基于斑馬魚(yú)MAct/Tox一體化評(píng)價(jià)的抗骨質(zhì)疏松中藥高效篩選思路與方法

王茉　陳穎　宋捷　孫娥　石子琪 封亮　賈曉斌　韋英杰

[摘要]日益顯現(xiàn)的壯骨中藥肝損傷問(wèn)題為臨床應(yīng)用帶來(lái)挑戰(zhàn)，抗骨質(zhì)疏松中藥篩選有必要兼顧有效性與安全性，而代謝轉(zhuǎn)化至關(guān)效應(yīng)與毒性，故全面考慮代謝效/毒一體的篩選具有意義。評(píng)價(jià)模型和化合物（含代謝物）數(shù)量嚴(yán)重制約早期在體、高效篩選。參考課題組前期相關(guān)研究及國(guó)內(nèi)外文獻(xiàn)，提出斑馬魚(yú)代謝模型、骨質(zhì)疏松模型及毒性評(píng)價(jià)法有機(jī)整合可建立MAct/Tox（metabolismaction/toxicity）一體化的抗骨質(zhì)疏松中藥高效篩選法。突破量微成分無(wú)法在體、高效及一體化評(píng)價(jià)的難點(diǎn)和盲點(diǎn)，實(shí)現(xiàn)基于體內(nèi)過(guò)程且兼顧有效性與安全性的全方位抗骨質(zhì)疏松中藥高效篩選，對(duì)加速發(fā)現(xiàn)安全有效的抗骨質(zhì)疏松創(chuàng)新中藥具有意義。

[關(guān)鍵詞]斑馬魚(yú)； 骨質(zhì)疏松； 藥物代謝； 有效性； 安全性； 活性篩選

[Abstract]The increasingly apparent liver injury problems of bone strengthening Chinese medicines have brought challenges for clinical application， and it is necessary to consider both effectiveness and safety in screening antiosteoporosis Chinese medicines Metabolic transformation is closely related to drug efficacy and toxicity， so it is significant to comprehensively consider metabolismaction/toxicity（MAct/Tox） for screening antiosteoporosis Chinese medicines The current evaluation models and the number of compounds（including metabolites） severely restrict efficient screening in vivo By referring to previous relevant research and domestic and abroad literature， zebrafish MAct/Tox integrative method was put forward for efficiently screening antiosteoporosis herb medicines， which has organically integrated zebrafish metabolism model， osteoporosis model and toxicity evaluation method This method can break through the bottleneck and blind spots that trace compositions can′t achieve efficient and integrated in vivo evaluation， and realize both efficient and comprehensive screening on antiosteoporosis traditional medicines based on in vivo process taking both safety and effectiveness into account， which is significant to accelerate discovery of effective and safe innovative traditional Chinese medicines for osteoporosis.

[Key words]zebrafish； osteoporosis； metabolism； effectiveness； safety； activity screening

中藥治療骨質(zhì)疏松癥受到青睞，但其肝毒性也已引起重視，有些療效確切、臨床用藥廣、關(guān)注度高的知名中藥如壯骨關(guān)節(jié)丸、仙靈骨葆膠囊（《2012版中國(guó)國(guó)家基本藥物目錄》在列唯一補(bǔ)腎壯骨中成藥）等有肝臟不良反應(yīng)，且均已在《藥品不良反應(yīng)信息通報(bào)》公開(kāi)，這對(duì)臨床安全、合理用藥帶來(lái)極大挑戰(zhàn)[13]。故抗骨質(zhì)疏松中藥篩選有必要既重視有效性，又重視安全性。中藥的效應(yīng)（action，Act）/毒性（toxicity，Tox）產(chǎn)生與其在體內(nèi)的代謝轉(zhuǎn)化（metabolism，M）密切相關(guān)，全面考慮MAct/Tox的篩選具有意義。

嘗試建立基于體內(nèi)過(guò)程的中藥效/毒物質(zhì)基礎(chǔ)研究的新思路、新方法不斷涌現(xiàn)[48]，但中藥成分復(fù)雜，所含的與分離到的成分多量微，現(xiàn)有體內(nèi)、外模型無(wú)法進(jìn)行量微成分MAct/Tox一體化的在體、高效篩選：體外實(shí)驗(yàn)不能體現(xiàn)在體轉(zhuǎn)化的綜合效果；體內(nèi)實(shí)驗(yàn)周期較長(zhǎng)、化合物用量大，不適于高效篩選。中藥成分復(fù)雜，大量成分含量低微，現(xiàn)有體內(nèi)、外模型難以進(jìn)行中藥成分特別是量微成分的在體代謝轉(zhuǎn)化、效應(yīng)與毒性高效篩選，已成為制約中藥毒/效物質(zhì)高效篩選的難點(diǎn)、瓶頸。

本文提出采用模式生物斑馬魚(yú)可突破上述技術(shù)瓶頸，建立關(guān)注體內(nèi)、外成分，兼顧有效性與安全性的抗骨質(zhì)疏松篩選新方法，實(shí)現(xiàn)條件簡(jiǎn)單，高效率，低成本，高靈敏，能高效進(jìn)行微量樣品的在體MAct/Tox一體化評(píng)價(jià)，具重要意義。

1現(xiàn)有抗骨質(zhì)疏松中藥MAct/Tox篩選體內(nèi)、外模型不能進(jìn)行量微成分在體、高效評(píng)價(jià)

11體內(nèi)模型常見(jiàn)在體抗骨質(zhì)疏松藥效模型：切除大鼠卵巢（睪丸）、用糖皮質(zhì)激素或維甲酸造成大鼠骨質(zhì)疏松模型，耗時(shí)長(zhǎng)[910]；在體毒性模型有急毒小鼠或大鼠半月；亞急毒大鼠28 d；長(zhǎng)毒大鼠3～6月或狗9月[11]；在體代謝常用大鼠，有時(shí)用狗[12]。endprint

體內(nèi)模型共有局限性：①耗時(shí)長(zhǎng)、繁瑣、效率低；②靈敏度低、用藥量大，成本高，量微成分難以進(jìn)行評(píng)價(jià)；③單一模型難以同時(shí)兼顧藥效、毒性與代謝評(píng)價(jià)；④一般不適于早期高效篩選。

12體外模型常見(jiàn)體外抗骨質(zhì)疏松藥效模型：采用體外培養(yǎng)原代成骨細(xì)胞和破骨細(xì)胞或其共培養(yǎng)技術(shù)，以及大鼠骨肉瘤UMR106細(xì)胞模型，要求高，難度較大[13]；體外毒性評(píng)價(jià)：常采用肝、腎等細(xì)胞毒模型；體外代謝：常采用肝細(xì)胞、肝微粒體、代謝酶或腸菌等手段。

體外模型共有局限性：①作用環(huán)節(jié)相對(duì)單一，不能體現(xiàn)在體試驗(yàn)的綜合效果；②保持細(xì)胞生物活性的條件相對(duì)苛刻，普通實(shí)驗(yàn)室難以進(jìn)行；③需多種體外實(shí)驗(yàn)方法聯(lián)合，才可進(jìn)行體外代謝、效/毒的全面篩選。

綜上，現(xiàn)有體內(nèi)、外模型雖然系統(tǒng)性、可靠性強(qiáng)或長(zhǎng)于機(jī)制探討，但無(wú)法實(shí)現(xiàn)量微成分代謝轉(zhuǎn)化與效/毒一體化的在體、高效篩選，已成為抗骨質(zhì)疏松中藥效/毒篩選的技術(shù)瓶頸。

2模式生物斑馬魚(yú)有望突破量微成分MAct/Tox一體化評(píng)價(jià)的技術(shù)瓶頸

模式生物斑馬魚(yú)（zebrafish）是近年來(lái)進(jìn)行藥物在體高通量篩選、毒理研究等的理想、熱門(mén)模型。斑馬魚(yú)發(fā)育速度快，在1周內(nèi)形成主要的臟器及代謝酶系，斑馬魚(yú)與人類(lèi)的基因相似度達(dá)到87%，這意味著在斑馬魚(yú)身上實(shí)驗(yàn)的結(jié)果，在大多數(shù)情況下也適用于人體[1415]。與哺乳動(dòng)物類(lèi)似，藥物經(jīng)魚(yú)作用后發(fā)生代謝轉(zhuǎn)化，產(chǎn)生藥效或毒性，是個(gè)整體過(guò)程，此外幼魚(yú)體小，實(shí)驗(yàn)可在微板中高效進(jìn)行，故采用斑馬魚(yú)有望建立MAct/Tox一體化評(píng)價(jià)模型，實(shí)現(xiàn)量微成分在體抗骨質(zhì)疏松的效/毒高效篩選的目標(biāo)。

21斑馬魚(yú)用于抗骨質(zhì)疏松活性評(píng)價(jià)的依據(jù)與基礎(chǔ)斑馬魚(yú)與哺乳動(dòng)物骨骼生長(zhǎng)發(fā)育的分子機(jī)制極為相似，幼魚(yú)骨包含骨形成和骨吸收活動(dòng)所需的細(xì)胞，是較完整體系。早在2005年，F(xiàn)leming等首次用斑馬魚(yú)骨骼染色得出結(jié)論：維他命D3類(lèi)似物和甲狀旁腺素劑量與骨礦化面積成正相關(guān)性[16]，2006年，他們用腎上腺皮質(zhì)激素氫化潑尼松（prednisolone）誘導(dǎo)并成功建立斑馬魚(yú)骨質(zhì)疏松疾病模型[17]。

此后，斑馬魚(yú)作為高效、快速、高通量篩選促進(jìn)骨骼生長(zhǎng)、治療骨科疾病藥物的在體模型受到研究人員關(guān)注。Soon Nam Kim等用此在體模型驗(yàn)證了甘草查爾酮A刺激骨形成、抑制骨重吸收并推測(cè)可能用于治療骨疾病[18]，SeongHee Moon等[19]用此在體模型驗(yàn)證了三白草抗破骨細(xì)胞和促骨形成活性，Yu Jiang等[20]用此在體模型驗(yàn)證了鐵調(diào)素抑制斑馬魚(yú)骨形成。

在國(guó)內(nèi)，課題組2013年首先建立了地塞米松和潑尼松龍（prednisolone，PN）誘導(dǎo)的斑馬魚(yú)骨骼異常模型[2124]，之后斑馬魚(yú)骨骼模型引起國(guó)內(nèi)越來(lái)越多課題組重視并進(jìn)行相關(guān)研究，如闡述去鐵胺和鐵調(diào)素對(duì)高鐵環(huán)境下斑馬魚(yú)骨形成指標(biāo)影響的實(shí)驗(yàn)研究[25]，用斑馬魚(yú)骨質(zhì)疏松模型評(píng)價(jià)一組2乙酰苯并五元雜環(huán)類(lèi)化合物的抗骨質(zhì)疏松活性[26]，以及評(píng)價(jià)淫羊藿苷和朝藿定C單體混合物的活性等[27]。

22斑馬魚(yú)用于藥物代謝的依據(jù)與基礎(chǔ)[2830]斑馬魚(yú)具有較完善的代謝酶系，最大限度地保留哺乳動(dòng)物代謝的系統(tǒng)性。前期課題組創(chuàng)建了斑馬魚(yú)中藥代謝新方法，突破量微成分在體代謝的技術(shù)瓶頸，也為代謝產(chǎn)物的富增提供新選擇：創(chuàng)新性的提出將斑馬魚(yú)置于含藥液的小容器或微板中，魚(yú)會(huì)通過(guò)皮膚和腔道自主連續(xù)的從溶液中吸收藥物，藥物代謝物也會(huì)隨著斑馬魚(yú)的排泄物被連續(xù)的排到水中，用LCMS分析魚(yú)體外藥液和魚(yú)體內(nèi)代謝產(chǎn)物，可全面掌握代謝信息，方法簡(jiǎn)易普適、化合物用量少（μg至數(shù)mg），低成本、批量規(guī)?；?。研究表明，斑馬魚(yú)即能用于藥物Ⅰ相、Ⅱ相代謝及腸菌代謝研究，又能體現(xiàn)多種代謝途徑的整體綜合結(jié)果。目前，斑馬魚(yú)代謝方法已成為一種被認(rèn)可的、較成熟的在體代謝模型用于量微成分代謝研究。

23斑馬魚(yú)用于毒性評(píng)價(jià)現(xiàn)狀[3135]斑馬魚(yú)在藥學(xué)領(lǐng)域的最早、最為廣泛的應(yīng)用是毒性篩選。魚(yú)胚胎透明，低成本，細(xì)胞信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)具保守性，存在很多與人類(lèi)相同的生物學(xué)通路，及與哺乳動(dòng)物的發(fā)育表型一致性，斑馬魚(yú)胚胎已成為一種在體毒性篩選的新工具。歐洲已認(rèn)可斑馬魚(yú)的藥物毒性測(cè)試，F(xiàn)DA官員在2013年也倡議重視將斑馬魚(yú)用于藥品的毒性測(cè)試，我國(guó)近年來(lái)的相關(guān)研究也日益增多。

綜上，斑馬魚(yú)用于毒性篩選已被國(guó)內(nèi)外認(rèn)可并應(yīng)用，課題組主持完成國(guó)家自然科學(xué)基金項(xiàng)目和江蘇省自然科學(xué)基金項(xiàng)目分別建立了“斑馬魚(yú)中藥代謝新方法”和“斑馬魚(yú)中藥壯骨效應(yīng)評(píng)價(jià)新模型”，突破量微成分在體代謝和抗骨質(zhì)疏松活性高效評(píng)價(jià)的技術(shù)難點(diǎn)與瓶頸。在用斑馬幼魚(yú)進(jìn)行中藥抗骨質(zhì)疏松篩選研究中，發(fā)現(xiàn)藥物經(jīng)魚(yú)代謝轉(zhuǎn)化，產(chǎn)生抗骨質(zhì)疏松活性，有時(shí)伴有毒性產(chǎn)生（如100 mg·L-1壯骨關(guān)節(jié)丸給藥3 d后致骨質(zhì)疏松模型魚(yú)100%死亡），故可推測(cè)給藥后，檢測(cè)抗骨質(zhì)疏松活性，另同步檢測(cè)代謝物及毒性，即可實(shí)現(xiàn)抗骨質(zhì)疏松中藥篩選的斑馬魚(yú)MAct/Tox一體化評(píng)價(jià)。斑馬魚(yú)MAct/Tox模型與現(xiàn)有體內(nèi)、外模型比較的優(yōu)勢(shì)見(jiàn)圖1。

3斑馬魚(yú)MAct/Tox一體化的抗骨質(zhì)疏松評(píng)價(jià)建立的思路與方法

斑馬魚(yú)MAct/Tox一體化評(píng)價(jià)思路與方法見(jiàn)圖2，本法旨在用斑馬魚(yú)進(jìn)行抗骨質(zhì)疏松活性篩選過(guò)程中，進(jìn)行代謝物的檢測(cè)與毒性觀察。取斑馬幼魚(yú)置微板中，分別用05%DMSO和糖皮質(zhì)激素處理，將魚(yú)分成健康陰性魚(yú)和骨質(zhì)疏松模型魚(yú)2類(lèi)。2類(lèi)魚(yú)分別給予測(cè)試藥（淫羊藿苷為代表），同時(shí)設(shè)留DMSO陰性及骨質(zhì)疏松模型組。給藥后，每天觀察魚(yú)毒性：計(jì)數(shù)魚(yú)死亡數(shù)量（計(jì)算半數(shù)致死濃度LC50），光學(xué)顯微鏡檢視主要臟器毒性；一定時(shí)間后，取一部分魚(yú)用于骨礦化檢測(cè)；另取一部分魚(yú)用于代謝物的LCMS分析，對(duì)于檢測(cè)到的代謝物可富集分離，再次進(jìn)行效/毒評(píng)價(jià)。實(shí)驗(yàn)僅需1 mg至數(shù)mg化合物，所需藥物濃度范圍寬，一般6～10個(gè)劑量，故所需魚(yú)數(shù)量較多（約幾百條），這用斑馬幼魚(yú)在微板上實(shí)驗(yàn)易做到（24孔板，6～10條/孔）：一對(duì)成魚(yú)每次可產(chǎn)卵200～300個(gè)，單次接魚(yú)卵達(dá)1 000～2 000以上，易滿足需要。endprint

近年來(lái)，應(yīng)用范圍廣、社會(huì)關(guān)注度高的淫羊藿肝毒性（風(fēng)險(xiǎn)）已引起重視，現(xiàn)代研究表明淫羊藿黃酮類(lèi)成分為抗骨質(zhì)疏松主要活性成分，其安全與否意義重大，淫羊藿苷（icariin）是廣受關(guān)注的主要代表黃酮成分之一。用上述思路與方法進(jìn)行了微量（<2 mg）淫羊藿苷抗骨質(zhì)疏松MAct/Tox一體化評(píng)價(jià)：采用PN誘導(dǎo)的斑馬魚(yú)骨質(zhì)疏松模型評(píng)價(jià)了淫羊藿苷的抗骨質(zhì)疏松活性，發(fā)現(xiàn)淫羊藿苷濃度為5，10 μmol·L-1時(shí)，斑馬魚(yú)頭骨染色面積之和與累積光密度IOD和模型組比有極顯著性差異（P<001），提示5，10 μmol·L-1淫羊藿苷可對(duì)抗PN誘導(dǎo)的斑馬魚(yú)骨質(zhì)疏松[36]。在抗骨質(zhì)疏松評(píng)價(jià)給藥過(guò)程中，觀察淫羊藿苷對(duì)魚(yú)的安全性，發(fā)現(xiàn)給藥期間最大濃度200 μmol·L-1未致健康魚(yú)和PN模型魚(yú)死亡，也未見(jiàn)魚(yú)臟器變形，提示淫羊藿苷安全性較好。另每天取藥液分析（3～8 d），發(fā)現(xiàn)淫羊藿苷在斑馬魚(yú)作用下代謝轉(zhuǎn)化，見(jiàn)圖3，于給藥2 d后（5 dpf）基本代謝完全，轉(zhuǎn)化為主要代謝物寶藿苷I（baohuoside I），說(shuō)明用斑馬魚(yú)進(jìn)行抗骨質(zhì)疏松活性和安全性評(píng)價(jià)是基于體內(nèi)轉(zhuǎn)化的。

4討論與展望

抗骨質(zhì)疏松中藥早期篩選需面向3個(gè)問(wèn)題：是否有效，何物質(zhì)有效（原形成分或代謝產(chǎn)物），及全安性如何？理想的篩選方法需進(jìn)行基于體內(nèi)轉(zhuǎn)化的效應(yīng)/毒性的高效篩選，但現(xiàn)有體內(nèi)、外模型無(wú)法高效進(jìn)行量微成分的在體代謝、抗骨質(zhì)疏松活性評(píng)價(jià)及毒性評(píng)價(jià)，是難點(diǎn)與瓶頸問(wèn)題。

課題組前期建立了斑馬魚(yú)骨質(zhì)疏松模型和斑馬魚(yú)代謝新方法，發(fā)現(xiàn)在抗骨質(zhì)疏松中藥篩選過(guò)程中藥物會(huì)代謝轉(zhuǎn)化，也能觀察到毒性產(chǎn)生，故提出斑馬魚(yú)骨質(zhì)疏松模型、斑馬魚(yú)代謝新方法及斑馬魚(yú)毒性評(píng)價(jià)有機(jī)整合，形成斑馬魚(yú)代謝效應(yīng)/毒性（MAct/Tox）一體化評(píng)價(jià)新方法，可實(shí)現(xiàn)關(guān)注體內(nèi)、外成分且兼顧有效性與安全性的高效、系統(tǒng)篩選。實(shí)驗(yàn)可在微板中進(jìn)行，化合物用量少（μg～mg），周期短，為抗骨質(zhì)疏松中藥篩選提供新思路與方法，對(duì)發(fā)現(xiàn)安全、有效的抗骨質(zhì)疏松創(chuàng)新中藥具有意義。

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[責(zé)任編輯張寧寧]endprint