鹽負(fù)荷和醛固酮誘導(dǎo)乳鼠原代心肌細(xì)胞肥大的實驗研究

由淑萍　蔣紅　何麗娟

[摘要] 目的 探討鹽負(fù)荷和醛固酮對乳鼠原代心肌細(xì)胞肥大的協(xié)同作用。 方法 原代培養(yǎng)乳鼠心肌細(xì)胞，隨機分為正常對照組、醛固酮10～7 mol/L（Ald）組、等鈉濃度140 mmol/L（NS）組、高鈉濃度146 mmol/L（HS）組、等鈉濃度140 mmol/L+Ald 10～7 mol/L（NS+Ald）組、高鈉濃度146 mmol/L+Ald 10～7 mol/L（HS+Ald）組；其中NS+Ald與HS+Ald組先不加Ald，培養(yǎng)48 h后，加入Ald，所有處理組繼續(xù)培養(yǎng)24 h。免疫熒光法測定心肌細(xì)胞橫截面積差異，細(xì)胞活性實驗（CCK-8）檢測其活性，流式細(xì)胞儀檢測細(xì)胞凋亡率，熒光定量PCR檢測內(nèi)皮素-1（ET-1）、一氧化氮合酶（eNOS）mRNA表達(dá)的差異。 結(jié)果 NS+Ald組及HS+Ald組心肌細(xì)胞橫截面積較Ald組、NS組、 HS組明顯增加（P < 0.01）；與正常對照組比較，NS+Ald組及HS+Ald組心肌細(xì)胞存活率明顯下降（P < 0.01）、凋亡率顯著上升（P < 0.01）；除NS組外，余組ET-1 mRNA表達(dá)升高，eNOS mRNA表達(dá)下降，以HS+Ald組最為顯著（P < 0.01）。 結(jié)論 鹽負(fù)荷和醛固酮是誘導(dǎo)心肌細(xì)胞肥大的重要參與因子，具有協(xié)同作用；其中以高鹽狀態(tài)下，醛固酮誘導(dǎo)的心肌細(xì)胞肥大最為顯著。

[關(guān)鍵詞] 鹽負(fù)荷；醛固酮；心肌細(xì)胞；基因表達(dá)；凋亡

[中圖分類號] R332 [文獻(xiàn)標(biāo)識碼] A [文章編號] 1673-7210（2017）10（a）-0013-04

[Abstract] Objective To investigate the synergistic effects of salt loading and aldosterone on hypertrophy of primary cardiomyocytes in neonatal rats. Methods Neonatal rat cardiomyocytes were culturedin the experiment， the cell was divided into normal control group， Aldosterone 10-7 mol/L （Ald） group， normal sodium concentration 140 mmol/L （NS） group， high sodium concentration 146 mmol/L （HS） group， 140 mmol/L+Ald 10-7 mol/L （NS+Ald） group， 146 mmol/L+Ald 10-7mol/L （HS+Ald） group. At first Ald was not added into （NS+Ald） group and （HS+Ald） group， after 48 h culture， Ald was added， then all treatment groups were continued to culture for 24 h. The difference of myocardial cross-sectional area was measured by immunofluorescence. The survival rate was detected by CCK-8. The apoptosis rate was detected by flow cytometry. ET-1 and eNOS mRNA expressions were assayed by qRT-PCR. Results The cross-sectional area of myocardial cells in NS+Ald group and HS+Ald group were significantly higher than Ald group， NS group， HS group. Compared with normal control group， the survival rate of cardiomyocytes decreased significantly （P < 0.01） and apoptosis rate increased significantly （P < 0.01） in NS+Ald group and HS+Ald group； except for NS group， ET-1 mRNA expression increased and eNOS mRNA expression decreased in other groups， the effect of HS+Ald group was the most significant （P < 0.01）. Conclusion Salt loading and aldosterone are important participation factors which induced cardiomyocyte hypertrophy， they have synergistic effects. Among them， aldosterone-induced cardiomyocyte hypertrophy is the most significant in high salt condition.

[Key words] Salt load； Aldosterone； Myocardial cell； Gene expression； Apoptosis

高鹽飲食（攝鹽量≥6.25 g/d）是新疆哈薩克族牧民高血壓患病率的重要危險因素[1-2]。動物實驗結(jié)果顯示，鹽負(fù)荷是導(dǎo)致心血管疾病和靶器官損傷的重要原因[3-4]；同時，醛固酮（Ald）也可引起心室重構(gòu)及血壓的變化，食鹽在其間發(fā)揮的作用不容忽視[5]，故預(yù)防和逆轉(zhuǎn)心臟結(jié)構(gòu)功能受損是高血壓防治的重要途徑。但鹽負(fù)荷和醛固酮如何導(dǎo)致心肌細(xì)胞的生物學(xué)改變、對心肌細(xì)胞肥大是否具有協(xié)同作用，是否加速心肌細(xì)胞損傷仍是研究的熱點?；诖?，本研究從體外實驗探討食鹽和醛固酮作用于心肌細(xì)胞后，其橫截面積、活力、凋亡率及參與血管微循環(huán)基因的表達(dá)差異，為深入研究食鹽和醛固酮對心肌細(xì)胞的生物學(xué)改變提供實驗依據(jù)。endprint

1 材料與方法

1.1 實驗動物

SD新生乳鼠，日齡1～3 d，SPF級，體重6～8 g [動物生產(chǎn)許可證號：SCXK（新）2011-0004]，于新疆醫(yī)科大學(xué)實驗動物中心飼養(yǎng)，實驗通過新疆醫(yī)科大學(xué)第一臨床附屬醫(yī)院倫理委員會審核（倫審號：20140304-150）；實驗動物SPF環(huán)境使用許可證號：SYXK（新）2011-0004，動物合格證號：No.65000700000650。

1.2 材料與試劑

氯化鈉（分析純）：天津科密歐公司配置：①1 mol NaCl = 58.5 g；②將81.9 mg的NaCl溶于100 mL雙蒸水，高溫消毒滅菌；③取10 μL上述鹽溶液加入90 μL培養(yǎng)液中即得到終濃度為140 mmol/L（正常范圍）的NaCl溶液，同法配置146 mmol/L（生理環(huán)境下高鈉濃度）溶液；DMEM培養(yǎng)基（高糖）：Hyclone公司；醛固酮、0.4%臺盼藍(lán)：Sigma公司；胎牛血清：美國Gibco公司；抗心肌肌鈣蛋白T抗體：Abcam公司；Annexin V-FITC細(xì)胞凋亡檢測試劑盒：BD公司；Cell Counting Kit-8（CCK-8）：日本同仁公司。

1.3 心肌細(xì)胞的培養(yǎng)及鑒定

采用陶靜等[6]的方法培養(yǎng)乳鼠心肌細(xì)胞并進(jìn)行鑒定，鑒定采用抗心肌肌鈣蛋白T抗體、免疫熒光法進(jìn)行。取生長良好，0.4%臺盼藍(lán)染色，細(xì)胞的成活率>98%可行后續(xù)實驗。

1.4 免疫熒光法測定鹽負(fù)荷和醛固酮對心肌細(xì)胞橫截面積的影響

以1×105/mL將心肌細(xì)胞接種于6孔板，3個復(fù)孔/組，24 h后DMEM培養(yǎng)液同步化細(xì)胞；實驗分為正常對照組、醛固酮10～7 mol/L（Ald）組、等鈉濃度140 mmol/L（NS）組、高鈉濃度146 mmol/L（HS）組、等鈉濃度140 mmol/L+Ald 10～7mol/L（NS+Ald）組、高鈉濃度146 mmol/L+Ald 10～7 mol/L（HS+Ald）組；其中NS+Ald組與HS+Ald組先不加Ald，培養(yǎng)48 h后，再加入Ald，所有處理組繼續(xù)培養(yǎng)24 h。余操作同細(xì)胞鑒定，熒光顯微鏡觀察細(xì)胞形態(tài)。實驗重復(fù)3次，ImageJ 1.46r軟件計算心肌細(xì)胞面積。

1.5 CCK-8法實驗檢測心肌細(xì)胞存活率

以5×104/mL將心肌細(xì)胞接種于96孔板，分組同“1.4”，不同實驗組同步化細(xì)胞72 h，設(shè)立不加細(xì)胞的調(diào)零孔，按試劑盒說明書添加CCK-8溶液并檢測吸光度。6個復(fù)孔/組，實驗重復(fù)3次。細(xì)胞存活率（%）=[A（不同處理）-A（調(diào)零）]/[A（正常對照）-A（調(diào)零）]×100%。

1.6 流式細(xì)胞儀檢測心肌細(xì)胞凋亡率

細(xì)胞分組同“1.4”，收集上清液。測定及結(jié)果判斷按Annexin V-FITC細(xì)胞凋亡檢測試劑盒說明書進(jìn)行[7]。

1.7 qRT-PCR檢測不同處理組的心肌細(xì)胞中內(nèi)皮素 -1（ET-1）、一氧化氮合酶（eNOS）mRNA表達(dá)的影響

細(xì)胞分組同“1.4”。①提取總RNA，電泳對所得RNA檢測其完整性，OD260∶280在1.8～2.0為符合濃度及純度。②逆轉(zhuǎn)錄聚合酶鏈?zhǔn)椒磻?yīng)，引物由上海生工生物公司采用Batch Primer 3軟件設(shè)計并合成，序列為（5'～3'）：ET-1上游：CTGGACATCATCTGGGTCAA，下游：CTGTTCCCTTGGTCTGTGGT；eNOS上游：TTCCGGCTGCCACCTGATCCTAA，下游：AACATGTGTCCTTGCTCGAGGCA；GAPDH（內(nèi)參基因）上游：GAAG？鄄GGCTCATGACCACAGT，下游：GGATGCAGGGATGAT？鄄GTTCT。cDNA按逆轉(zhuǎn)錄試劑盒說明書進(jìn)行，反應(yīng)條件：合成變性94℃ 3 min，擴增94℃ 30 s，退火30 s（ET-1 55.0℃；eNOS 54.0℃；GAPDH 55.0℃），延伸72℃45 s，30次循環(huán)，終末延伸72℃ 10 min。待測基因mRNA相對表達(dá)量（2-ΔΔCT）=待測基因/GAPDH比值。IQ5 Real Time PCR系統(tǒng)進(jìn)行檢測。

1.8 統(tǒng)計學(xué)方法

采用統(tǒng)計軟件SPSS 16.0對數(shù)據(jù)進(jìn)行分析，正態(tài)分布的計量資料以均數(shù)±標(biāo)準(zhǔn)差（x±s）表示，多組間比較采用方差分析，兩兩比較采用LSD-t檢驗及Tukey法。兩組之間相關(guān)性采用Pearson相關(guān)分析。以P < 0.05為差異有統(tǒng)計學(xué)意義。

2 結(jié)果

2.1 不同細(xì)胞條件培養(yǎng)液對心肌細(xì)胞橫截面積的差異比較

免疫熒光結(jié)果（圖1，封四）示，72 h后，與正常對照組比較，Ald組、NS組心肌細(xì)胞的橫截面積無明顯變化，HS組橫截面積有輕度增加，差異無統(tǒng)計學(xué)意義（P > 0.05）；NS+Ald組及HS+Ald組的心肌細(xì)胞橫截面積增加明顯（P < 0.01）；LSD及Tukey法組間兩兩比較示，NS+Ald組、HS+Ald組心肌細(xì)胞橫截面積明顯大于Ald組/NS組/ HS組，差異有統(tǒng)計學(xué)意義（P < 0.01）；Ald組、NS組及HS組差異無統(tǒng)計學(xué)意義（P > 0.05）。Pearson相關(guān)分析顯示，Ald組/NS組/HS組心肌細(xì)胞橫截面積分別與NS+Ald組、HS+Ald組呈現(xiàn)明顯的正相關(guān)（0.689≤r≤0.852，P < 0.01）。

2.2 不同細(xì)胞條件培養(yǎng)液對心肌細(xì)胞存活率的差異比較

與正常對照組比較，不同處理組的心肌細(xì)胞存活率有所下降，其中Ald組（87.27±0.06）%、NS組（93.75±0.21）%和HS組（89.04±0.14）%的細(xì)胞存活率差異無統(tǒng)計學(xué)意義（P > 0.05），NS+Ald組（77.64±0.11）%和HS+Ald組（67.97±0.12）%心肌細(xì)胞存活率顯著降低（P < 0.01）。endprint

2.3 不同細(xì)胞條件培養(yǎng)液對心肌細(xì)胞凋亡的影響

正常對照組與NS組均現(xiàn)少量的心肌細(xì)胞凋亡，與正常對照組比較，Ald組、HS組、NS+Ald組及HS+Ald組的心肌細(xì)胞存在不同程度的凋亡（P < 0.01），隨著鹽負(fù)荷增加，心肌細(xì)胞凋亡率明顯上升；且給予醛固酮刺激后，心肌細(xì)胞凋亡率也顯著上升。見圖2。

2.4 不同細(xì)胞條件培養(yǎng)液對心肌細(xì)胞ET-1、eNOSmRNA表達(dá)的影響

qRT-PCR表明：與正常對照組比較，NS組ET-1 mRNA表達(dá)差異不大，Ald組、HS組、NS+Ald組和HS+Ald組ET-1 mRNA表達(dá)水平有所增加，除HS組外，其余組ET-1 mRNA表達(dá)明顯增高（P < 0.05），其中以HS+Ald組最為顯著（P < 0.01）（圖3A）。eNOS mRNA表達(dá)呈現(xiàn)與ET-1 mRNA相反趨勢，與正常對照組比較，除NS組eNOS mRNA表達(dá)無顯著性差異外，Ald組、HS組、NS+Ald組和HS+Ald組eNOS mRNA表達(dá)均呈現(xiàn)下降趨勢（P < 0.01或P < 0.05），其中以HS+Ald組最為顯著（P < 0.01）（圖3B）。

3 討論

研究提示，心臟系醛固酮的一個重要效應(yīng)器官[8-10]，醛固酮可通過控制離子平衡來增加心肌細(xì)胞中Na+-K+-ATP酶、Na+內(nèi)流及Na+-K+交換活性[11]；其中，心肌細(xì)胞中ET-1、eNOS等重要因子可通過腎素-血管緊張素系統(tǒng)調(diào)節(jié)心臟血液動力學(xué)導(dǎo)致血壓的變化，從而促進(jìn)心肌肥大，引起心肌重構(gòu)。動物實驗結(jié)果表明[12]，食鹽量≤5 g/d時，醛固酮對心肌無任何損害作用，即食鹽或許作為重要因素參與醛固酮作用的心肌細(xì)胞肥大，并起到協(xié)同作用。

心肌肥大是當(dāng)心臟受到多種壓力刺激下，長期超負(fù)荷工作所導(dǎo)致的一種慢性代償性的病理改變[13]。實驗結(jié)果顯示了氯化鈉與醛固酮對心肌細(xì)胞肥大的協(xié)同作用，分析原因為：心肌細(xì)胞內(nèi)Na+濃度增加，激活胞內(nèi)Na+/Ca2+交換體[14]，反向轉(zhuǎn)運引起胞內(nèi)Ca2+的超載、進(jìn)入心肌細(xì)胞與其受體相結(jié)合，造成心肌結(jié)構(gòu)重建、心肌細(xì)胞肥大。

心肌細(xì)胞凋亡是促使心肌細(xì)胞肥大失代償期轉(zhuǎn)化為心力衰竭至關(guān)重要的部分[15]。結(jié)果中，NS+Ald組和HS+Ald組的心肌細(xì)胞存活率及凋亡率變化最為顯著，表明鹽負(fù)荷和醛固酮的協(xié)同作用，導(dǎo)致心肌細(xì)胞出現(xiàn)廣泛鈉潴留、交感系統(tǒng)被激活、心肌細(xì)胞結(jié)構(gòu)出現(xiàn)變異、心肌重塑，形成一個惡性循環(huán)[16]。

正常心肌細(xì)胞通過表達(dá)eNOS合成一氧化氮，持續(xù)抑制eNOS活性等導(dǎo)致eNOS缺失會引發(fā)實驗鼠的心肌肥大[17-19]。ET-1是極具典型意義的血管活性物質(zhì)，可與其特異性的受體結(jié)合，參與心肌肥大的病理過程[20]。本結(jié)果表明，eNOS的表達(dá)下調(diào)及ET-1表達(dá)上升可能為誘導(dǎo)心肌細(xì)胞肥大的作用靶點，鹽與Ald[12]也可能是通過降低或抑制eNOS的表達(dá)來促進(jìn)ET-1的表達(dá)上升，參與了心肌細(xì)胞肥大的發(fā)生、發(fā)展進(jìn)程。

本研究觀察鹽負(fù)荷和醛固酮對心肌細(xì)胞的長期作用，顯示鹽負(fù)荷和醛固酮是誘導(dǎo)心肌細(xì)胞肥大產(chǎn)生的重要因子，具有協(xié)同作用，醛固酮在氯化鈉的介導(dǎo)[12]下參與誘導(dǎo)心肌細(xì)胞肥大、誘發(fā)心肌細(xì)胞結(jié)構(gòu)變異、使eNOS和ET-1基因表達(dá)平衡破壞，其中以高鹽狀態(tài)下，醛固酮產(chǎn)生的協(xié)同作用導(dǎo)致的心肌細(xì)胞肥大最為顯著。

[參考文獻(xiàn)]

[1] 由淑萍，從美麗，倪國華，等.哈薩克族原發(fā)性高血壓病患者全血DNA甲基化位點篩查及異常甲基化譜的構(gòu)建[J].中國全科醫(yī)學(xué)，2017，20（6）：678-683.

[2] 由淑萍，詹懷峰，王紅軍，等.新疆南山牧區(qū)哈薩克族人群高血壓患病率及危險因素分析[J].現(xiàn)代預(yù)防醫(yī)學(xué)，2017， 44（5）：863-866，902.

[3] 高斐.高鹽攝入加速誘導(dǎo)的高血壓性左室重塑及心臟淋巴管變化的實驗研究[D].天津：天津醫(yī)科大學(xué)，2011：10-15.

[4] Mimran A，Du Cmlar G. Dietary sodium：the dark horse amongst cardiovascular and renal risk factors [J]. Nephrol Dial Transplant，2008，23（7）：2138-2141.

[5] Liu HB，Zhang J，Sun YY，et al. Dietary salt regulates epithelial sodium channels in rat endothelial cells：adaptation of vasculature to salt [J]. Br J Pharmacol，2015，172（23）：5634-5646.

[6] 陶靜，馬依彤，李曉梅，等.原代乳鼠心肌細(xì)胞培養(yǎng)方法的改進(jìn)[J].中華心血管病雜志，2014，42（1）：53-56.

[7] 由淑萍，趙軍，馬龍，等.肉蓯蓉苯乙醇總苷及其單體對肝星狀細(xì)胞增殖和凋亡的影響[J].癌變·畸變·突變，2017， 29（1）：13-17，22.

[8] 趙勤，楊進(jìn).醛固酮參與左心室重構(gòu)研究新進(jìn)展[J].世界臨床醫(yī)學(xué)，2017，11（12）：117-118.

[9] Vinod P，Krishnappa V，Chauvin AM，et al.Cardiorenal synd？鄄rome：role of arginine vasopressin and vaptans in heart failure [J]. Cardiol Res，2017，8（3）：87-95.

[10] Feola M，Monteverde M，Vivenza D，et al. Prognostic value of different allelic polymorphism of aldosterone synthase receptor in a congestive heart failure european continental ancestry population [J]. Arch Med Res，2017，48（2）：156-161.endprint

[11] Wagner M，Rudakova E，Volk T. Aldosterone-induced changes in the cardiac L-type Ca2+ current can be preven？鄄ted by antioxidants in vitro and are absent in rats on low salt diet [J]. Pflugers Arch，2008，457（2）：339-349.

[12] 吉村道博.醛固酮和食鹽促進(jìn)心肌肥大的機制——MR阻斷劑的作用點[J].日本醫(yī)學(xué)介紹，2007，28（5）：208-211.

[13] 王桂君，姚玉勝，王洪新.腫瘤壞死因子α通過PI3K-IP3R-Ca2+途徑誘導(dǎo)乳鼠心肌肥大[J].中國病理生理雜志，2016，32（1）：21-26.

[14] 黃世亮，郭瑞威，匡陳偉，等.鈉鈣交換體1在高血壓發(fā)病學(xué)中的研究進(jìn)展[J].西南國防醫(yī)藥，2016，26（2）：215-217.

[15] Frustaci A，Chimenti C，Setoguchi M，et al. Cell death in acromegalic cardiomyopathy[J].Circulation，1999，99：1426-1434.

[16] Mizuno Y，Yasue H，Yoshimura M，et al. Effects of perin？鄄dopril on aldosterone production in the failing human heart [J]. Am J Cardiol，2002，89（10）：1197-1200.

[17] Balakumar P，Kathuria S，Taneja G，et al. Is targeting eNOS akey mechanistic insight of cardiovascular defen？鄄sive potentials of statins [J]. J Mol Cell Cardiol，2012，52（1）：83-92.

[18] Liu Y，F(xiàn)eng Q. NOing the heart：role of nitric oxide synthase-3 in heart development [J]. Differentiation，2012， 84（1）：54-61.

[19] 黃小陽，李卓明，劉志平，等.SIRT6通過調(diào)節(jié)eNOS抑制心肌肥大的機制研究[J].中山大學(xué)學(xué)報：醫(yī)學(xué)科學(xué)版，2015，36（3）：338-345.

[20] 孔令雷，顏玲娣，宮澤輝.內(nèi)皮素系統(tǒng)與心肌肥厚[J].中國藥理學(xué)通報，2008，24（9）：1127-1130.

（收稿日期：2017-07-06 本文編輯：蘇 暢）endprint