焦磷酸測序檢測CYP2C19基因多態(tài)性方法的建立

楊楠楠+徐琴+羅振元+付雪++黃盛文

[摘要] 目的 建立一種基于焦磷酸測序技術(shù)的用于CYP2C19基因多態(tài)性快速檢測的方法。 方法 選擇2016年12月～2017年3月于貴州省人民醫(yī)院行健康體檢者50名，提取其基因組DNA，針對CYP2C19*2（681G>A）、CYP2C19*3（636G>A）、CYP2C19*17（-806C>T）3個單核苷酸多態(tài)性（SNP）位點分別設(shè)計一套PCR擴增引物和焦磷酸測序引物。將PCR擴增產(chǎn)物制備成單鏈測序模板，用Qiagen PyroMark Q24焦磷酸測序儀進行測序和基因型分析，采用Sanger一代測序技術(shù)對焦磷酸測序結(jié)果進行驗證。 結(jié)果 根據(jù)出峰的堿基和峰高可清楚判斷出3個SNP位點的不同基因型，檢測結(jié)果與Sanger測序結(jié)果完全一致。50名健康體檢者中檢出CYP2C19超快代謝型1例，快代謝型22例，中代謝性22例，慢代謝型5例。 結(jié)論 本研究建立的焦磷酸測序檢測CYP2C19基因多態(tài)性的方法具有快速、準(zhǔn)確、成本低的特點，適用于臨床實驗室對CYP2C19基因多態(tài)性的分型。

[關(guān)鍵詞] CYP2C19；基因多態(tài)性；焦磷酸測序；氯吡格雷

[中圖分類號] R446.9 [文獻標(biāo)識碼] A [文章編號] 1673-7210（2017）10（b）-0011-04

Establishment of genotyping methods for polymorphisms of CYP2C19 gene based on pyrosequencing technology

YANG Nannan1 XU Qin1 LUO Zhenyuan2 FU Xue2 HUANG Shengwen2▲

1.School of Clinical Laboratory Science， Guizhou Medical University， Guizhou Province， Guiyang 550004， China； 2.Department of Clinical Laboratory， Guizhou Provincial People′s Hospital， Guizhou Province， Guiyang 550002， China

[Abstract] Objective To establish a fast detection method for CYP2C19 genotyping based on pyrosequencing technology. Methods Genomic DNA was extracted from 50 blood samples of healthy subjects collected from December 2016 to March 2017 in Guizhou Provincial People′s Hospital， and a set of amplification primers and pyrophosphate sequencing primers were designed according to the single nucleotide polymorphism （SNP） sites of CYP2C19*2 （681G>A）， CYP2C19*3 （636G>A）， CYP2C19*17 （-806C>T）. Single-stranded templates were made from PCR products， then sequencing and genotyping analysis were performed on a Qiagen PyroMark Q24 Sequencer System. The sequencing results were verified via Sanger sequencing. Results Based on the type and peak height of bases of DNA sequence， the genotypes of three SNPs could be identified clearly， which were consistent with Sanger sequencing results. Among the 50 samples of healthy group， 1 case was ultra-rapidmetabolism， 22 cases were rapidmetabolism， 22 cases were medium metabolism and 5 cases were slow metabolism. Conclusion The detection method of CYP2C19 polymorphism based on pyrosequencing technology is quick， accurate and convenient， which can be used to analyze the genotyping of CYP2C19 gene polymorphism.

[Key words] CYP2C19； Gene polymorphism； Pyrosequencing； Clopidogrel

氯吡格雷是臨床上常用的抗血小板聚集的藥物之一，冠狀動脈介入術(shù)（percutaneous coronary intervention，PCI）后患者需長期服用氯吡格雷來進行抗血小板治療[1-2]，但臨床上部分患者會出現(xiàn)氯吡格雷抵抗[3]。氯吡格雷的主要代謝酶為細胞色素P4502C19[4-6]，其編碼基因CYP2C19的多態(tài)性是影響氯吡格雷療效的主要遺傳因素[7-8]。CYP2C19的等位基因以CYP2C19*1（野生型）、CYP2C19*2、CYP2C19*3和CYP2C19*17較常見[9]。超快代謝型的基因型為*1/*17、*17*17，快代謝型的基因型為*1/*1，中代謝型的基因型為*1/*2、*1/*3，慢代謝型的基因型為*2/*2、*3/*3和*2/*3[10-11]。本研究采用焦磷酸測序技術(shù)建立了一種CYP2C19基因多態(tài)性檢測方法，并用Sanger測序法對其準(zhǔn)確性進行驗證。endprint

1 對象與方法

1.1 對象

選擇2016年12月～2017年3月貴州省人民醫(yī)院健康體檢成人50名，其中男21名，女29名，平均年齡為（35.7±9.7）歲。

1.2 主要儀器與試劑

NP968核酸自動提取儀（西安天隆科技有限公司）；美國ABI Veriti96 PCR儀（美國ABI生物系統(tǒng)公司）；Qiagen PyroMark Q24焦磷酸測序儀（德國凱杰公司）；PCR擴增引物和焦磷酸測序引物（上海生工生物有限公司）。

1.3 方法

1.3.1 基因組DNA的提取 根據(jù)天隆NP968核酸自動提取儀的說明書進行全血DNA提取，對DNA樣本進行濃度和純度檢測，置于-20℃保存?zhèn)溆谩?/p>

1.3.2 CYP2C19多態(tài)性位點的引物設(shè)計 在NCBI上分別下載CYP2C19*2（681G>A）、CYP2C19*3（636G>A）和CYP2C19*17（-806C>T）3個單核苷酸多態(tài)性（single nucleotide polymorphism，SNP）位點上下游各1 kb范圍的基因序列，采用PyroMark Assay Design Software 2.0（德國凱杰公司）軟件設(shè)計PCR引物和焦磷酸測序引物。見表1。

1.3.3 PCR擴增 25 μL PCR反應(yīng)體系包括：PyroMark PCR Master Mix 12.5 μL，CoraLoad Concentrate 2.5 μL，Q-Solution 5 μL，25 mmol/L MgCl2 1.5 μL，上下游PCR引物各0.5 μL，DNA 1 μL，RNase-free water 1.5 μL。PCR反應(yīng)條件：95℃預(yù)變性15 min，94℃變性30 s，CYP2C19*2 50℃、CYP2C19*3 53℃、CYP2C19*17 49℃退火30 s，72°C延伸30 s，共45個循環(huán)，最后72℃延伸10 min。PCR產(chǎn)物經(jīng)過2%的瓊脂糖凝膠電泳檢測是否為所需的目的片段。

1.3.4 制備預(yù)混液以固定PCR產(chǎn)物 80 μL反應(yīng)體系包括Beads 2 μL，Binding buffer 40 μL，PCR產(chǎn)物10 μL，高純水28 μL。

1.3.5 單鏈的分離 將0.3 μmol/L測序引物分配到q24反應(yīng)板的每個孔中。打開開關(guān)，將真空工具放到PCR管的孔中，持續(xù)15 s，以捕獲帶有PCR產(chǎn)物的sepharose珠。依次用70%乙醇、變性溶液、洗滌液沖洗真空工具10 s，關(guān)閉真空開關(guān)。將真空工具放到孔中，左右輕柔晃動，以釋放含有磁珠的產(chǎn)物。

1.3.6 測序引物與DNA鏈退火 將q24反應(yīng)板置于80℃加熱塊上加熱樣本2 min，樣本冷卻至室溫（15～25℃）后即可放入焦磷酸測序儀內(nèi)測序。

1.3.7 基因型分析 通過Qiagen PyroMark Q24（德國凱杰公司）軟件對結(jié)果進行分析，根據(jù)出峰的堿基和峰高分別判斷各位點的基因型。

1.3.8 Sanger測序驗證 將3個SNP位點的PCR產(chǎn)物送上海生工生物有限公司采用Sanger測序法進行檢測，并與焦磷酸測序結(jié)果進行比對。

2 結(jié)果

2.1 PCR結(jié)果

電泳結(jié)果顯示，3個SNP位點的PCR產(chǎn)物均在相應(yīng)位置呈單一條帶。見圖1。

2.2 3個SNP位點的基因型檢測結(jié)果

3個SNP位點均可通過出峰的堿基和峰高清楚判斷出不同的基因型，信噪比較高，非特異峰的比例均在10%以內(nèi)。50個樣本中3個位點的基因型與Sanger測序結(jié)果完全一致。見圖2～4（左側(cè)為焦磷酸測序檢測結(jié)果，右側(cè)為Sanger測序結(jié)果）。

2.3 50名樣本CYP2C19基因型檢測結(jié)果

根據(jù)3個SNP位點的檢測結(jié)果，可以得出每個樣本的CYP2C19基因型，并判斷出其代謝類型。50名健康體檢者中檢出超快代謝型1例，快代謝型22例，中代謝性22例，慢代謝型5例。見表2。

CYP2C19的4種等位基因頻率顯示，野生型CYP2C19*1所占比例為67.0%，其次是CYP2C19*2，占29.0%。見表3。

3 討論

檢測CYP2C19多態(tài)性的方法除了金標(biāo)準(zhǔn)Sanger測序技術(shù)外，常用的還有限制性片段長度多態(tài)分析、飛行時間質(zhì)譜[12]、DNA微陣列芯片、高分辨率熔解曲線分析、Taqman探針等技術(shù)[13]。這些技術(shù)均具有較高的準(zhǔn)確性，但操作步驟較為繁瑣，或是需要依賴昂貴的儀器，檢測成本較高，不適合規(guī)模的推廣應(yīng)用。為適應(yīng)臨床對CYP2C19基因多態(tài)性檢測的需要，有必要建立一種高效、快速、準(zhǔn)確度高、靈敏度好、經(jīng)濟適用的檢測方法。

焦磷酸測序是一種基于DNA序列分析的技術(shù)，是檢測SNP最為準(zhǔn)確的方法之一[14]。焦磷酸測序適用于對已知短序列的測序分析，其敏感性和精確性能與金標(biāo)準(zhǔn)（Sanger測序法）相提并論，并能夠?qū)崟r、直觀、準(zhǔn)確、定量提供待測序列的信息[15-17]，已廣泛用于基因多態(tài)性檢測、微生物分型、基因甲基化檢測等領(lǐng)域[18]。

本研究建立的焦磷酸測序檢測方法可對CYP2 C19基因進行快速、準(zhǔn)確的分型，可在20 min內(nèi)對24個標(biāo)本進行平行檢測，檢測結(jié)果與Sanger測序結(jié)果完全一致，并且檢測成本低于Sanger測序法。另外，由于人群中等位基因CYP2C19*17的頻率較低，其他方法較少對其進行檢測，本研究建立的檢測方法包含了對CYP2C19*17的檢測，可更為全面地指導(dǎo)氯吡格雷的個體化用藥。

本研究共檢測到的5種CYP2C19基因型，其中超快代謝型（*1/*17）占2%，快代謝型（*1/*1）占44%，中間代謝型（*1/*2、*1/*3）占44%，慢代謝型（*2/*2）占10%。等位基因CYP2C19*1、CYP2C19*2、CYP2C19* 3、CYP2C19*17的頻率分別為67%、29%、3%和1%，與國內(nèi)其他地區(qū)人群的研究結(jié)果基本一致[19-21]。endprint

[參考文獻]

[1] 馬輝，胡增春，呂慧怡，等.CYP2C19基因多態(tài)性檢測在PCI術(shù)后氯吡格雷用藥中的研究[J].醫(yī)學(xué)與哲學(xué)，2016， 37（8）：29-31.

[2] Saydam F，De■irmenci ■，Birdane A，et al. The CYP2C19*2 and CYP2C19*17 Polymorphisms play a Vital Role in Clopidogrel Responsiveness after Percutaneous Coronary Intervention：A Pharmacogenomics Study [J]. Basic Clin Pharmacol Toxicol，2017，37（8）：e48.

[3] Bonvini RF，Reny JL，Mach F，et al. Acute coronary syndrome and its antithrombotic treatment：focus on aspirin and clopidogrel resistance [J]. Curr Vasc Pharmacol，2009， 7（2）：198.

[4] Christiaens L，Macchi L. Monitoring of the antiplatelet drugs effect in patients with coronary artery disease：what is the real clinical impact？[J]. Curr Vasc Pharmacol，2007， 5（4）：293-301.

[5] Lau PS，Leong KV，Ong CE，et al. In Vitro Functional Characterisation of Cytochrome P450（CYP）2C19 Allelic Var？鄄iants CYP2C19*23 and CYP2C19*24 [J]. Biochem Genet，2016，18：1-15.

[6] Collet JP，Hulot JS，Pena A，et al. Cytochrome P450 2C19 polymorphism in young patients treated with clopidogrel after myocardial infarction：a cohort study [J]. Lancet，2008， 373（9660）：309-317.

[7] 付良青，黃豐，吳德政，等.中國漢族人群不同性別細胞色素氧化酶CYP2C19基因多態(tài)性的比較[J].藥學(xué)學(xué)報，2004，39（3）：161-163.

[8] 翟萬慶，楊麗娟，宋麗艷，等.缺血性卒中氯吡格雷治療后病情進展與CYP2C19基因多態(tài)性的關(guān)系[J].山東醫(yī)藥，2016，56（33）：83-85.

[9] Sim SC，Risinger C，Dahl ML，et al. A common novel CYP 2C19 gene variant causes ultrarapid drug metabolism relevant for the drug response to proton pump inhibitors and antidepressants [J]. Clin Pharmacol Ther，2006，79（1）：103.

[10] Zou JJ，Xie HG，Chen SL，et al. Influence of CYP2C19 loss-of-function variants on the antiplatelet effects and cardiovascular events in clopidogrel-treated Chinese patients undergoing percutaneous coronary intervention [J]. Eur J Clin Pharmacol，2013，69（4）：771.

[11] Sibbing D，Stegherr J，Latz W，et al. Cytochrome P450 2C19 loss-of-function polymorphism and stent thrombosis following percutaneous coronary intervention [J]. Eur Heart J，2009，30（8）：916.

[12] 彭文星.急性冠脈綜合征患者氯吡格雷抵抗與基因多態(tài)性關(guān)聯(lián)性分析[D].北京：首都醫(yī)科大學(xué)，2016.

[13] 賈政軍，王華，彭向京，等.焦磷酸測序技術(shù)檢測LAMA5 rs944895基因多態(tài)性方法的建立[J].中國臨床藥理學(xué)與治療學(xué)，2011，16（6）：647-651.

[14] 李思勤，鄒秉杰，王建平，等.焦磷酸測序測定SNP的常見問題與解決方法[J].現(xiàn)代生物醫(yī)學(xué)進展，2014，14（12）：2219-2223.

[15] 萬子睿，謝海棠，郭棟，等.焦磷酸測序技術(shù)檢測SLCO 1B1基因多態(tài)性方法的建立[J].中國臨床藥理學(xué)與治療學(xué)，2012，17（5）：543-548.

[16] 王謙，杜亞梅，張國軍，等.焦磷酸測序法與Sanger測序法檢測CYP2C19*17基因多態(tài)性方法學(xué)對比研究[J].中國醫(yī)藥生物技術(shù)，2014，9（3）：222-224.

[17] 王謙，杜亞梅，張國軍，等.焦磷酸測序法和基因芯片法檢測CYP2C19基因多態(tài)性的方法學(xué)比較[J].中華檢驗醫(yī)學(xué)雜志，2014，37（8）：628-630.

[18] 項錚，劉云龍，邢曉清，等.全血改進線性指數(shù)聚合酶鏈?zhǔn)椒磻?yīng)用于焦磷酸測序檢測基因多態(tài)性[J].分析化學(xué)，2015，43（1）：55-62.

[19] 呂園，俞楊，張秀梅，等.南京及周邊地區(qū)冠心病患者CYP2C19基因多態(tài)性分析[J].標(biāo)記免疫分析與臨床，2016， 23（10）：1139-1143.

[20] 國榮，劉淼，王宇玫，等.北京地區(qū)漢族冠心病患者CYP2 C19基因多態(tài)性分析[J].醫(yī)學(xué)研究雜志，2015，44（11）：101-105.

[21] 王娟，蘇明權(quán)，楊柳，等.西北地區(qū)530例臨床患者CYP2 C19遺傳多態(tài)性分析[J].中華臨床醫(yī)師雜志：電子版，2012，6（22）：7395-7397.

（收稿日期：2017-07-02 本文編輯：程 銘）endprint