131例強(qiáng)直性脊柱炎患者Treg細(xì)胞與淋巴細(xì)胞亞群分析

魏云玉　韓志君　黃紅宇

[摘要] 目的 觀(guān)察強(qiáng)直性脊柱炎（AS）患者外周血Treg細(xì)胞與淋巴細(xì)胞各亞群的變化及HLA-B27的表達(dá)，探討各自在A(yíng)S患者發(fā)展中的作用。 方法 應(yīng)用流式細(xì)胞學(xué)方法，選取2013年2月～2016年12月于無(wú)錫市第二人民醫(yī)院骨科和風(fēng)濕科就診的AS患者131例為AS組，選取健康體檢者127例為正常對(duì)照組，進(jìn)行外周血Treg細(xì)胞、淋巴細(xì)胞亞群、HLA-B27的檢測(cè)，分析Treg細(xì)胞、淋巴細(xì)胞亞群、HLA-B27與AS患者的關(guān)系。 結(jié)果 131例AS組中HLA-B27檢測(cè)陽(yáng)性為123例（93.89%），正常對(duì)照組中HLA-B27檢測(cè)陽(yáng)性為2例（1.57%），差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P < 0.05）。AS組患者CD3+CD4+、CD4/CD8、CD3-CD19+陽(yáng)性率明顯高于正常對(duì)照組（P < 0.05），CD3+CD8+、CD16+/CD56+陽(yáng)性率低于正常對(duì)照組（P < 0.05）。AS組患者CD4+CD25high、CD4+CD25highCD127low陽(yáng)性率均低于正常對(duì)照組，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P < 0.05）。兩組CD3+、CD3+CD4+陽(yáng)性率比較差異無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P > 0.05）。 結(jié)論 HLA-B27與AS有強(qiáng)相關(guān)性。外周血中淋巴細(xì)胞各亞群組分在A(yíng)S與正常對(duì)照組中存在明顯差異。同時(shí)外周血中Treg細(xì)胞在A(yíng)S患者中明顯降低。以上發(fā)現(xiàn)提示細(xì)胞免疫和體液免疫可能在A(yíng)S中發(fā)揮重要作用。

[關(guān)鍵詞] 強(qiáng)直性脊柱炎；Treg細(xì)胞；淋巴細(xì)胞亞群；HLA-B27

[中圖分類(lèi)號(hào)] R681.5 [文獻(xiàn)標(biāo)識(shí)碼] A [文章編號(hào)] 1673-7210（2017）10（a）-0046-03

[Abstract] Objective To analyze the changes of regulatory T cells （Treg cells） and the subsets of lymphocytes as well as the HLA-B27 expression in peripheral blood of ankylosing spondylitis （AS） patients， and then explore their roles in the development of AS. Methods Flow cytometry was applied. From February 2013 to December 2016， Department of Orthopedic and Rheumatology in Wuxi Second People's Hospital， 131 cases of AS patients were selected as AS group， 127 healthy subjects were selected as normal control group. The peripheral blood Treg cells， lymphocyte subsets and HLA-B27 were detected. The relationship of Treg cells， lymphocyte subsets， HLA-B27 and AS patients were analyzed. Results 131 cases of AS group， HLA-B27 positive for 123 cases （93.89%）， the positive rate of HLA-B27 in normal control group was 2 cases （1.57%）， the difference was statistically significant （P < 0.05）. The positive rate of CD3+CD4+， CD4/CD8 and CD3-CD19+ in AS group were significantly higher than those in normal control group （P < 0.05）. The positive rate of CD3+CD8+， CD16+/CD56+ in AS group were lower than those in normal control group （P < 0.05）. The positive rate of CD4+CD25high and CD4+CD25highCD127low in AS group were lower than those in normal control group， the differences were statistically significant （P < 0.05）. There was no significant difference in the positive rate of CD3+ and CD3+CD4+ between two groups （P > 0.05）. Conclusion HLA-B27 has a strong correlation with AS. There are significant differences in the subgroups of lymphocytes in peripheral blood between AS and normal control group. At the same time， peripheral blood Treg cells in AS patients are significantly reduced. The above findings suggest that cellular immunity and humoral immunity may play an important role in AS.endprint

[Key words] Ankylosing spondylitis； Regulatory T cells； Lymphocyte subsets； HLA-B27

強(qiáng)直性脊柱炎（ankylosing spondylitis，AS）是一種全身免疫疾病，以慢性炎癥為主，它可侵犯脊柱關(guān)節(jié)，累及肌腱、滑膜等關(guān)節(jié)，大部分患者有骶髂關(guān)節(jié)炎。AS青壯年多發(fā)，有家族聚集性，可能與遺傳相關(guān)。其發(fā)病機(jī)制復(fù)雜，迄今未明[1]。Treg細(xì)胞是有免疫調(diào)節(jié)作用的特殊的一群淋巴細(xì)胞。在維持免疫自穩(wěn)中起重要作用。AS患者是一種全身性免疫疾病，本研究主要觀(guān)察其與外周血淋巴細(xì)胞和Treg細(xì)胞比例變化的關(guān)系，探討淋巴細(xì)胞及其各組分失衡對(duì)AS發(fā)生、發(fā)展的影響，有可能為AS的發(fā)病機(jī)制研究及治療提供一條思路。

1 對(duì)象與方法

1.1 研究對(duì)象

選取2013年2月～2016年12月于無(wú)錫市第二人民醫(yī)院骨科和風(fēng)濕科門(mén)診或住院的AS患者131例為AS組，患者診斷均符合1984年的AS紐約標(biāo)準(zhǔn)[2]，其中男75例，女56例，年齡18～65歲，平均（27±8）歲，病程3～8年，平均（5.3±2.7）年，收集了AS患者基本情況和臨床資料，HLA-B27陽(yáng)性患者128例，陰性患者3例?；颊呋顒?dòng)度評(píng)價(jià)，采用2009年由國(guó)際脊柱關(guān)節(jié)炎協(xié)會(huì)（ASAS）重新制訂的新的AS病情活動(dòng)度評(píng)分（ASDAS）[3]。正常對(duì)照組選取健康體檢者127例，男70例，女57例，平均年齡（26±9）歲。均不符合1984年的AS診斷標(biāo)準(zhǔn)，無(wú)重大疾病史，沒(méi)有長(zhǎng)期應(yīng)用激素或免疫抑制劑，咨詢(xún)受檢者，本人或直系親屬未患自身免疫性疾病。

1.2 主要儀器和試劑

CYTOMICS FC500流式細(xì)胞儀（美國(guó)Beckman Coulter公司），熒光抗體CD4-FITC/CD8-PE/CD3-PC5，Anti-HLA-B27-FITC/Anti-HLA-B7-PE，CD4-FITC，CD25-PECY5，CD127-PE，購(gòu)于Beckman Coulter公司，CD3-FITC/CD16+56-PE，CD19-PE，購(gòu)于美國(guó)BD公司。

1.3 方法

1.3.1 血液樣本準(zhǔn)備 所有AS患者和正常對(duì)照組人員于早晨7：30～8：30之間空腹抽取2 mL靜脈于EDTA抗凝管中。2 h內(nèi)用于流式細(xì)胞儀的分析。

1.3.2 流式細(xì)胞分析HLA-B27、淋巴細(xì)胞亞群、Treg細(xì)胞 將每個(gè)標(biāo)本分成5管：HLA-B27/HLA-B7管、CD4/CD8/CD3管、CD4/CD25/CD127管、CD3/CD16+56管和CD19管。分別加入各自抗體20 μL，每管加入100 μL EDTA抗凝全血，避光孵育20 min，PBS洗滌2次后上機(jī)檢測(cè)。

1.4 統(tǒng)計(jì)學(xué)方法

采用SPSS 13.0統(tǒng)計(jì)軟件對(duì)數(shù)據(jù)進(jìn)行分析和處理，計(jì)量資料以均數(shù)±標(biāo)準(zhǔn)差（x±s）表示，采用t檢驗(yàn)，計(jì)數(shù)資料采用χ2檢驗(yàn)，以P < 0.05為差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

2 結(jié)果

2.1 HLA-B27檢測(cè)

131例AS組中HLA-B27檢測(cè)陽(yáng)性為123例（93.89%），正常對(duì)照組中HLA-B27檢測(cè)陽(yáng)性為2例（1.57%），差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P < 0.05）。我國(guó)AS患者中HLA-B27陽(yáng)性率達(dá)90%[4]。

2.2 淋巴細(xì)胞亞群檢測(cè)

AS組患者CD3+CD4+、CD4/CD8、CD3-CD19+陽(yáng)性率明顯高于正常對(duì)照組（P < 0.05），CD3+CD8+、CD16+/CD56+陽(yáng)性率低于正常對(duì)照組（P < 0.05）；兩組CD3+陽(yáng)性率比較差異無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P > 0.05）。見(jiàn)表1。

2.3 Treg細(xì)胞檢測(cè)

AS組患者CD4+CD25high、CD4+CD25highCD127low陽(yáng)性率均低于正常對(duì)照組，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P < 0.05）；兩組CD3+CD4+陽(yáng)性率比較差異無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P > 0.05）。見(jiàn)表2。

3 討論

AS是具有遺傳性的慢性自身免疫疾病，可伴有血液系統(tǒng)、肺部、心臟、神經(jīng)系統(tǒng)等關(guān)節(jié)外病變損害[5]。其發(fā)病率在我國(guó)約為0.3%[6-7]。HLA-B27與AS有強(qiáng)相關(guān)性，其直接參與了AS的發(fā)病。本研究結(jié)果AS患者HLA-B27陽(yáng)性率達(dá)到93.89%，正常人也有一部分陽(yáng)性，但比例比較小。HLA-B27高表達(dá)的同時(shí)，可能其他免疫分子也發(fā)生了變化，一般的表現(xiàn)為免疫功能非正常的亢進(jìn)，形成多關(guān)節(jié)的炎性反應(yīng)[8]。

在A(yíng)S的發(fā)生、發(fā)展過(guò)程中還與很多因素有關(guān)，免疫功能的紊亂、炎癥細(xì)胞浸潤(rùn)、遺傳因素、環(huán)境因素、細(xì)胞因子的作用等都有可能對(duì)其發(fā)揮作用[9-12]。淋巴細(xì)胞亞群和Treg細(xì)胞數(shù)量的變化和功能上的失衡與多種免疫疾病有關(guān)[13-14]。我們的研究發(fā)現(xiàn)，AS患者的淋巴細(xì)胞有多項(xiàng)亞群以及Treg細(xì)胞與正常對(duì)照差異有顯著性。表明AS患者體內(nèi)存在免疫功能的失衡。Treg細(xì)胞在數(shù)量或功能上的減少導(dǎo)致免疫穩(wěn)定的破壞，使AS患者發(fā)病。這可能是一個(gè)重要原因。

本文的數(shù)據(jù)顯示，CD3+CD4+T細(xì)胞升高，CD3+CD8+T細(xì)胞降低，CD4/CD8比值升高，CD3-CD19+B細(xì)胞升高，提示AS患者細(xì)胞免疫功能亢進(jìn)，體液免疫可能也增強(qiáng)了，CD16+/CD56+NK細(xì)胞功能下降。有研究表明[15-16]，AS患者的B淋巴細(xì)胞活動(dòng)性增強(qiáng)，增加的B淋巴細(xì)胞分泌大量的免疫球蛋白，使血清中免疫球蛋白顯著增加，自身抗體也增多[17-21]，臨床上出現(xiàn)一系列的免疫功能紊亂的癥狀。NK細(xì)胞功能下降使抑制B細(xì)胞的分化增殖功能下降，體液免疫功能進(jìn)一步增強(qiáng)，疾病加重。Park等[22]研究表明，系統(tǒng)性紅斑狼瘡、類(lèi)風(fēng)濕性關(guān)節(jié)炎等自身免疫病患者外周血NK細(xì)胞減少、功能受損。本文研究發(fā)現(xiàn)，AS患者NK細(xì)胞也下降，不能有效調(diào)節(jié)自身免疫。另外，Treg細(xì)胞也可以反向調(diào)節(jié)T淋巴細(xì)胞的活性與抑制其增殖，Treg細(xì)胞通過(guò)直接接觸、釋放細(xì)胞因子、顆粒酶等殺傷T細(xì)胞、單核細(xì)胞、B細(xì)胞。endprint

基于以上討論，免疫功能的紊亂在A(yíng)S的發(fā)病過(guò)程中起一定的作用，淋巴細(xì)胞亞群、Treg細(xì)胞的檢測(cè)可作為AS的重要診斷指標(biāo)。適當(dāng)提高Treg細(xì)胞水平和降低B細(xì)胞活性，可能對(duì)AS患者的治療有重要的意義，這給臨床對(duì)AS的治療提供了新的思路。

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（收稿日期：2017-06-06 本文編輯：李亞聰）endprint