的，有效成分的種類、含量及相對比例都會影響其藥效的發(fā)揮。單純的指標(biāo)性成分含量分析并不能反映中藥的質(zhì)量整體特征，而HPLC指紋圖譜能夠清晰地反映出樣品中所含化學(xué)成分的種類和相對含量的高低，可以較為全面的表征樣品整體的化學(xué)質(zhì)量特征，目前已廣泛應(yīng)用于中藥的整體化學(xué)質(zhì)量控制。本研究建立了菊花心、非菊花心、整體塊根的HPLC指紋圖譜，并采用主成分分析和聚類分析對其進行了分析，結(jié)果發(fā)現(xiàn)，地黃中的梓醇、益母草苷、地黃苷A、地黃苷D 4種環(huán)烯醚萜苷類成分和毛蕊花糖苷均作為主成分參與了地黃的質(zhì)量分析，說明他們與地黃的質(zhì)量具有一定的相關(guān)性。另外，還有其他未知的成分同樣作為主成分來表征了地黃的整體化學(xué)質(zhì)量信息，而且，聚類分析結(jié)果表明菊花心部位的化學(xué)質(zhì)量特征不同于非菊花心和塊根，那么這種差異的存在來源于哪些化學(xué)成分，這些化學(xué)成分與地黃的質(zhì)量之間存在什么樣的關(guān)系？后期可利用液相色譜質(zhì)譜聯(lián)用技術(shù)對這些未知成分進行鑒定，同時結(jié)合相關(guān)藥理藥效實驗進行譜效關(guān)系研究，確定其質(zhì)量控制的關(guān)鍵成分，進一步探索懷地黃菊花心部位存在的重要性與意義所在，完善地黃的質(zhì)量控制標(biāo)準(zhǔn)，為懷地黃質(zhì)量評價、種質(zhì)資源開發(fā)以及道地性的揭示提供科學(xué)參考。

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[責(zé)任編輯丁廣治]endprint