款冬葉柄愈傷組織培養(yǎng)與再生體系建立

任繼文　雷穎　李曉玲

[摘要]以款冬幼嫩葉柄為材料，研究植物生長(zhǎng)調(diào)節(jié)劑對(duì)其離休培養(yǎng)與植株再生的影響，建立了款冬離體快繁技術(shù)體系。結(jié)果表明：款冬葉柄切段較理想的滅菌方法為75%乙醇浸泡30 s，轉(zhuǎn)入飽和漂白粉上清液浸泡15 min；適合愈傷誘導(dǎo)的培養(yǎng)基為MS+6BA 30 mg·L-1+2，4D 20 mg·L-1，誘導(dǎo)率962%；在培養(yǎng)基MS+ZT 20 mg·L-1+NAA 03 mg·L-1上芽苗分化效果較好，分化率91%，平均芽數(shù)826個(gè)；較佳的不定芽增殖培養(yǎng)基為MS+KT 10 mg·L-1+IBA 03 mg·L-1，增殖倍數(shù)為1181，平均苗高49 cm；生根培養(yǎng)基為1/2MS+IBA 02 mg·L-1，生根數(shù)平均為568條，生根率為9522%以上；瓶苗移栽于河沙有機(jī)肥 3∶1的基質(zhì)中生長(zhǎng)良好，成活率達(dá)90%以上；大田試驗(yàn)表明：同等栽培條件下款冬組培株、栽培株和野生株在生長(zhǎng)量與花粒產(chǎn)量等方面存在顯著差異，以組培株生長(zhǎng)量與花粒產(chǎn)量相對(duì)較高。組培品與野生品有效成分含量基本一致。

[關(guān)鍵詞]款冬； 幼嫩葉柄； 愈傷組織誘導(dǎo)； 植株再生； 生長(zhǎng)量； 有效成分測(cè)定

[Abstract]Young petiole of Tussilago farfara was used as the material to investigate the plant growth regulators which could influence in vitro culture and plant regeneration and to establish rapid propagation technique The ideal sterilization method was that young petiole of T farfara was sterilized with 75% ethanol for 30 s， and then transferred to saturated bleaching power supernatant for 15 min The suitable medium for callus induction was MS+6BA 30 mg·L-1+2，4D 20 mg·L-1 with 962% induction rate The seedlings had better differentiation with 91% differentiation rate and 826 buds on the medium containing MS+ZT 20 mg·L-1+NAA 03 mg·L-1 The preferred enrichment medium of adventitious bud was MS+KT 10 mg·L-1+IBA 03 mg·L-1with 1181 enrichment times and 49 cm seedling height The rooting medium included 1/2MS+IBA 02 mg·L-1 with the average number of rooting was 586 and the rooting rate was above 9522% The container seedlings can grow well and the survival rate was more than 90% when they were transplanted on the medium added with river sand and organic fertilizer with the ratio of 3∶1. The field experiments indicated that significant differences in increment and yield of pollen grains among the tissueculture， cultivation and wild type of T farfara under the same cultivation conditions The cultivated plants were relatively high on the increment and yield of pollen grainsThe active ingredient contnet of the tissue culture and the wild materials was basically the same.

[Key words]Tussilago farfara； young petiole； callus induction； plant regeneration； measure； active ingredients

款冬Tussilago farfara Linn，又名款冬花，冬花，多年生草本，為菊科款冬花屬植物[1]，其干燥花蕾，是我國(guó)傳統(tǒng)的中藥材，性味辛溫，歸肺經(jīng)，具化痰止咳，潤(rùn)肺下氣之功效，主治咳嗽、氣喘、咳吐痰血等癥[2]。亦可作為地被植物，用于花壇綠化[3]。隨著在中成藥，中藥配方中應(yīng)用的擴(kuò)大，其需求量不斷增大，目前商品款冬花以人工栽培為主，采用根莖無(wú)性繁殖，但品質(zhì)逐年下降，而野生種質(zhì)是豐產(chǎn)、優(yōu)質(zhì)、抗耐性品質(zhì)的重要來(lái)源，但由于人為和自然等因素，野生資源逐漸減少，因此，促進(jìn)中藥產(chǎn)業(yè)的可持續(xù)發(fā)展，實(shí)施款冬花資源的保護(hù)和快速繁殖，已刻不容緩。對(duì)款冬花組織培養(yǎng)與快速繁殖的試驗(yàn)研究，目前還未報(bào)道見(jiàn)。本文利用野生款冬葉柄為材料，進(jìn)行組織培養(yǎng)試驗(yàn)研究，以期獲得高效再生體系的建立。

1材料

培養(yǎng)材料采自甘肅小隴山林區(qū)。初夏，采摘款冬當(dāng)年生幼葉，用清水沖去表面灰塵后備用。endprint

2方法

21無(wú)菌材料的獲得

款冬葉片上表面被蛛絲狀毛，下表面及葉柄被白色氈毛，滅菌較為困難，因此在消毒液的各處理中加入2滴聚氧乙烯脫水山梨醇單油酸酯（吐溫80）[4]以加速消毒劑的浸潤(rùn)效果。本次試驗(yàn)采用2因素3水平完全隨機(jī)試驗(yàn)設(shè)計(jì)[5]，設(shè)置75%乙醇處理30 s，01%HgCl（60，180，300 s），漂白粉上清液（600，900，1 200 s），共12個(gè)處理，每處理10瓶培養(yǎng)基，每瓶接1塊外植體，重復(fù)3次。接種2周后檢查污染率與褐變率。

22培養(yǎng)條件

培養(yǎng)基中加入3%的蔗糖，生根培養(yǎng)時(shí)加2%[6]，瓊脂6 g·L-1，pH 58，愈傷誘導(dǎo)階段pH 56[7]；培養(yǎng)溫度為（22±2） ℃，光周期12 h/12 h （光/暗），生根培養(yǎng)時(shí)16 h/8 h （光/暗）；光照強(qiáng)度：愈傷誘導(dǎo)時(shí)約20 μmol·m-2·s-1 [8]，其他各階段為50 μmol·m-2·s-1。

23愈傷組織培養(yǎng)

消毒滅菌所得的材料置于鋪有無(wú)菌濾紙的接種盤(pán)中，切去兩頭褐化部分，將剩余部分切割成05～10 cm的小段[9]，接種到愈傷誘導(dǎo)培養(yǎng)基中，愈傷組織誘導(dǎo)以MS為基本培養(yǎng)基，采用6BA與2，4D的2因素3水平隨機(jī)設(shè)計(jì)，共9個(gè)處理，每個(gè)處理10瓶，每瓶接種1個(gè)外植體，重復(fù)3次。弱光下培養(yǎng) 40 d后觀察。愈傷組織誘導(dǎo)率=形成愈傷組織的外植體數(shù)/接種后未被污染的外植體數(shù)×100%，接種后7 d記錄生長(zhǎng)情況[10]。

24不定芽分化培養(yǎng)

將外植體培養(yǎng)40 d后產(chǎn)生的優(yōu)質(zhì)愈傷組織塊轉(zhuǎn)接到不定芽分化培養(yǎng)基上。分化培養(yǎng)以MS為基本培養(yǎng)基，加入不同濃度的ZT與NAA，共9個(gè)處理，每個(gè)處理10瓶，每瓶接種1塊愈傷組織，重復(fù)3次。培養(yǎng)40 d后觀察并統(tǒng)計(jì)分化率和平均芽數(shù)，不定芽分化率=萌芽的愈傷組織塊/接種的愈傷組織塊×100%； 平均芽數(shù)=萌芽總數(shù)/接種塊數(shù)。

25嫩莖的增殖培養(yǎng)

將分化培養(yǎng)所得的簇生芽切下，較長(zhǎng)嫩莖切成10cm左右的小段，轉(zhuǎn)入增殖培養(yǎng)基上培養(yǎng)。增殖培養(yǎng)以MS為基本培養(yǎng)基，添加不同濃度的KT與IBA，共9個(gè)處理，每個(gè)處理10瓶，每瓶接種3塊幼莖，重復(fù)3次。培養(yǎng)40 d后觀察并統(tǒng)計(jì)增殖倍數(shù)與平均苗高，增殖倍數(shù)=培養(yǎng)增長(zhǎng)節(jié)位數(shù)（或芽苗數(shù)）/接種時(shí)節(jié)位數(shù)（或芽苗數(shù)）； 平均苗高=苗高總和/總苗數(shù)。

26試管苗生根

當(dāng)不定芽長(zhǎng)到2～3 cm時(shí)，切下芽苗轉(zhuǎn)接到生根培養(yǎng)基上培養(yǎng)。生根培養(yǎng)以1/2MS為基本培養(yǎng)基，添加不同濃度的IBA和IAA，共6個(gè)處理，每個(gè)處理10瓶，每瓶接3～5條嫩莖，重復(fù)3次。培養(yǎng)30 d后觀察并統(tǒng)計(jì)生根率與平均根數(shù)，生根率=生根莖段數(shù)/接種莖段數(shù)×100%； 平均根數(shù)=每處理生根總數(shù)/誘導(dǎo)生根的總苗數(shù)。

27移栽

將生根的瓶苗不開(kāi)蓋在煉苗室放置2～3 d，然后打開(kāi)蓋再放置2～3 d，取出苗，洗凈根部培養(yǎng)基，移栽到河沙有機(jī)肥 3∶1的基質(zhì)中，保持環(huán)境溫度在20 ℃左右，相對(duì)濕度90%～100%，適當(dāng)遮蔭，每天下午通風(fēng)，逐漸增加光照。計(jì)算移栽成活率=移栽成活數(shù)/總移栽數(shù)×100%。

28生長(zhǎng)量測(cè)定

4月初，選擇相同立地條件的試驗(yàn)地塊，設(shè)置9個(gè)區(qū)組，每組5個(gè)小區(qū)，分別將同等大小的組培苗、栽培苗及野生苗移栽與試驗(yàn)小區(qū)內(nèi)，每區(qū)組1個(gè)類(lèi)型，重復(fù)3次。11月中旬統(tǒng)計(jì)測(cè)算各類(lèi)型的生長(zhǎng)量及花芽產(chǎn)量。各類(lèi)型隨機(jī)抽取10個(gè)樣地，各樣地面積1 m2，測(cè)算材料包括10個(gè)樣地款冬的總株數(shù)。

29有效成分測(cè)定

291定性測(cè)定取組培和野生款冬花樣品適量，粉碎（過(guò)20目篩）、60 ℃干燥到恒重，分別精密稱(chēng)取各樣品1 g，用甲醇提取，濃縮后作為樣品液。另取蘆丁對(duì)照品，甲醇溶解為1 g·L-1溶液，作為對(duì)照品液。將樣品液、對(duì)照品液點(diǎn)于同一硅膠G薄層板上，分別以醋酸乙酯甲酸水（10∶3∶3）和醋酸乙醋甲酸水（30∶1∶1）為展開(kāi)劑，進(jìn)行顯色試驗(yàn)。

292定量測(cè)定采用美國(guó)TSP公司高效液相色譜儀，KeystoneODS色譜柱（46 mm×250 mm），預(yù)柱（15 mm），流動(dòng)相甲醇03%磷酸水溶液（50∶50），流速1 mL·min-1，柱溫為室溫，檢測(cè)波長(zhǎng)360 nm，靈敏度002 AUFS。

在對(duì)照品溶液測(cè)定的蘆丁峰面積與進(jìn)樣量有良好的線(xiàn)性關(guān)系，且精密度、重復(fù)性、回收率試驗(yàn)均符合要求的前提下，對(duì)組培品和野生品進(jìn)行測(cè)試。

稱(chēng)取組培和野生款冬樣品各1 g，分別置于100 mL圓底燒瓶中，加適量甲醇回流4 h，過(guò)濾，回收溶劑至干，再加甲醇鹽酸（4∶1）25 mL，回流30 min，過(guò)濾，濾液定容至50 mL，微孔濾膜過(guò)濾，得供試品溶液。分別精密吸取供試品液和對(duì)照品溶液（002 g·L-1）各20 μL，注人色譜儀測(cè)定，以外標(biāo)法計(jì)算含量。

3結(jié)果

31不同消毒劑對(duì)外植體滅菌的影響

在超凈工作臺(tái)上將清水沖洗過(guò)的幼葉剪去葉片，葉柄剪成2～3 cm小段，放入各處理的消毒瓶中，按設(shè)計(jì)方案（表1）進(jìn)行消毒滅菌后，接種于相應(yīng)的培養(yǎng)基中，01%升汞和飽和漂白粉上清液的各處理單獨(dú)使用時(shí)污染率都相對(duì)較高，與75%乙醇配合使用時(shí)效果明顯提高，各處理在P<001水平上差異顯著，75%乙醇+01%升汞各處理污染率明顯小于75%乙醇+飽和漂白粉上清液，但褐變率卻明顯高于后者，綜合分析本輪試驗(yàn)結(jié)果，75%乙醇30 s+飽和漂白粉上清液900 s是款冬葉柄外植體較理想的消毒試驗(yàn)組合。

32不同植物生長(zhǎng)調(diào)節(jié)劑組合對(duì)愈傷組織誘導(dǎo)的影響

選擇滅菌試驗(yàn)中所得的無(wú)菌材料轉(zhuǎn)接到愈傷誘導(dǎo)培養(yǎng)基中，1周后葉柄切段肥大，下端切口處有澎大的愈傷現(xiàn)象（圖1A），40 d后觀察，各處理愈傷組織塊明顯增大，但不勻一，部分愈傷塊淡黃綠色、較致密、且表面有小疣突。 6BA和2，4D對(duì)愈傷組織誘導(dǎo)的效果顯著，誘導(dǎo)率及平均直徑隨6BA和2，4D濃度的升高而增大，但當(dāng)兩者質(zhì)量濃度分別大于30和20 mg·L-1時(shí)，誘導(dǎo)率下降，愈傷組織松散透明，失去了不定芽分化的能力（表2）。綜合分endprint

析表明，MS+2，4D 20 mg·L-1+6BA 30 mg·L-1是較為理想的愈傷組織誘導(dǎo)培養(yǎng)基，誘導(dǎo)率為962%，愈傷組織塊大、致密，表面有小疣突，有較好的不定芽分化能力（圖1B）。

A培養(yǎng)2周的外植體； B培養(yǎng)40 d的愈傷組織塊；C不定芽分化20 d；D不定芽分化40 d；E繼代培養(yǎng)40 d； F生根培養(yǎng)30 d；G培養(yǎng)30 d的根形態(tài)； H煉苗第5天；I移栽成活的試管苗。

33不同植物生長(zhǎng)調(diào)節(jié)劑組合對(duì)不定芽分化的影響

將淡黃綠色較致密的愈傷組織轉(zhuǎn)接于分化培養(yǎng)

基上，20 d后有少量不定芽產(chǎn)生（圖1C），40 d長(zhǎng)出密集的綠色不定芽（圖1D）。ZT和NAA對(duì)芽苗分化有顯著影響，在不同植物生長(zhǎng)調(diào)節(jié)劑組合中，以添加ZT 20 mg·L-1，NAA 03 mg·L-1的MS培養(yǎng)基較適合不定芽的分化，分化率為91%，平均芽數(shù)826個(gè)，芽苗生長(zhǎng)健壯（表3）。

34不同植物生長(zhǎng)調(diào)節(jié)劑組合對(duì)嫩莖增殖的影響

KT與IBA對(duì)芽苗增殖的影響顯著，增殖倍數(shù)隨其濃度的升高而增加，但當(dāng)KT和IBA質(zhì)量濃度分別大于10，03 mg·L-1時(shí)，增殖倍數(shù)下降，且產(chǎn)生一定數(shù)目的玻璃苗，基部有較多愈傷組織（表4）。因此，綜合考慮以上試驗(yàn)結(jié)果，款冬芽苗增殖培養(yǎng)較適宜的培養(yǎng)基為MS+KT 10 mg·L-1+IBA 03 mg·L-1，芽苗生長(zhǎng)健壯，葉色深綠，增殖倍數(shù)為1181左右，平均苗高490 cm左右（圖1E）。

35試管苗生根與移栽

叢生芽苗增殖培養(yǎng)幾代后，轉(zhuǎn)入生根培養(yǎng)基中培養(yǎng)，30 d后的培養(yǎng)結(jié)果顯示： IBA和IAA對(duì)芽苗生根都有影響，IBA的影響﹥IAA，其中，在添加02 mg·L-1 IBA的1/2 MS培養(yǎng)基上，生根率為952%，平均生根數(shù)568條左右（圖1F，G，H），明顯高于其他各處理（表5）。將生根的試管苗移栽至河沙+有機(jī)肥3∶1的基質(zhì)中，并保持溫室溫度25 ℃，相對(duì)濕度80%有利于款冬試管苗的移栽的成活[11]，20 d后成活率達(dá)90%（圖1I）。

36生長(zhǎng)量與產(chǎn)量測(cè)算

4月初，將同等大小的組培苗、栽培苗及野生苗移栽與相同立地條件的試驗(yàn)地內(nèi)，保持養(yǎng)護(hù)管理技術(shù)一致，11月中旬統(tǒng)計(jì)測(cè)算生長(zhǎng)量與花粒產(chǎn)量[1213]，。結(jié)果表明：3種類(lèi)型在全株鮮重、單株花粒數(shù)、單株花重及小區(qū)平均產(chǎn)量等方面都存在顯著差異，其中以組培苗的各種指標(biāo)都遠(yuǎn)遠(yuǎn)超出了其他2種類(lèi)型（表6）。

37組培品與野生品有效成分

試驗(yàn)結(jié)果顯示：組培樣品液與對(duì)照品液在同一硅膠G薄層板上分別用29展開(kāi)劑展開(kāi)后，用氨水熏，均顯黃色斑點(diǎn)，證明組培品和野生品中均含蘆丁及懈皮素。分別精密吸取各樣品液及對(duì)照品液進(jìn)行色譜測(cè)定，計(jì)算結(jié)果顯示：組培和野生款冬花中蘆丁質(zhì)量分?jǐn)?shù)分別為023%，025%。

4討論

款冬葉柄被白色氈毛，滅菌較為困難，滅菌時(shí)可在消毒劑的各處理中加入2滴吐溫80以加速消毒劑的浸潤(rùn)效果。75%的乙醇一直是較好的植物材料滅菌劑，但單獨(dú)使用時(shí)效果并不理想，因此，本次試驗(yàn)采用了75%的乙醇處理30 s后與01% HgCl、飽和漂白粉上清液的不同處理配合，取得了良好的滅菌效果，其中75%乙醇30 s+飽和漂白粉上清液900 s是款冬葉柄較好的消毒試驗(yàn)組合，75%乙醇30 s與01%HgCl配比的各組合，雖然污染率都相對(duì)較低，但褐變率都相對(duì)較高，試驗(yàn)表明：漂白粉上清液對(duì)款冬外植體材料消毒效果較好，較長(zhǎng)時(shí)間浸泡時(shí)造成的傷害也較小。

激素種類(lèi)和濃度對(duì)款冬葉柄愈傷組織誘導(dǎo)與植株再生具有重要作用，細(xì)胞分裂素6BA與生長(zhǎng)素2，4D對(duì)愈傷組織的誘導(dǎo)具有顯著影響，但6BA明顯﹥2，4D；植株再生的關(guān)鍵在于愈傷組織是否能分化出不定芽，本試驗(yàn)采用了具有較強(qiáng)活性的細(xì)胞分裂素ZT有效促進(jìn)了不定芽的分化。

增殖培養(yǎng)階段，KT與IBA對(duì)芽苗的增殖都有較顯著的影響，但KT明顯﹥IBA，且當(dāng)濃度較高時(shí)會(huì)出現(xiàn)玻璃化[14]。IBA較高時(shí)基部會(huì)出現(xiàn)愈傷組織。

生根過(guò)程中，款冬莖段基部較易形成愈傷組織，不利于新根產(chǎn)生也影響移栽成活率，可適當(dāng)增加光照和降低培養(yǎng)溫度以減少愈傷組織的形成[8]。同時(shí)，培養(yǎng)基中營(yíng)養(yǎng)元素濃度較高時(shí)，試管苗產(chǎn)生依賴(lài)性而不易生根[15]，降低培養(yǎng)基中的糖濃度，可促進(jìn)根原基的形成[16]，試驗(yàn)中發(fā)現(xiàn)采用1/2MS+IBA 02 mg·L-1+蔗糖20 g·L-1，生根率可達(dá)952%，且生長(zhǎng)健壯。采用河沙+有機(jī)肥3∶1基質(zhì)，可提高試管苗的移栽成活率。

大田栽培試驗(yàn)階段，組培株在全株鮮重、單株花粒數(shù)、單株花重及小區(qū)平均產(chǎn)量等方面都遠(yuǎn)遠(yuǎn)超過(guò)了栽培株與野生株，并且組內(nèi)標(biāo)準(zhǔn)差較小，生長(zhǎng)整齊，雖然與栽培株在平均粒重上差異不顯著，但由于培養(yǎng)過(guò)程中激素的使用而增強(qiáng)了花芽分化，花粒數(shù)的顯著提高以致使產(chǎn)量提高顯著。

測(cè)定結(jié)果表明，組培和野生款冬花在有效成分及含量上基本一致，完全可以代替野生品入藥，但其栽培產(chǎn)量遠(yuǎn)遠(yuǎn)大于野生種，因此，以組培快繁途徑拯救野生款冬資源，建立工廠化、規(guī)?；目疃ㄉa(chǎn)基地是切實(shí)可行的。

[參考文獻(xiàn)]

[1]中國(guó)科學(xué)院植物研究所中國(guó)高等植物圖鑒第2冊(cè)[M]北京：科學(xué)出版社，1994：547.

[2]吳琪珍，張朝風(fēng)，許翔鴻，等. 款冬花化學(xué)成分和藥理活性研究進(jìn)展[J]. 中國(guó)野生植物資源，2015，34（2）：9.

[3]姚德生，任繼文，樊輝甘肅野生花卉[M]蘭州：甘肅科學(xué)技術(shù)出版社，2001：100.

[4]譚文澄，戴策剛觀賞植物組織培養(yǎng)[M]北京：中國(guó)林業(yè)出版社，1997：43.

[5]吳玲利，柯鑌峰，龔春，等. 白木通組織培養(yǎng)及快速繁殖[J]. 植物生理學(xué)報(bào)，2015，51（6）：903.

[6]劉敏花卉組織培養(yǎng)與工廠化生產(chǎn)[M]北京：地質(zhì)出版社，2002：60.

[7]鄔秀宏， 李中林， 陳正明，等. 茶樹(shù)組織培養(yǎng)中外植體褐化控制的研究[J]. 西南農(nóng)業(yè)學(xué)報(bào)，2012，25（3）：1065.

[8]沙月娥，歐陽(yáng)樂(lè)軍，彭舒桉樹(shù)胚狀體再生與遺傳轉(zhuǎn)化的研究進(jìn)展[J]. 植物生理學(xué)報(bào)，2012，48（4）：325.

[9]張小紅，張紅燕，武軍，等. TDZ對(duì)香椿愈傷組織誘導(dǎo)及芽增殖生長(zhǎng)等的影響[J]. 西北農(nóng)林科技大學(xué)學(xué)報(bào)，2002，30（5）：35.

[10]譚黎霞，田強(qiáng)強(qiáng)，王敦海棠花離體繁殖技術(shù)研究[J]. 西北林學(xué)院學(xué)報(bào)，2012，27（2）：93.

[11]賓宇波，沙海峰，任建武，等. 百花山葡萄組織培養(yǎng)和快速繁殖[J]. 西北林學(xué)院學(xué)報(bào)，2013，28（6）：99.

[12]劉毅款冬花規(guī)范化種植及質(zhì)量標(biāo)準(zhǔn)的系統(tǒng)研究[D]成都：成都中醫(yī)藥大學(xué)，2008.

[13]張文輝，張緒成，管青霞栽植期和栽植深度對(duì)款冬花的影響初報(bào)[J]. 甘肅林業(yè)科技，2016（6）：18.

[14]曹孜義，劉國(guó)民實(shí)用植物組織培養(yǎng)技術(shù)教程[M]. 修定版.蘭州：甘肅科學(xué)技術(shù)出版社，1999：66.

[15]王玉英，高新一植物組織培養(yǎng)手冊(cè)[M]北京：金盾出版社，2006：97.

[16]任繼文，雷穎金絲桃組織培養(yǎng)再生體系的建立[J]. 西北林學(xué)院學(xué)報(bào)，2010，25（3）：90

[責(zé)任編輯呂冬梅]endprint