蛋白質在膜表面的吸附特性及蛋白質存在的溶液環(huán)境對小檗堿膜透過行為的影響研究

李益群　徐麗　朱華旭　唐志書　李博　潘永蘭　姚薇薇　付廷明　郭立瑋

[摘要]為探索蛋白質在膜表面的吸附特性以及蛋白質存在的溶液環(huán)境對小檗堿膜透過行為的影響，以蛋白質、小檗堿為研究對象，配制模擬溶液，通過低場核磁共振技術、靜態(tài)吸附實驗以及膜分離實驗探究蛋白質與陶瓷膜、小檗堿之間可能存在的相互作用，以蛋白質靜態(tài)吸附量、膜過程相對通量、蛋白質截留率、小檗堿透過率及兩者的吸附率為評價指標，同時測定膜過程中膜污染阻力分布、過膜前后粒徑分布變化及膜表面電鏡掃描（SEM），研究蛋白質在陶瓷膜上的吸附特性及對小檗堿膜過程的影響。結果表明，陶瓷膜對蛋白質具有吸附作用，且吸附模型符合Langmuir吸附模型，在模擬溶液的膜分離過程中，蛋白質是引起膜污染的主要因素，但在1 g·L-1蛋白質的濃度下，蛋白質的存在對小檗堿的膜過程沒有顯著影響。

[關鍵詞]蛋白質； 小檗堿； 陶瓷膜微濾； 模擬體系； 吸附特性

[Abstract]In order to explore the adsorption characteristics of proteins on the membrane surface and the effect of protein solution environment on the permeation behavior of berberine， berberine and proteins were used as the research object to prepare simulated solution Low field NMR， static adsorption experiment and membrane separation experiment were used to study the interaction between the proteins and ceramic membrane or between the proteins and berberine The static adsorption capacity of proteins， membrane relative flux， rejection rate of proteins， transmittance rate of berberine and the adsorption rate of proteins and berberine were used as the evaluation index Meanwhile， the membrane resistance distribution， the particle size distribution and the scanning electron microscope （SEM） were determined to investigate the adsorption characteristics of proteins on ceramic membrane and the effect on membrane separation process of berberine The results showed that the ceramic membrane could adsorb the proteins and the adsorption model was consistent with Langmuir adsorption model In simulating the membrane separation process， proteins were the main factor to cause membrane fouling However， when the concentration of proteins was 1 g·L-1， the proteins had no significant effect on membrane separation process of berberine.

[Key words]protein； berberine； ceramic membrane microfiltration； simulation system； adsorption characteristics

陶瓷膜具有耐高溫、耐腐蝕、機械強度高、化學穩(wěn)定性好等特點，在生物醫(yī)藥、石油化工、食品飲料、水處理等領域得到廣泛的應用[12]，尤其是在中藥領域，憑借其對于中藥水提液分離純化的獨特優(yōu)勢而具有廣闊的應用前景[34]，但中藥水提液組成復雜多樣，小分子藥效物質的透過率不理想，嚴重制約了陶瓷膜在中藥領域的推廣應用，又缺少系統(tǒng)的研究方法，尤其是缺乏對高分子與膜、小分子與膜、高分子與小分子、高分子與高分子之間相互作用的研究手段，所以對膜過程機制的研究難以深入。

針對上述問題，本實驗進行了初步的研究，以蛋白質、小檗堿為研究對象，建立模擬體系，通過靜態(tài)吸附、膜分離實驗等手段，考察陶瓷膜對蛋白質的吸附特性，研究蛋白質的存在對小檗堿膜過程的影響，為深入研究高分子對膜過程的影響及小分子的透過機制，優(yōu)化設計特種分離膜奠定基礎。

1材料

陶瓷膜裝置（江蘇久吾高科技股份有限公司，02 μm ZrO2單通道內壓管式；外徑12 mm，內徑8 mm，管長220 mm；膜面積0005 m2）；MicroMR23025V型低場核磁儀（紐邁分析儀器股份有限公司，共振頻率23347 MHz；磁體溫度3199～3201 ℃；探頭線圈直徑 25 mm）；ZS90 型Malvern 納米粒徑測定儀（英國）；Hitachi（日立）掃描電子顯微鏡S4800型（日本）；Waters 2695 高效液相色譜分析儀（美國Waters公司，2998型紫外檢測器，Empower工作站）；ZORBAX SBC18色譜柱（美國安捷倫有限公司）；Sartorius BL4100型電子分析天平（德國）；Sartorius SQP型電子天平（德國）；SHACA水浴恒溫振蕩器（金壇市盛藍儀器制造有限公司）。endprint

鹽酸小檗堿對照品（純度867%，批號110713201212），購自中國食品藥品檢定研究院；鹽酸小檗堿提取物（純度 98%，批號20160228），購自南通飛宇生物科技有限公司；牛血清蛋白（CAS 9048468），購自Biosharp公司；甲醇（色譜純，江蘇漢邦科技有限公司）；乙腈（色譜純，美國 Merck 公司產(chǎn)品）；水為超純水；其余試劑均為分析純。

2方法

21樣品溶液配制

211蛋白質重水溶液的配制

精密稱取牛血清蛋白001 g，置10 mL量瓶中，加重水溶解，定容至刻度，即得牛血清蛋白重水溶液，用于低場核磁檢測。

212模擬溶液的配制

2121小檗堿模擬溶液根據(jù)本課題組前期研究[5]，參照黃連解毒湯中小檗堿的質量濃度配制模擬溶液，得模擬溶液1（0201 4 g·L-1，pH 644）。

2122蛋白質模擬溶液根據(jù)本課題組前期研究[6]，中藥水提液中蛋白質質量濃度在01～40 g·L-1，配制模擬溶液2～7（蛋白質質量濃度分別為01，05，10，15，20，40 g·L-1，pH 642）；選擇模擬溶液4（蛋白質質量濃度10 g·L-1，pH 642）進行吸附動力學實驗及膜分離實驗。

2123小檗堿+蛋白質模擬溶液根據(jù)本課題組前期研究[56]，配制小檗堿+蛋白質模擬溶液，得模擬溶液8（蛋白質質量濃度10 g·L-1，小檗堿質量濃度0201 4 g·L-1，pH 657）。

22陶瓷膜微濾實驗

將陶瓷膜膜管裝入膜裝置中，實驗溫度為30 ℃，跨膜壓差為015 MPa，加入超純水預壓30 min，之后繼續(xù)加入超純水，測定膜的純水通量（J0），放出超純水，分別加入模擬溶液1、模擬溶液4及模擬溶液8各4 500 mL，旁路循環(huán)至30 ℃，錯流微濾，同時測定模擬溶液的膜過程通量（J），待滲透液體積達2 000 mL時停止過濾，收集滲透液、截留液與原液，檢測各溶液中小檗堿、蛋白質含量。小檗堿透過率、蛋白質截留率及兩者的吸附率計算公式如下。

透過率=CS/C0×100% （1）

截留率=[1-（CS×VS）/（C0×V0）]×100% （2）

吸附率=[（C0×V0）-（CS×VS）-（CJ×VJ）]/（C0×V0）×100% （3）

其中，C0為原液中蛋白質濃度，CS為滲透液中蛋白質濃度，CJ為截留液中蛋白質濃度，V0為原液體積，VS為滲透液體積，VJ為截留液體積。

23靜態(tài)吸附實驗

將整根陶瓷膜浸入600 mL蛋白質模擬溶液中，在搖床上振搖（150 r·min-1，30 ℃），測定原液與吸附后溶液的蛋白質濃度，計算吸附量。蛋白質吸附量計算公式如下。

靜態(tài)吸附量=600×（C0 - C1）/S （4）

其中，C0為原液中蛋白質濃度；C1為吸附液中蛋白質濃度；S為陶瓷膜的表面積（0012 5 m2）。

24低場核磁共振實驗

精密量取上述蛋白質重水溶液3 mL，加入供低場核磁測試的專用試管中，測量空白溶液的T2弛豫時間，將陶瓷膜截成長為1 cm的小段管式膜，置于裝有重水溶液的試管中，分別在0，15，30，45，60，75，90，105，120，150，180，210，240 min時測定T2弛豫時間，繪制T2隨時間的變化曲線。

25含量測定

251小檗堿含量測定[6]

2511色譜條件與系統(tǒng)適應性條件ZORBAX SBC18色譜柱（46 mm ×250 mm，5 μm）；以乙腈為流動相（A），005%三乙胺01%磷酸水為流動相（B），梯度洗脫（0～5 min，10% A；5～7 min，10%～20% A；7～13 min，20% A；13～16 min，20%～30% A；16～25 min，30% A；25～27 min，30%～10% A；27～30 min，10% A）；檢測波長255 nm；柱溫30 ℃；流速08 mL·min-1。

2512對照品溶液的配制精密稱取鹽酸小檗堿對照品0030 5 g，置10 mL量瓶中，加甲醇溶解，定容至刻度，在精密量取小檗堿對照品溶液1 mL，置10 mL量瓶中，加甲醇稀釋并定容至刻度，即得濃度為0026 4 g·L-1的鹽酸小檗堿對照品溶液。分別進樣 2，4，6，8，10，15，20 μL，以峰面積為縱坐標（Y），對照品進樣量為橫坐標（X），繪制標準曲線，得回歸方程 Y=5×106X-26 409，R2=0999 8。表明小檗堿在 0052 9～0529 μg呈良好的線性關系。

2513供試品溶液的制備精密量取模擬溶液過膜前后的原液、滲透液、截留液各1 mL，置10 mL量瓶中，加甲醇稀釋并定容至刻度，搖勻，過022 μm的濾膜，即得供試品溶液。

252蛋白質含量測定

采用考馬斯亮藍染料比色法測定蛋白質的含量[7]。

253粒徑分布測定

用Malvern納米粒徑測定儀分別測定小檗堿模擬溶液、蛋白質模擬溶液及混合模擬溶液過膜前后的粒徑分布。

254膜阻力分布測定[8]

目前，DarcyPoiseuille[9] 定律過濾模型是膜分離技術中最常用來研究膜污染阻力分布的模型，以 Darcy 定律為基礎得出下列過濾通量表達式。

J=ΔPμ×Rt（5）

其中，J為膜通量（L·m-2·h-1），ΔP為膜壓差（Pa），μ為料液黏度（Pa·s），Rt為過濾阻力（m-1）。

但M MDaCin等[10] 指出采用上述阻力模型來比較各部分過濾阻力的相對大小時，往往過高估計濃差極化阻力而過低估計因溶質吸附引起的阻力，因此他對此模型進行了修正，本實驗即采用MMDaCin修正后的阻力模型對膜污染阻力分布進行分析。該模型將總阻力（Dt）分為膜自身阻力（Dm）、表面沉積阻力（De）、堵塞阻力（Di）和濃差極化阻力（Dp），計算各部分阻力及占總阻力的百分比。endprint

255掃描電鏡（SEM）分析

將污染后的陶瓷膜在35 ℃的烘箱中烘干12 h備用[11]，將干凈陶瓷膜與污染后的陶瓷膜敲碎，選取膜管同一位置的碎片，噴金后于掃描電鏡上觀察膜表面微觀結構及污染物形態(tài)。

3結果與分析

31陶瓷膜在蛋白質模擬溶液中的靜態(tài)吸附特性分析

低場核磁共振一般指恒定磁場強度低于05 T的核磁共振，其基本原理[12]是通過施加射頻脈沖給予處于恒定磁場中的樣品，使氫質子發(fā)生共振，質子所吸收的射頻波能量以非輻射的方式釋放后返回到基態(tài)，此過程被稱為弛豫過程，又可分為橫向弛豫（自旋自旋弛豫）和縱向弛豫（自旋晶格弛豫），可分別用T1和T2表示其弛豫時間，樣品內部氫質子所處物理化學環(huán)境及存在狀態(tài)決定了弛豫時間的長短。本實驗測定的T2弛豫時間反映了蛋白質中氫質子所處的物理化學環(huán)境，其值隨時間的變化與氫質子所受的束縛程度及其自由度有關，蛋白質與陶瓷膜之間的相互作用是影響氫質子T2弛豫時間的主要因素。

隨著蛋白質重水溶液與陶瓷膜接觸時間的增加，T2弛豫時間不斷減小，表明蛋白質重水溶液中氫質子所受的束縛越大，即自由度越小，表明陶瓷膜對蛋白質存在吸附作用，從而使T2弛豫時間不斷減小，見圖1。從趨勢上看，前60 min T2弛豫時間下降幅度明顯，120 min后逐漸趨于平緩，表明陶瓷膜對蛋白質的吸附在240 min后逐漸達到飽和。

為了從量上確定陶瓷膜對蛋白質的吸附作用，進一步研究了陶瓷膜對蛋白質的吸附量隨時間、濃度的變化情況。

蛋白質靜態(tài)吸附量隨時間的增加而增加，在240 min后吸附達到飽和，飽和吸附量為533 g·m-2，見圖2。經(jīng)擬合發(fā)現(xiàn)，陶瓷膜對蛋白質的吸附符合一級動力學吸附模型，擬合方程為y=5213 46[1-exp（-0013 72x）]，R2=0951 0。由方程可得出理論飽和吸附量為521 g·m-2，與實際相符合。觀察陶瓷膜對蛋白質吸附量隨時間的變化的趨勢，可以發(fā)現(xiàn)在0～240 min變化趨勢與低場核磁共振實驗中T2弛豫時間的變化趨勢類似，由此兩者相互印證了陶瓷膜對蛋白質的吸附特性符合一級動力學吸附模型。

陶瓷膜在不同質量濃度（01～40 g·L-1）的模擬溶液中對蛋白質的吸附量的變化情況，可見隨著蛋白質模擬溶液濃度的增大，陶瓷膜對蛋白質的吸附量也隨之增加，經(jīng)擬合發(fā)現(xiàn)陶瓷膜對蛋白質的靜態(tài)吸附模型符合Langmuir吸附模型，擬合方程為y=831x120/（1+053x120），R2=0985 07，見圖3。

32小檗堿膜透過行為及蛋白質對其膜過程的影響

321膜通量比較

因為膜的自身阻力不同，所以采用相對通量

（J/J0）來比較模擬溶液的膜過程，由于小檗堿溶液濃度較低，且膜通量與純水通量接近，膜過程所需時間較短，相對通量遠大于蛋白質模擬溶液、蛋白質+小檗堿混合模擬溶液的相對通量，因此只列出后2種溶液的相對通量變化進行比較，見圖4。蛋白質模擬溶液的相對通量要大于蛋白質與小檗堿混合模擬溶液的相對通量，但兩者膜通量衰減幅度相差不大，蛋白質模擬溶液的起始相對通量為023，終點時相對通量為019，加入小檗堿后起始相對通量為021，終點時相對通量為016。推測由于小檗堿的加入，使得混合模擬溶液的相對通量小于蛋白質模擬溶液的相對通量，但由于主要污染物都為蛋白質，所以兩者的相對通量衰減幅度相同。

322粒徑分布

蛋白質模擬溶液及混合模擬溶液過膜前后的原液、滲透液和截留液的粒徑分布圖見圖5，6，由于小檗堿溶液中粒徑太小，達不到檢測的最低要求，因此只列出蛋白質模擬溶液、混合模擬溶液的粒徑分布圖。蛋白質模擬溶液的粒徑大小有2個分布范圍，一部分粒子的粒徑大小<10 nm，推測為游離的蛋白質，一部分粒子的粒徑>100 nm，推測為蛋白質團聚體，滲透液、原液和截留液的粒徑分布類似，但滲透液中>100 nm的峰較原液、截留液明顯左移，而<10 nm的峰粒徑分布類似，推測其原因可能是由于溶液中蛋白質團聚體大部分被截留，一些粒徑較小的團聚體則能順利通過產(chǎn)生的結果，也可能是由于滲透液中一些游離的蛋白質重新團聚形成了新的團聚體，從而與原液略有差別。

蛋白質與小檗堿混合模擬溶液粒徑分布與蛋白質模擬溶液有所不同，主要差別是混合模擬溶液中的粒子大小在10～100 nm也有分布，推測其原因是由于小檗堿的存在使得蛋白質團聚體發(fā)生了改變，小檗堿可能與蛋白質結合形成了新的團聚體，從而有了新的粒徑分布范圍，這也有可能是導致其膜通量差異的原因。

323膜阻力分布

小檗堿模擬溶液在膜過程中膜自身阻力（Dm）所占比例較高，而蛋白質模擬溶液、混合模擬溶液膜過程中表面沉積阻力（De）所占比例最大，可見，蛋

白質對膜過程的影響主要是通過沉積在膜表面來實現(xiàn)的，由低場核磁共振實驗及靜態(tài)吸附實驗的結果可以確定陶瓷膜對蛋白質具有吸附作用，因此可以推測在膜過程中，蛋白質首先吸附在膜表面，進而在跨膜壓差的作用下沉積在膜表面形成凝膠層，從而引起膜污染，導致膜通量的下降。同時混合模擬溶液的表面沉積阻力（De）所占比例大于蛋白質模擬溶液中表面沉積阻力（De）所占比例，這也是混合模擬溶液相對通量小于蛋白質模擬溶液的原因，見圖7。

324小檗堿透過率、高分子截留率及兩者吸附率比較

小檗堿模擬溶液的小檗堿透過率、吸附率較混合模擬溶液高，但兩者之間沒有顯著性差異，混合模擬溶液中蛋白質的截留率、吸附率較蛋白質模擬溶液有所增加，但同樣沒有顯著性差異，由此可推測蛋白質雖然是導致膜污染的主要因素，但在1 g·L-1

的質量濃度下，蛋白質對小檗堿的透過率沒有顯著影響，見表1。相比于蛋白質的靜態(tài)吸附量，膜過程中陶瓷膜對蛋白質的吸附量顯著增加，結合膜阻力分布可知，所增加的吸附量是由于蛋白質的在膜表面沉積所致。endprint

325掃描電鏡

空白陶瓷膜表面粗糙，由微小顆粒堆積而成，從表面上可以清晰的觀察到膜孔，見圖8。濾過蛋白質模擬溶液的陶瓷膜表面被蛋白質覆蓋，放大之后污染形成的凝膠層上可以觀察到細小的孔，推測是膜孔未完全被污染物覆蓋所致。濾過小檗堿模擬溶液的陶瓷膜表面污染物呈不規(guī)則塊狀，與蛋白質污

4討論

陶瓷膜使用壽命長，易清洗，在中藥領域具有廣闊的應用前景，本實驗使用濃度為1%的NaOH溶液清洗陶瓷膜，清洗1 h，其超純水通量均能恢復到初始超純水通量的80%左右，可見陶瓷膜具有良好的再生性能，可重復使用。

小檗堿是黃連解毒湯中的主要藥效成分，采用陶瓷膜精制的方法是為了去除高分子成分，保留大量藥效成分，但在實際應用過程中，高分子物質會導致嚴重的膜污染，小分子藥效成分不能完全透過，為了探究高分子造成膜污染的機制以及小分子的透過機制，本實驗采用系統(tǒng)模擬的方法，初步考察了蛋白質在陶瓷膜上的吸附特性以及對小檗堿膜過程的影響。

本實驗通過低場核磁共振技術證明了陶瓷膜對蛋白質存在吸附作用，并通過靜態(tài)吸附實驗進一步證明了陶瓷膜對蛋白質的吸附作用符合一級動力學吸附模型及Langmuir吸附模型。蛋白質吸附在膜表面是形成膜污染的基礎，結合蛋白質模擬溶液膜過程相關參數(shù)可知，蛋白質對陶瓷膜的污染形式主要是通過表面沉積來實現(xiàn)的。

小檗堿模擬溶液過膜后，小檗堿透過率為7787%，吸附率為2156%，小檗堿與蛋白質混合模擬溶液過膜后，小檗堿透過率為7565%，吸附率為2072%，2種溶液的透過率與吸附率之間沒有顯著性差異，由此可見在此條件下，蛋白質對小檗堿的膜過程沒有顯著影響。探究小檗堿透過率低的原因，推測其原因一方面是陶瓷膜對小檗堿的吸附作用，一方面是小檗堿在膜過程中的“受限傳遞”。因此，小檗堿在膜表面的吸附作用以及其“受限傳遞”的機制將是進一步研究的重點。

本實驗考察了陶瓷膜對蛋白質的吸附作用以及蛋白質的存在對小檗堿膜過程的影響，是研究陶瓷膜過程中小分子透過機制和高分子物質的污染機制的一種嘗試，為研究其他高分子物質對膜過程的影響，以及小分子藥效物質的透過機制提供一種思路，同時為深入研究中藥水提液的膜過程、優(yōu)化設計中藥特種分離膜奠定基礎。

[參考文獻]

[1]漆虹， 曹義鳴 2014年我國陶瓷膜應用新進展[J]. 膜科學與技術， 2015， 35（3）： 131.

[2]王姣， 姜忠義， 吳洪， 等. 中藥有效成分和有效部位分離用膜[J]. 中國中藥雜志， 2005， 30（3）： 165.

[3]曹靜杰， 董新法， 董應超， 等. 無機陶瓷膜分離技術應用研究進展[J]. 廣州化工， 2014， 41（2）： 314.

[4]曹云臺， 郭立瑋， 施棟磊， 等. 陶瓷膜應用于中藥精制的研究進展[J]. 中草藥， 2010， 42（9）： 19.

[5]劉靜， 郭立瑋， 朱華旭， 等. 基于系統(tǒng)模擬方法的3種溶液環(huán)境對小檗堿膜過程影響及其機制初探[J]. 膜科學與技術， 2017， 37（3）： 104.

[6]潘永蘭 中藥水提液無極陶瓷膜膜污染基礎數(shù)據(jù)庫的建立及數(shù)據(jù)的關聯(lián)分析[D]. 南京：南京中醫(yī)藥大學， 2009.

[7]董潔， 郭立瑋， 文紅梅， 等. 中藥水提液種蛋白質含量測定方法研究[J]. 現(xiàn)代中藥研究與實踐， 2009， 22（6）： 40.

[8]李博， 張連軍， 郭立瑋， 等. 基于溶液環(huán)境調節(jié)理論的黃連解毒湯陶瓷膜微濾過程的預處理研究[J]. 中國中藥雜志， 2014， 39（1）： 59.

[9]黃仲濤， 曾昭槐， 鐘邦克， 等. 無機膜技術及其應用[M]. 北京： 中國石化出版社， 1999.

[10]DalCin M M， Mclellan F， C N Striez， et al Membrane performance with a pulp mill effluent： relative contributions of fouling mechanisms[J]. J Membrane Sci， 1996， 120（2）： 273.

[11]Ao L， Liu W J， Zhao L， et al Membrane fouling in ultrafiltration of natural water after pretreatment to different extents[J]. J Environ Sci， 2016， 43： 234.

[12]楊赫鴻， 李沛軍， 孔保華， 等. 低場核磁共振技術在肉品科學研究中的應用[J]. 食品工業(yè)科技， 2012，33 （13）： 400

[責任編輯孔晶晶]endprint