蒸三七皂苷類活性組分在大鼠體內(nèi)代謝產(chǎn)物鑒定的研究

申文雯　張銀　仇守蓓　朱粉霞　賈曉斌　湯道權(quán)　陳斌

[摘要]采用超高效液相色譜與串聯(lián)四極桿飛行時間質(zhì)譜儀聯(lián)用技術(shù)（UPLCQTOFMS/MS）分析大鼠灌胃蒸三七正丁醇部位后所得血液、尿液和糞便樣品，獲取正負離子模式下樣品中化學(xué)成分的分析數(shù)據(jù)。樣品數(shù)據(jù)經(jīng)PeakView軟件處理后，根據(jù)原型化合物的結(jié)構(gòu)特征以及體內(nèi)常見代謝方式的準確質(zhì)量數(shù)變化，對代謝產(chǎn)物進行解析。最終利用代謝物的MS/MS信息鑒定了蒸三七正丁醇部位中的4個皂苷代謝原型，即人參皂苷Rh4，Rk3，Rk1，Rg5及其15個代謝產(chǎn)物。蒸三七正丁醇部位中4個人參皂苷的代謝途徑包括葡萄糖醛酸化、脫糖、硫酸化、脫羥甲基化、支鏈丟失等。該文從定性角度對蒸三七主要活性皂苷類組分在體內(nèi)的代謝開展了研究，進一步闡明蒸三七在體內(nèi)發(fā)揮藥效的物質(zhì)基礎(chǔ)。

[關(guān)鍵詞]蒸三七正丁醇部位； 代謝產(chǎn)物鑒定； UPLCQTOFMS/MS； 人參皂苷Rh4，Rk3，Rk1，Rg5； 轉(zhuǎn)化方式

[Abstract]UPLCQTOFMS/MS was used to identify metabolites in rat blood， urine and feces after the administration of nbutanol extract derived from steamed notoginseng The metabolic process of saponins came from steamed notoginseng was analyzed The metabolites were processed by PeakView software， and identified according to the structural characteristics of prototype compounds and the accurate qualitative and quantitative changes of common metabolic pathways Four saponins metabolites were identified based on MS/MS information of metabolites， namely ginsenoside Rh4， Rk3， Rk1， Rg5，and their 15 metabolites were verified The metabolic pathways of the four ginsenosides in nbutanol extract included glucuronidation， desugar， sulfation， dehydromethylation， and branch loss The metabolites of main active saponin components derived from steamed Panax notoginseng were analyzed from the perspective of qualitative analysis And the material basis for the efficacy of steamed notoginseng was further clarified.

[Key words]nbutanol extract derived from Panax notoginseng； identification of metabolites； UPLCQTOFMS/MS； ginsenoside Rh4， Rk3， Rk1， Rg5； transformation mode

三七為五加科植物三七Panax notoginseng （Burk.）F.H.Chen的干燥根。蒸三七作為三七中的一種炮制品，應(yīng)用廣泛，具有滋養(yǎng)血液、增強免疫功能、抑制腫瘤、增強健壯性、促進組織再生等功效，古人樸素認識為“熟補”?，F(xiàn)代研究表明，三七炮制前后成分變化差異較大[1]。課題組前期研究發(fā)現(xiàn)，蒸三七中含有大量的不同于生三七的皂苷類化合物，各皂苷成分是其發(fā)揮補血功效的真正物質(zhì)基礎(chǔ)[2]，藥理試驗表明以人參皂苷Rg3，Rg6，F(xiàn)4，Rh4，Rk3，Rk1，Rg5等為代表的皂苷類化合物具有增強免疫功能、抑制腫瘤等多種生物活性[37]。對蒸三七主要活性皂苷組分在體內(nèi)過程的定性研究，有利于揭示蒸三七主要活性部位在體內(nèi)發(fā)揮藥效的物質(zhì)基礎(chǔ)及作用機制。蒸三七主要皂苷部位的提取，采用經(jīng)典皂苷提取方法，醇提后經(jīng)正丁醇萃取。經(jīng)文獻查閱，有關(guān)生三七的總?cè)藚⒃碥占案髦饕藚⒃碥諉误w如人參皂苷Rg1，Rb1等的體內(nèi)代謝產(chǎn)物鑒定研究較多，而有關(guān)于蒸三七的相關(guān)內(nèi)容尚未報道。

本研究通過收集灌胃給予蒸三七正丁醇部位后的大鼠血漿樣品、尿液和糞便樣品，利用UPLCQTOFMS/MS聯(lián)用技術(shù)，將QTOFMS/MS測定的準確質(zhì)量用于鑒定蒸三七正丁醇部位在大鼠體內(nèi)的代謝物，根據(jù)質(zhì)譜裂解規(guī)律，推測代謝物的化學(xué)結(jié)構(gòu)，總結(jié)代謝途徑，為探討蒸三七的體內(nèi)過程提供依據(jù)。

1材料

11儀器與試劑1260高效液相色譜儀（配有色譜泵，二級管陣列檢測器，美國Agilent公司）；Waters AcquityTM UHPLC超高效液相色譜質(zhì)譜聯(lián)用儀（美國Waters公司）；MilliQ水純化系統(tǒng)（美國Millipore公司）；Mettler Toledo分析天平（瑞士Mettler Toledo分析儀器有限公司）；AnkeTGL16G離心機（上海安亭科學(xué)儀器廠）。蒸三七正丁醇萃取部位（實驗室自制）；人參皂苷Rk1對照品（成都曼斯特生物科技有限公司中國科學(xué)院成都生物研究所，純度>9504%）；人參皂苷Rk3，Rh4，Rg5對照品（上海永恒生物科技有限公司，純度>98%）；甲醇、乙腈（色譜級，德國Merck公司）；水為超純水，其他試劑均為分析純。endprint

12動物SD大鼠，雌雄各半，體質(zhì)量（250±20） g，由江蘇省中醫(yī)藥研究院動物中心提供，實驗動物使用許可證號SYXK（蘇）20162017。

2方法

21藥材及樣品的制備三七為五加科植物三七的干燥根，來源于安徽亳州中藥飲片廠，并經(jīng)南京中醫(yī)藥大學(xué)黃一平研究員鑒定。蒸三七的正丁醇部位的制備：取適量的蒸三七粉末，加入10倍量的70%乙醇，攪拌均勻，于75 ℃水浴加熱回流提取3次，再抽濾，合并濾液，得粗提液，取所得粗提液，控溫50 ℃于旋轉(zhuǎn)蒸發(fā)儀濃縮至浸膏狀，再加少量水減壓濃縮至原體積的1/5。提取液回收乙醇后，用適量水混懸，正丁醇萃取3次，合并萃取液，揮去正丁醇，干燥備用。

22動物分組及給藥健康SD大鼠12只，按體質(zhì)量隨機分成2組，雌雄各半。試驗開始前各組動物自由飼養(yǎng)1周，然后置代謝籠中自由飼養(yǎng)適應(yīng)3 d。試驗采用單次灌胃給藥方式，給藥組大鼠按6 g·kg-1的劑量（相當于成人高劑量的40倍）給予配制好的蒸三七正丁醇部位1% CMCNa溶液；空白組給予等體積1% CMCNa灌胃。

23樣品采集與處理血漿樣品：于給藥前和給藥后05，1，2，4，6，8，12，24，36，48 h，由大鼠眼眶取血于預(yù)先涂有1%肝素鈉生理鹽水的EP管中，3 000 r·min-1離心10 min，取上清液，得到血漿樣品。于-80 ℃條件下保存?zhèn)溆谩７治銮皩⒀獫{樣品于37 ℃解凍，解凍后精密吸取血漿200 μL，加入3倍量的甲醇600 μL，渦旋1 min，13 000 r·min-1離心5 min，取600 μL上清液于EP管中，4 ℃條件下氮氣吹干，最后以甲醇150 μL復(fù)溶，渦旋30 s，13 000 r·min-1離心10 min，取上清液進樣檢測。

分別采集給藥前-12～0 h及給藥后0～12，12～24 h的尿液和糞便樣品，13 000 r·min-1離心10 min后，-80 ℃冷凍保存至上機檢測。分析前將尿液樣品于37 ℃解凍，解凍后分別取大鼠各時間段尿液2 mL，加3倍量甲醇，渦旋混勻3 min。13 000 r·min-1離心5 min后取上清液，氮氣吹干，殘渣加1 mL甲醇溶解，13 000 r·min-1離心10 min后取上清液，進樣分析。

將各時間段大鼠糞便混合，烘箱50 ℃烘干備用。分析前將糞便樣品用研缽研碎，稱取2 g，加10倍量甲醇浸泡并超聲30 min，13 000 r·min-1離心10 min后取上清液，氮氣吹干，殘渣加2 mL甲醇溶解，13 000 r·min-1離心15 min后取上清液，進樣分析。

24色譜條件流動相A為01%甲酸水，B為乙腈溶液。樣品的洗脫條件：0～25 min，20%～28% B；25～3 min，28%～36% B；3～55 min，36%～43% B；55～95 min，43%～50% B；95～10 min，50%～64% B；10～135 min，64%～100% B；135～145 min，100%～20% B。柱溫40 ℃，流速04 mL·min-1，進樣量2 μL。

25質(zhì)譜條件采用TOF MSIDAMS/MS 模式，電噴霧離子源（ESI），采用正負離子模式掃描，掃描范圍m/z 50～1 500。正負離子檢測方式：氣簾氣（CUR）40 psi（1 psi=6895 kpa），霧化氣（GS1）55 psi，輔助氣（GS2）55 psi，電噴霧電壓（ISVF）4 500 eV，離子源溫度（TEM）550 ℃，去簇電壓（DP）±100 eV；TOF MS 模式下設(shè)置碰撞電壓±10 eV，IDAMS/MS條件下設(shè)置碰撞電壓±40 eV，碰撞電壓差20 eV。

3結(jié)果

31人參皂苷原型成分的結(jié)構(gòu)鑒定前期研究已明確蒸三七正丁醇部位中的主要成分為皂苷，因此本試驗將蒸三七中各人參皂苷作為提取對象進行分析。母體化合物及其代謝物在負模式下表現(xiàn)為其準分子離子[M-H]-或[M+HCOO]-，并通過MS和MS/MS碎裂行為和保留時間來研究確定其結(jié)構(gòu)。根據(jù)可能的代謝途徑及代謝產(chǎn)物的總結(jié)分析，推斷出多數(shù)相關(guān)代謝物的結(jié)構(gòu)。通過網(wǎng)絡(luò)數(shù)據(jù)庫或文獻檢索，如PubMed，SciFinder，CNKI等，利用Analyst TF 16軟件的PeakView和Formulafinder等數(shù)據(jù)處理功能，經(jīng)過峰提取和解析，并與對照品進行比對，在大鼠血漿、尿液及糞便中有4種個人參皂苷被初步鑒定出來，分別是人參皂苷Rk3，Rh4，Rk1，Rg5，其化學(xué)結(jié)構(gòu)見圖1。

人參皂苷Rk1 R1=glc（21）glc人參皂苷Rg5 R1=glc（21）glc

R2=HR2=H

人參皂苷Rk3 R1=H人參皂苷Rh4R1=H

R2=OglcR2=Oglc

3，Rh4，Rk1，Rg5

蒸三七中的主要有效成分各人參皂苷具有相同母核，即達瑪烷型三萜，因此它們質(zhì)譜信息很相似，在相同質(zhì)譜條件下存在類似裂解規(guī)律，可能出現(xiàn)相似的碎片離子。如m/z 504這個碎片離子均出現(xiàn)在4種人參皂苷的主要碎片離子中，因各皂苷成分均脫去1分子葡萄糖所致。以人參皂苷Rg5的鑒定為例，其提取相對分子質(zhì)量為766488 5，二級質(zhì)譜提供的主要碎片離子m/z 613332 9，589333 8，571288 6，161049 6根據(jù)人參皂苷元素組成、相關(guān)裂解規(guī)律[910]和數(shù)據(jù)庫在線比對，推測其分子式為C42H70O12，從而進一步推斷該成分為人參皂苷Rk1或Rg5。采用上述相同方法一一解析鑒定并與對照品進行比對，最終確定4種人參皂苷，分別為人參皂苷Rk3，Rh4 ，Rk1，Rg5，見表1。

32 代謝產(chǎn)物的解析代謝物和母體藥物一般都有類似的核心結(jié)構(gòu)，根據(jù)核心結(jié)構(gòu)的性質(zhì)和一般代謝物的生物轉(zhuǎn)化方法，預(yù)先收集整理了各人參皂苷可能代謝物的相關(guān)信息。各人參皂苷在體內(nèi)主要發(fā)生的代謝轉(zhuǎn)化有：葡萄糖醛酸化，脫糖，硫酸化，脫羥甲基化，支鏈丟失等。通過MarkerView軟件，經(jīng)過峰提取及相關(guān)處理后，使用PeakView中提取離子流色譜 （extract ion chromatogram，XIC）等功能，篩選精確的分子質(zhì)量和碎片離子質(zhì)量可較為容易地預(yù)測代謝產(chǎn)物的元素組成。最后，在準確相對分子質(zhì)量、相關(guān)的藥物的生物轉(zhuǎn)化知識以及母體藥物的碎片裂解模式的基礎(chǔ)上，鑒定代謝物結(jié)構(gòu)。endprint

人參皂苷Rk3，Rh4 ，Rk1，Rg5的結(jié)構(gòu)中取代基主要是甲基、糖基或者羥基，所以甲基、糖基和羥基的損失是其主要的碰撞誘導(dǎo)解離途徑，另還可能存在葡萄糖醛酸化及硫酸化反應(yīng)。綜合相關(guān)文獻調(diào)研及前期斑馬魚代謝研究結(jié)果，將可能的代謝產(chǎn)物斷裂方式及代謝途徑列出后分析比對，見圖2～5。在大鼠血漿、尿液和糞便樣本中最終確定了15個可能的代謝產(chǎn)物，主要的11個代謝產(chǎn)物相關(guān)信息見表2。

來自母體化合物Rk3的葡萄糖醛酸化綴合176，產(chǎn)生m/z 841591 9（M1）的甲酸締合分子離子和其m/z 449293 5的產(chǎn)物離子。綜上可認為M1是由于C3位葡萄糖醛酸化而產(chǎn)生的人參皂苷Rk3的葡萄糖醛酸化產(chǎn)物。根據(jù)人參皂苷Rk3的結(jié)構(gòu)，M1為人參皂苷Rk33O葡萄糖醛酸鹽。

NotR/min相對分子質(zhì)量誤差/×10-6m/z來源分子式名稱

M1605841591 938449293 5糞便，血漿C42H68O14人參皂苷Rk33O葡萄糖醛酸鹽

M21126679181 738571253 3，303136 6糞便C36H58O9脫水Δ20，21原人參三醇3O葡萄糖醛酸鹽

M31130645468 828599351 1糞便，尿液C32H54O11S23脫2甲基丙烯基人參皂苷Rk33O硫酸酯

M41270457239 9-22303233 9糞便，血漿C30H50O3脫水Δ20，21原人參三醇

M51221987708 315464312 7糞便，血漿和尿液C48H78O18人參皂苷Rk112O葡萄糖醛酸鹽

M61168825615 625433294 9糞便，尿液C42H68O13人參皂苷Rk212O葡萄糖醛酸鹽

M7450957502 3-32436230 6，157221 4糞便，血漿C47H76O175″脫羥甲基人參皂苷Rk112O葡萄糖醛酸鹽

M81148683420 036615230 1，479293 3糞便，血漿和尿液C36H60O10S人參皂苷Rk212O硫酸鹽

M9432559380 3-30297244 3糞便，尿液C28H48O9S2′脫羥基，17脫1，5二甲基1，4己二烯基人參皂苷Rh312O硫酸鹽

M101080717451 5030671443 4，509385 4糞便，血漿C34H56O1317脫1，5二甲基1，4己二烯基人參皂苷Rh312O葡萄糖醛酸鹽

M111267701206 4-43641205 2，180902 4糞便，血漿和尿液C34H56O122′脫羥基，17脫1，5二甲基1，4己二烯基人參皂苷Rh312O葡萄糖醛酸鹽

m/z 679181 7（M2）的甲酸締合分子離子和其m/z 517253 3，303136 6的產(chǎn)物離子比m/z 841591 9（M1）的甲酸締合分子離子，在m/z 449293 5處的產(chǎn)物離子小162。因此，M2被鑒定為M1失去1分子葡萄糖的產(chǎn)物，并且葡萄糖的損失位置被認為在C6位。根據(jù)M1的結(jié)構(gòu)，M2為脫水Δ20，21原人參三醇3O葡萄糖醛酸鹽。

在m/z 645468 8（M3）處的分子離子和其在m/z 599351 1處的產(chǎn)物離子，比人參皂苷Rk3在m/z 665431 8處甲酸締合的分子離子多26。因此，M3被鑒定為人參皂苷Rk3丟失2甲基丙烯基和硫酸化的產(chǎn)物，硫酸化和丟失2甲基丙烯基的位置分別被認為是在C3位和C23位。根據(jù)人參皂苷Rk3的結(jié)構(gòu)，M3為23脫2甲基丙烯基人參皂苷Rk33O硫酸鹽。

通過162的中性損失產(chǎn)生對應(yīng)于來自母體人參皂苷Rh4的葡萄糖損失的M4，其分子離子為m/z 457239 9，其產(chǎn)物離子在m/z 303233 9處。綜上可認為M4是由于C6位處的葡萄糖損失，即人參皂苷Rh4失去1分子葡萄糖所得產(chǎn)物。根據(jù)人參皂苷Rh4的結(jié)構(gòu)，M4為脫水Δ20，21原人參三醇。

M5來自母體化合物Rk1的葡萄糖醛酸化，人參皂苷Rk1通過176的葡萄糖醛酸化綴合產(chǎn)生m/z 987708 3（M5）處甲酸締合的分子離子。因此，M5被認為是由于在C12位的葡萄糖醛酸化而引起的人參皂苷Rk1的葡糖醛酸化產(chǎn)物。根據(jù)人參皂苷Rk1的結(jié)構(gòu)，M5為人參皂苷Rk112O葡萄糖醛酸鹽。

在m/z 825615 6（M6）處甲酸締合的分子離子和其在m/z 433294 9的產(chǎn)物離子比m/z 987708 3（M5）處甲酸締合的分子離子小162，M5的產(chǎn)物離子在m/z 464312 7。因此M6被鑒定為M5脫1分子葡萄糖產(chǎn)物，并且其葡萄糖損失位置被認為是在C1″位。根據(jù)M5的結(jié)構(gòu)，M6為人參皂苷Rk212O葡萄糖醛酸鹽。

m/z 957502 3（M7）的甲酸締合的分子離子及其在m/z 436230 6，157221 4的產(chǎn)物離子比m/z 987708 3（M5）處甲酸締合的分子離子小30，其產(chǎn)物離子在m/z 464312 7處。因此，M7被鑒定為M5失去1分子羥甲基產(chǎn)物，羥甲基損失位置被認為是在葡萄糖的C5′位。根據(jù)M5的結(jié)構(gòu)，M7為5″脫羥甲基人參皂苷Rk112O葡萄糖醛酸鹽。

m/z 683420 0（M8）的分子離子和m/z 615230 1，479293 3的產(chǎn)物離子比人參皂苷Rk2的分子離子多80。因此，M8被鑒定為人參皂苷Rk2的硫酸化產(chǎn)物，硫酸化位置被認為是在C12位。根據(jù)人參皂苷Rk2的結(jié)構(gòu)，M8為人參皂苷Rk212O硫酸鹽。

加入206，產(chǎn)生M9的分子離子m/z 559380 3，對應(yīng)于母體化合物人參皂苷Rg5的脫糖，硫酸化，去1，5二甲基1，4己二烯基，脫羥基化反應(yīng)。結(jié)果表明，母體化合物的離子首先在C3位置處脫糖，隨后人參皂苷Rh3的離子硫酸化，脫1，5二甲基1，4己二烯基支鏈，脫羥基。因此，M9被認為是人參皂苷Rh3的硫酸化，失去1，5二甲基1，4己二烯基支鏈的脫羥基產(chǎn)物。硫酸化，脫1，5二甲基1，4己二烯基和脫羥基化的位置分別是C12，C17和葡萄糖的C2′位。根據(jù)人參皂苷Rh3的結(jié)構(gòu)，M9為2′脫羥基，17脫1，5二甲基1，4己二烯基人參皂苷Rh312O硫酸鹽。endprint

在m/z 717451 5（M10）處甲酸締合的分子離子和m/z 671443 4，509385 4處的產(chǎn)物離子比母體化合物Rg5 m/z 766488 5處甲酸締合的分子離子少95。因此，M10被鑒定為人參皂苷Rg5在C17位失去1，5二甲基1，4己二烯基，C12位置處葡萄糖醛酸化和葡萄糖C1″位置處葡萄糖損失的產(chǎn)物，M10為17脫1，5二甲基1，4己二烯基人參皂苷Rh312O葡萄糖醛酸鹽。

在m/z 701206 4（M11）處甲酸締合的分子離子和m/z 641205 2，180908 4處的產(chǎn)物離子比m/z 717451 5（M10）處甲酸締合的分子離子小16，其產(chǎn)物離子在m/z 671443 4，509385 4處。因此，M11被鑒定為M10的脫羥基產(chǎn)物，并且脫羥基位置被認為是在葡萄糖的C2′位。根據(jù)M10的結(jié)構(gòu)，M11為2′脫羥基，17脫1，5二甲基1，4己二烯基人參皂苷Rh312O葡萄糖醛酸鹽。

4討論

本研究利用UPLCQTOFMS/MS技術(shù)發(fā)現(xiàn)了蒸三七正丁醇部位中的4種人參皂苷Rk3，Rh4，Rk1，Rg5和其在大鼠體內(nèi)的11個主要的代謝產(chǎn)物，并根據(jù)MS/MS準確質(zhì)量信息對代謝物的結(jié)構(gòu)進行了初步鑒定。結(jié)果表明，蒸三七正丁醇部位中4種人參皂苷的代謝途徑包括葡萄糖醛酸化、脫糖、硫酸化、脫羥甲基化、支鏈丟失等。其中，葡萄糖醛酸化的產(chǎn)物有M1，M2，M5，M6，M7，M10；脫糖反應(yīng)的產(chǎn)物有M2，M4，M6，M7，M9，M10；硫酸化的產(chǎn)物有M3，M8，M9；脫羥甲基化的產(chǎn)物有M9，M11；支鏈丟失的產(chǎn)物有M3，M9，M10。因11個代謝產(chǎn)物均存在于糞便中，故糞便中各人參皂苷的主要代謝產(chǎn)物均發(fā)生了上述代謝轉(zhuǎn)化；血中人參皂苷的代謝轉(zhuǎn)化以Ⅰ相代謝的脫糖反應(yīng)為主；尿中人參皂苷的代謝轉(zhuǎn)化以Ⅱ相代謝的葡萄酸醛酸化及硫酸化為主。

本文僅考慮蒸三七活性部位在體內(nèi)的藥動學(xué)及代謝產(chǎn)物的鑒定分析，有關(guān)蒸三七醇提物（更能代表蒸三七）的體內(nèi)代謝狀況，可展開后續(xù)研究，有利于更深刻的認識蒸三七中外源性物質(zhì)在體內(nèi)的代謝狀況及可能的轉(zhuǎn)化途徑。該研究對蒸三七主要活性皂苷類組分即人參皂苷Rk3，Rh4，Rk1，Rg5在體內(nèi)的代謝，從定性角度得到闡釋，進一步明確蒸三七在體內(nèi)發(fā)揮藥效的物質(zhì)基礎(chǔ)，亦為蒸三七的臨床應(yīng)用提供了參考。

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[責(zé)任編輯張燕]endprint