• <tr id="yyy80"></tr>
  • <sup id="yyy80"></sup>
  • <tfoot id="yyy80"><noscript id="yyy80"></noscript></tfoot>
  • 99热精品在线国产_美女午夜性视频免费_国产精品国产高清国产av_av欧美777_自拍偷自拍亚洲精品老妇_亚洲熟女精品中文字幕_www日本黄色视频网_国产精品野战在线观看 ?

    壁虎對肝細(xì)胞癌干細(xì)胞特性的影響及其機(jī)制

    2017-11-11 19:09:36張雅蘭陳文發(fā)吳春玲
    中國中藥雜志 2017年20期
    關(guān)鍵詞:肝細(xì)胞癌壁虎

    張雅蘭 陳文發(fā) 吳春玲

    [摘要]研究壁虎對肝癌干細(xì)胞特性的影響,并探討其分子機(jī)制。采用MTT法檢測肝癌細(xì)胞增殖;腫瘤球培養(yǎng)和流式細(xì)胞術(shù)檢測肝癌干性;Western blot檢測Wnt通路及干性相關(guān)蛋白的表達(dá);免疫共沉淀檢測相互作用蛋白;皮下移植瘤模型檢測肝癌細(xì)胞的干性。結(jié)果顯示,壁虎對Huh7細(xì)胞的IC50為(0750±0112) g·mL-1,其對Hep3B細(xì)胞的IC50為(0454±0039) g·mL-1。壁虎處理的肝癌細(xì)胞培養(yǎng)形成的腫瘤球的數(shù)目和大小均縮?。≒<005),CD44,CD133陽性的肝癌細(xì)胞比例減少(P<005)。守宮處理肝癌細(xì)胞后,βcatenin,CD44,cMyc,CCND1,Sox2,Oct4,Nanog,ABCG2等表達(dá)均下調(diào)。免疫共沉淀結(jié)果顯示,壁虎能抑制LRP6與Frizzled6的相互作用。表明,壁虎能夠抑制肝癌細(xì)胞的增殖、腫瘤球的形成及腫瘤干細(xì)胞的比例,其通過靶向LRP6,阻止LRP6與Frizzled6復(fù)合物的形成而抑制Wnt信號通路。

    [關(guān)鍵詞]壁虎; 肝細(xì)胞癌; 干細(xì)胞特性; Wnt

    [Abstract]To explore the effects and mechanism of aqueous extracts of gecko on cancer stem cells properties of hepatocellular carcinoma In vitro, MTT assay was used to detect the cells growth in Huh7 and Hep3B Spheroidforming assay and flow cytometry were performed to observe the the stemness of Huh7 and Hep3B cells The protein expressions of βcatenin, CD44, cMyc, CCND1, Sox2, Oct4, Nanog and ABCG2 were detected by Western blot Interacting proteins were detected by coimmunoprecipitation; and a subcutaneous xenograft model was used to detect the stemness of hepatoma carcinoma cells The results indicated that aqueous extracts of gecko induced cell growth inhibition in a dose and timedependent manner, with the IC50 of (0750±0112) g·mL-1 for Huh7 and (0454±0039) g·mL-1for Hep3B, respectively The number and size of tumor spheres formed by hepatoma carcinoma cells were decreased after treatment by aqueous extracts of gecko(P<005); the proportions of cells staining with putative markers for cancer stem cells, such as CD133 and CD44, were decreased(P<005) After treatment with aqueous extracts of gecko, the expression levels of βcatenin, CD44, cMyc, CCND1, Sox2, Oct4, Nanog and ABCG2 were decreased Coimmunoprecipitation results showed that the aqueous extracts of gecko could inhibit the interaction between LRP6 and Frizzled6, indicating that the aqueous extracts of gecko could inhibit the proliferation of hepatoma cells, the formation of tumor spheres and the proportion of tumor stem cells, and inhibit the Wnt signaling pathway by targeting LRP6 to prevent the formation of LRP6 and Frizzled6 complexes.

    [Key words]gecko; hepatocellular carcinoma; stemness; Wnt

    肝細(xì)胞癌(hepatocellular carcinoma,HCC)是全球發(fā)病率居第5位的惡性腫瘤,也是我國最常見的惡性腫瘤之一。近年來,盡管多種HCC的治療模式不斷進(jìn)展,但HCC的遠(yuǎn)期效果仍不理想,其中癌癥的復(fù)發(fā)轉(zhuǎn)移是導(dǎo)致遠(yuǎn)期效果不理想的重要原因。腫瘤干細(xì)胞(CSC)對放化療的敏感性差,被認(rèn)為是造成癌癥轉(zhuǎn)移、腫瘤化療和放療抵抗的主要原因之一。最初在《本草綱目》中記載,壁虎,亦稱守宮或天龍,是一種傳統(tǒng)的中藥材。在現(xiàn)代醫(yī)學(xué)中,壁虎被證實在肝癌中具有抗腫瘤作用[15],但其對腫瘤干性的影響未見相關(guān)報道。本研究探討壁虎對肝癌干性的影響,并闡述其作用機(jī)制,以望為其臨床治療肝癌提供新的依據(jù)。

    1材料

    11藥材鮮壁虎Gekko swinhonis Gunther購自河北祁奧中藥飲片有限公司,經(jīng)由作者鑒定后使用。經(jīng)冷凍、研磨、溶解、過濾等步驟后制成鮮壁虎水提取物,經(jīng)BCA法定量后,制成質(zhì)量濃度100 g·L-1的溶液。endprint

    12動物BALB/c裸小鼠45只,雄性,4周齡,購自上海斯萊克實驗動物有限責(zé)任公司,許可證號SCXK(滬)20120002。裸鼠飼養(yǎng)環(huán)境穩(wěn)定,實驗動物相關(guān)操作符合動物倫理學(xué)要求。

    13試劑βcatenin(510672AP),CD133(184701AP),cMyc(108281AP),CCND1(601861Ig),Sox2(110641AP),Oct4(112631AP),Nanog(142951AP),ABCG2(100511AP),GAPDH(600041Ig)均購自中國Proteintech公司;LRP6(2560),F(xiàn)rizzled6(5158),CD44(3570)均購自美國CST公司;細(xì)胞裂解液(S3090)購自碧云天生物技術(shù)公司;COIP試劑盒(Thermo公司,美國);LowInput QuickAmp Labeling Kit,Gene Expression Hybridization Kit 及基因芯片均購自德國Agilent公司。

    14儀器移液器(GeneTex公司,美國);化學(xué)發(fā)光酶標(biāo)儀(BIOTEK公司,美國);超速離心機(jī)(Eppendorf公司,德國);Agilent Scanner G2505C(Agilent 公司,德國);垂直電泳儀(BioRad公司,美國);轉(zhuǎn)膜儀(BioRad公司,美國)。

    2方法

    21細(xì)胞培養(yǎng)人肝癌細(xì)胞Huh7和Hep3B購自上海中國科學(xué)院細(xì)胞庫。細(xì)胞培養(yǎng)基為含10%胎牛血清,100 kU·L-1青霉素,100 kU·L-1鏈霉素的DMEM培基,在37 ℃,5%CO2飽和濕度恒溫培養(yǎng)箱中培養(yǎng)細(xì)胞。

    22細(xì)胞藥物敏感度實驗(MTT法)取對數(shù)生長期細(xì)胞,1萬個細(xì)胞/孔種于96孔板中,細(xì)胞貼壁后加入含不同濃度(0,005,01,025,05,1,25,5 g·mL-1)壁虎水提取物的培基培養(yǎng)一定時間,每孔加入MTT溶液(5 g·L-1)20 μg,37 ℃孵箱中繼續(xù)孵育4 h,再加入DMSO,選擇570 nm波長,在酶聯(lián)免疫檢測儀上測定各孔吸光度。

    23腫瘤球培養(yǎng)細(xì)胞用含不同濃度壁虎水提取物的培基培養(yǎng)一定時間(0,01,025 g·mL-1)處理48 h后,取對數(shù)生長期細(xì)胞,消化后充分洗滌棄去培養(yǎng)液中殘留的血清,接種于低黏附性6孔板中,每孔5 000個細(xì)胞,4 mL腫瘤球培基(DMEM/F12+B27+bFGF+EGF)培養(yǎng)2~3周后觀察腫瘤球的形成情況。

    24流式檢測細(xì)胞表面標(biāo)記細(xì)胞用含不同濃度壁虎水提取物的培基培養(yǎng)一定時間(0,01,025 g·mL-1)處理48 h后,取對數(shù)生長期細(xì)胞約1×106個細(xì)胞,洗滌細(xì)胞后,用含一抗的PBS重懸細(xì)胞,冰上孵育20~45 min,離心后用PBS洗滌2次,重懸于含熒光二抗的PBS中,冰上孵育20~45 min,離心后用PBS洗滌2次,上機(jī)檢測。

    25動物造模取對數(shù)生長期細(xì)胞,以1×105,2×105,5×105 個/100 μL的梯度接種于裸鼠皮下,每個梯度15只裸鼠。壁虎水提取物0,1,3 mg·g-13個梯度每周灌胃給藥2次,2個月后,觀察裸鼠皮下瘤的形成情況。

    26基因表達(dá)譜檢測細(xì)胞用含不同濃度壁虎水提取物的培基培養(yǎng)一定時間(0,025 g·mL-1)處理48 h后,提取細(xì)胞總RNA,經(jīng)定量后,用熒光染料標(biāo)記RNA,再將標(biāo)記的RNA與基因芯片進(jìn)行雜交反應(yīng),反應(yīng)結(jié)束后用Agilent Scanner G2505C 掃描芯片熒光信號,篩選出差異基因后,進(jìn)行KEGG通路分析。

    27Western blot檢測相關(guān)基因蛋白的表達(dá)細(xì)胞用含不同濃度壁虎水提取物的培基培養(yǎng)一定時間(0,025 g·mL-1)處理48 h后,加入蛋白裂解液冰上裂解30 min,4 ℃ 12 000 r·min-1離心20 min取上清測蛋白濃度。經(jīng)8%~10%SDS PAGE電泳,濕轉(zhuǎn)至PVDF膜上,在3%BSA中封閉1 h,一抗(1∶1 000)4 ℃孵育過夜,洗膜后再用HRP耦聯(lián)的二抗室溫孵育15 h,洗膜后加ECL發(fā)光液進(jìn)行曝光。

    28免疫共沉淀將壁虎水提取物與磁珠孵育固定化后,提取細(xì)胞總蛋白,與上述的磁珠在4 ℃中共孵育過夜進(jìn)行免疫共沉淀反應(yīng),后洗脫共沉淀的蛋白,對獲取的蛋白進(jìn)行質(zhì)譜分析,篩選出差異蛋白或是對獲取的蛋白進(jìn)行Western blot檢測驗證質(zhì)譜的結(jié)果。具體操作步驟按照免疫共沉淀試劑盒的說明書進(jìn)行。

    29統(tǒng)計學(xué)分析采用SPSS 210進(jìn)行統(tǒng)計學(xué)分析。計量資料以±s表示;計量資料采用單因素方差分析(OneWay ANOVA)用于多組間的比較,采用t檢驗用于2組間比較。P<005為差異有統(tǒng)計學(xué)意義。

    3結(jié)果

    31抑制肝癌細(xì)胞的增殖肝癌細(xì)胞經(jīng)壁虎處理后,壁虎對肝癌細(xì)胞的影響呈現(xiàn)出劑量和時間依賴性,隨著壁虎濃度的增加及處理時間的延長(IC50的藥物濃度處理細(xì)胞),其對肝癌細(xì)胞的增殖抑制作用越顯著。壁虎作用于肝癌細(xì)胞48 h,其對Huh7細(xì)胞的IC50是(0750±0112) g·mL-1,其對Hep3B細(xì)胞的IC50是(0454±0039) g·mL-1。而當(dāng)壁虎質(zhì)量濃度小于025 g·mL-1時,對肝癌細(xì)胞增殖無明顯影響,見圖1。

    32壁虎抑制肝癌的干細(xì)胞特性肝癌細(xì)胞增殖受抑制可能會影響其干細(xì)胞特性,為排除增殖對干細(xì)胞特性的影響,選取01 g·mL-1和025 g·mL-12個濃度梯度的壁虎處理肝癌細(xì)胞。經(jīng)處理后的肝癌細(xì)胞培養(yǎng)形成的腫瘤球的數(shù)目和大小均較對照組(0 g·mL-1)明顯縮小(P<005),并且呈現(xiàn)出劑量依賴效應(yīng),見圖2。同時,經(jīng)不同濃度壁虎處理的肝癌細(xì)胞,其干細(xì)胞標(biāo)志物CD44,CD133的比例也明顯減少(P<005),也呈現(xiàn)出劑量依賴效應(yīng),見圖2。

    進(jìn)一步在動物體內(nèi)證實壁虎對肝癌細(xì)胞干細(xì)胞特性的影響,結(jié)果顯示,壁虎能夠抑制肝癌在體內(nèi)的成瘤能力,且壁虎的濃度越大其對肝癌細(xì)胞成瘤能力的抑制越顯著,見圖3。endprint

    33壁虎通過抑制Wnt通路進(jìn)而影響肝癌的干細(xì)胞特性為進(jìn)一步闡明壁虎影響肝癌干細(xì)胞特性的具體機(jī)制,將肝癌細(xì)胞經(jīng)壁虎處理后與未經(jīng)壁虎處理的肝癌細(xì)胞進(jìn)行基因表達(dá)譜分析。篩選出差異基因(倍數(shù)改變≥2倍),經(jīng)KEGG通路分析表明,壁虎在肝癌細(xì)胞中主要影響Wnt通路,見圖4。

    進(jìn)一步檢測Wnt通路關(guān)鍵轉(zhuǎn)錄因子βcatenin及其經(jīng)典靶基因CD44,cMyc,CCND1的表達(dá),結(jié)果表明在肝癌細(xì)胞中經(jīng)壁虎處理后Wnt通路的活性發(fā)生下調(diào)。Wnt通路與肝癌的干細(xì)胞特性密切相關(guān),進(jìn)一步檢測干細(xì)胞特性的相關(guān)指標(biāo)Sox2,Oct4,Nanog,ABCG2等表達(dá),發(fā)現(xiàn)經(jīng)壁虎處理的肝癌細(xì)胞的干細(xì)胞標(biāo)志物蛋白發(fā)生下調(diào),見圖5。

    34壁虎靶向LRP6后影響肝癌細(xì)胞Wnt通路活性通過免疫共沉淀聯(lián)合質(zhì)譜分析,篩選出與壁虎可能存在相互作用的蛋白,見表1。為篩選出的評分最高的10個相互作用蛋白。其中LRP6為Wnt通路的關(guān)鍵膜受體分子,進(jìn)一步通過免疫共沉淀檢測壁虎對LRP6的影響,結(jié)果顯示,壁虎對LRP6的表達(dá)量并無影響,而是影響了LRP6與另一關(guān)鍵Wnt通路信號分子Frizzled6的結(jié)合,隨著壁虎濃度的增加,LRP6與Frizzled6的結(jié)合量逐漸減少,見圖6。

    4討論

    壁虎已被證實能夠發(fā)揮抑制腫瘤增殖及侵襲轉(zhuǎn)移、促腫瘤凋亡、抗血管生成及免疫調(diào)節(jié)等多種功能[23,6],其在肝癌中能夠促進(jìn)肝癌的分化從而發(fā)揮抗腫瘤作用[1,5]??梢姡诨⒖赡苡绊懜伟┑母杉?xì)胞特性。本研究表明,壁虎可以抑制肝癌的干細(xì)胞特性在體內(nèi)外呈現(xiàn)出抗腫瘤效應(yīng),其對肝癌干性的影響是通過抑制Wnt通路的活性而實現(xiàn)的。

    細(xì)胞的增殖會對侵襲轉(zhuǎn)移、干性等多種功能的檢測產(chǎn)生影響。與前期相關(guān)報道一致,在本研究中證實了壁虎能夠抑制肝癌細(xì)胞的增殖,后續(xù)實驗選取了對肝癌細(xì)胞增殖無明顯影響的壁虎濃度梯度對細(xì)胞進(jìn)行處理。

    腫瘤的干細(xì)胞特性已經(jīng)被證實與腫瘤復(fù)發(fā)轉(zhuǎn)移

    與正常對照組相比1)P<005,2)P<001,3)P<0001(圖5同)。

    密切相關(guān),直接影響腫瘤患者的預(yù)后。其中各種腫瘤標(biāo)記物的檢測常被用于反應(yīng)干細(xì)胞比例,在肝癌中,CD44及CD133是肝癌干細(xì)胞標(biāo)志物,通過檢測CD44,CD133的細(xì)胞比例能夠反映肝癌的干細(xì)胞比例[7]。檢測腫瘤細(xì)胞的干細(xì)胞特性的“金標(biāo)準(zhǔn)”是通過檢測其成瘤的能力。在相同細(xì)胞濃度的移植瘤中,成瘤能力越強(qiáng)則表明腫瘤的干性越強(qiáng)。在本研究中,壁虎能夠在體內(nèi)外抑制肝癌細(xì)胞的干細(xì)胞特性。

    Wnt通路已被證實在維持干細(xì)胞特性中發(fā)揮重要作用[8]。Wnt通路的信號分子通過結(jié)合于細(xì)胞膜表面的Frizzled受體后,進(jìn)一步與LRP5/6形成細(xì)胞表面的膜分子復(fù)合物,該復(fù)合物抑制βcatenin的降解復(fù)合物APC/AXIN1/GSK3β對βcatenin的泛素化降解,從而使得βcatenin能夠入核促進(jìn)包括cMyc,CCND1,CD44等多個靶基因的轉(zhuǎn)錄,激活Wnt信號通路發(fā)揮促進(jìn)侵襲轉(zhuǎn)移、干性等作用[911]。

    本研究表明,壁虎能通過下調(diào)Wnt通路的活性從而抑制Sox2,Oct4,Nanog,ABCG2等多個腫瘤干細(xì)胞關(guān)鍵蛋白的表達(dá),實現(xiàn)對肝癌干性的抑制。研究表明壁虎可能是通過其提取物中的蛋白成分發(fā)揮作用[23],這為采用研究蛋白相互作用的方法,探索壁虎可能的相互作用靶點(diǎn)提供了可能[12]。本研究通過免疫共沉淀聯(lián)合質(zhì)譜分析的方法研究壁虎的相互作用靶點(diǎn),壁虎起作用成分為蛋白大分子,首先考慮其作用靶點(diǎn)位于細(xì)胞膜表面。對篩選出的可能作用靶點(diǎn)進(jìn)行免疫共沉淀聯(lián)合Western blot驗證分析,證實了LRP6為壁虎的作用靶點(diǎn),壁虎通過與LPR6相互作用后,阻止了LRP6與Frizzled的結(jié)合,從而抑制了Wnt信號通路的活性。本研究首次通過蛋白互相作用的研究方法尋找出了壁虎的具體作用靶

    點(diǎn),進(jìn)一步闡明了其在肝癌中發(fā)揮抗腫瘤作用的分子機(jī)制。

    綜上可知,在肝癌中,壁虎通過作用于LPR6膜受體,阻止了LRP6與Frizzled復(fù)合物的形成,下調(diào)了Wnt信號通路活性,從而抑制肝癌的干細(xì)胞特性,發(fā)揮壁虎的抗肝癌作用。該研究著眼于肝癌干細(xì)胞特性相關(guān)的分子機(jī)制及生物學(xué)事件,將可能有利于改善肝癌患者的預(yù)后情況以及總體生存率,為壁虎臨床運(yùn)用于肝癌的治療提供了理論依據(jù)。

    [參考文獻(xiàn)]

    [1]Wang Y X, Gu X X, Geng D, et al Differentiation of bel7402 human hepatocarcinoma cells induced by aqueous extracts of fresh gecko (AG) and its antitumor activity in vivo[J]. J Ethnopharmacol, 2014, 155(3): 1583.

    [2]Song Y, Wang J G, Li R F, et al Gecko crude peptides induce apoptosis in human liver carcinoma cells in vitro and exert antitumor activity in a mouse ascites H22 xenograft model[J]. J Biomed Biotechnol, 2012, 2012: 743573.

    [3]Chen D, Yao W J, Zhang X L, et al Effects of gekko sulfated polysaccharideprotein complex on human hepatoma SMMC7721 cells: inhibition of proliferation and migration[J]. J Ethnopharmacol, 2010, 127(3): 702.endprint

    [4]Yan Z C, Chen D, Wu X Z, et al Effects of aqueous extracts of Aconitum carmichaeli, Rhizoma Bolbostemmatis, Phytolacca acinosa, Panax notoginseng and Gekko swinhonis Guenther on Bel7402 cells[J]. World J Gastroenterol, 2007, 13(19): 2743.

    [5]Wu X, Chen D, Xie G R Effects of gekko sulfated polysaccharide on the proliferation and differentiation of hepatic cancer cell line[J]. Cell Biol Int, 2006, 30(8): 659.

    [6]Liu F, Wang J G, Wang S Y, et al Antitumor effect and mechanism of gecko on human esophageal carcinoma cell lines in vitro and xenografted sarcoma 180 in Kunming mice[J]. World J Gastroenterol, 2008, 14(25): 3990.

    [7]Zhu M, Yin F, Fan X, et al Decreased TIP30 promotes Snailmediated epithelialmesenchymal transition and tumorinitiating properties in hepatocellular carcinoma[J]. Oncogene, 2015, 34(11): 1420.

    [8]Miki T, Yasuda S Y, Kahn M, et al Wnt/betacatenin signaling in embryonic stem cell selfrenewal and somatic cell reprogramming[J]. Stem Cell Rev, 2011, 7(4): 836.

    [9]Clevers H, Nusse R Wnt/betacatenin signaling and disease[J]. Cell, 2012, 149(6):1192.

    [10]MacDonald B T, Tamai K, He X Wnt/betacatenin signaling: components, mechanisms, and diseases[J]. Dev Cell, 2009, 17(1): 9.

    [11]Niehrs C The complex world of WNT receptor signalling[J]. Nat Rev Mol Cell Biol, 2012, 13(12): 767.

    [12]Iizumi Y, Oishi M, Taniguchi T, et al The flavonoid apigenin downregulates CDK1 by directly targeting ribosomal protein S9[J]. PLoS ONE, 2013, 8(8): e73219

    [責(zé)任編輯張寧寧]endprint

    猜你喜歡
    肝細(xì)胞癌壁虎
    BB壁虎和他的BB朋友們
    孩子(2021年3期)2021-03-24 10:58:50
    壁虎
    快樂語文(2020年30期)2021-01-14 01:05:32
    小壁虎為什么借尾巴?
    仿生科技學(xué)壁虎
    對比分析肝內(nèi)型膽管細(xì)胞癌與肝細(xì)胞癌采用CT的鑒別診斷
    捉壁虎
    肝細(xì)胞癌Adv—p53、AAV—HGFK1聯(lián)合轉(zhuǎn)基因治療的臨床療效和預(yù)后分析
    磷脂酰肌醇蛋白聚糖3與ki67在不同分化程度肝細(xì)胞癌中的表達(dá)分析
    Rab27A和Rab27B在4種不同人肝癌細(xì)胞株中的表達(dá)
    聯(lián)合金雀異黃素和TRAIL處理對SMMC—7721肝癌干細(xì)胞樣細(xì)胞凋亡的影響
    可以免费在线观看a视频的电影网站 | 在线天堂中文资源库| 免费观看性生交大片5| 精品国产露脸久久av麻豆| 国产精品熟女久久久久浪| av又黄又爽大尺度在线免费看| 麻豆av在线久日| 国产成人系列免费观看| 国产爽快片一区二区三区| 国产精品国产三级国产专区5o| av电影中文网址| 亚洲四区av| 免费不卡黄色视频| 中文字幕另类日韩欧美亚洲嫩草| 亚洲人成网站在线观看播放| 超碰97精品在线观看| 丰满饥渴人妻一区二区三| 巨乳人妻的诱惑在线观看| 欧美日本中文国产一区发布| 欧美日韩视频精品一区| 综合色丁香网| 欧美亚洲日本最大视频资源| 欧美黄色片欧美黄色片| 亚洲av中文av极速乱| 成人国语在线视频| 亚洲情色 制服丝袜| 曰老女人黄片| 日韩精品免费视频一区二区三区| 国产女主播在线喷水免费视频网站| 99热国产这里只有精品6| 黑人猛操日本美女一级片| 一本大道久久a久久精品| 中文字幕亚洲精品专区| 国产一区二区激情短视频 | 日本黄色日本黄色录像| 国产熟女午夜一区二区三区| av在线播放精品| 亚洲三区欧美一区| 久久av网站| 一级片免费观看大全| 亚洲av成人精品一二三区| av免费观看日本| 国产亚洲av片在线观看秒播厂| 亚洲专区中文字幕在线 | 王馨瑶露胸无遮挡在线观看| 精品第一国产精品| 精品一区二区三区av网在线观看 | 亚洲综合精品二区| 99久久精品国产亚洲精品| 精品国产一区二区久久| 午夜老司机福利片| 一级,二级,三级黄色视频| 亚洲精品自拍成人| 视频在线观看一区二区三区| 超色免费av| 亚洲天堂av无毛| 91aial.com中文字幕在线观看| 亚洲天堂av无毛| 精品一区二区免费观看| 国产精品亚洲av一区麻豆 | 久久久久精品国产欧美久久久 | 精品国产国语对白av| 99久久99久久久精品蜜桃| 久久99热这里只频精品6学生| 毛片一级片免费看久久久久| 婷婷色综合www| 9热在线视频观看99| 国产日韩欧美视频二区| 欧美亚洲日本最大视频资源| 亚洲国产欧美日韩在线播放| 男人舔女人的私密视频| 最近中文字幕2019免费版| 国产欧美日韩综合在线一区二区| 亚洲婷婷狠狠爱综合网| 天天躁狠狠躁夜夜躁狠狠躁| 国产精品久久久久久人妻精品电影 | 婷婷色综合www| 极品少妇高潮喷水抽搐| 国产精品一区二区在线观看99| 69精品国产乱码久久久| 99久久综合免费| 丝瓜视频免费看黄片| 黄色视频不卡| 亚洲国产av新网站| 久久精品亚洲熟妇少妇任你| av视频免费观看在线观看| 男的添女的下面高潮视频| 色综合欧美亚洲国产小说| 夜夜骑夜夜射夜夜干| 精品人妻一区二区三区麻豆| 国产成人精品久久久久久| 少妇的丰满在线观看| 天天躁日日躁夜夜躁夜夜| 人人妻,人人澡人人爽秒播 | 亚洲精品自拍成人| 一级毛片电影观看| 国产一级毛片在线| 成年人免费黄色播放视频| 亚洲美女黄色视频免费看| 国产一区二区 视频在线| 日韩中文字幕欧美一区二区 | 国产极品天堂在线| 午夜免费鲁丝| 久久久久久久国产电影| 狠狠婷婷综合久久久久久88av| 七月丁香在线播放| av不卡在线播放| tube8黄色片| av.在线天堂| 久久久久视频综合| 侵犯人妻中文字幕一二三四区| 秋霞伦理黄片| 制服诱惑二区| 日韩免费高清中文字幕av| 国产野战对白在线观看| 一级片免费观看大全| www.熟女人妻精品国产| 飞空精品影院首页| 丝袜美腿诱惑在线| av网站在线播放免费| 午夜福利影视在线免费观看| 日本欧美视频一区| 久久99精品国语久久久| 成人18禁高潮啪啪吃奶动态图| 秋霞在线观看毛片| 亚洲成av片中文字幕在线观看| 亚洲天堂av无毛| 啦啦啦视频在线资源免费观看| 国产欧美日韩一区二区三区在线| 成年美女黄网站色视频大全免费| svipshipincom国产片| 狂野欧美激情性bbbbbb| 国产又色又爽无遮挡免| 一区二区av电影网| 亚洲一区中文字幕在线| 国产探花极品一区二区| bbb黄色大片| 欧美日韩国产mv在线观看视频| 国产亚洲av片在线观看秒播厂| 亚洲欧美精品自产自拍| 国产成人啪精品午夜网站| 侵犯人妻中文字幕一二三四区| 亚洲,欧美精品.| 观看av在线不卡| 嫩草影院入口| 日韩电影二区| 国产一区二区三区av在线| 高清不卡的av网站| 日韩视频在线欧美| 1024视频免费在线观看| 午夜免费鲁丝| 亚洲精品一区蜜桃| 亚洲精品视频女| 男女边吃奶边做爰视频| 最近的中文字幕免费完整| 亚洲第一青青草原| 日韩伦理黄色片| www.熟女人妻精品国产| 国产成人欧美| 精品免费久久久久久久清纯 | 超碰成人久久| 考比视频在线观看| 一区二区av电影网| 亚洲一区中文字幕在线| www.av在线官网国产| 日韩制服骚丝袜av| 一级黄片播放器| 十八禁网站网址无遮挡| 日本一区二区免费在线视频| 一边摸一边抽搐一进一出视频| 免费看不卡的av| 国产一区二区三区av在线| 久久 成人 亚洲| 涩涩av久久男人的天堂| 国产女主播在线喷水免费视频网站| 又粗又硬又长又爽又黄的视频| 少妇猛男粗大的猛烈进出视频| 一级a爱视频在线免费观看| 一边摸一边做爽爽视频免费| 亚洲精品中文字幕在线视频| 久久鲁丝午夜福利片| 日韩制服骚丝袜av| 国产精品99久久99久久久不卡 | 丝袜美足系列| 国产午夜精品一二区理论片| 少妇被粗大猛烈的视频| 国产片特级美女逼逼视频| 黄片小视频在线播放| av福利片在线| 欧美 亚洲 国产 日韩一| 一区二区日韩欧美中文字幕| 国产极品粉嫩免费观看在线| 日本欧美国产在线视频| kizo精华| 日韩中文字幕视频在线看片| 水蜜桃什么品种好| 老司机影院毛片| 国产亚洲欧美精品永久| 亚洲国产欧美日韩在线播放| 中文天堂在线官网| 久久青草综合色| 精品亚洲成国产av| 中文欧美无线码| 亚洲国产欧美网| 精品国产一区二区三区四区第35| 日本色播在线视频| 不卡av一区二区三区| kizo精华| xxx大片免费视频| 日韩一区二区三区影片| 国产有黄有色有爽视频| xxxhd国产人妻xxx| 在线观看免费视频网站a站| 中文欧美无线码| 一级毛片我不卡| 两个人免费观看高清视频| 日韩一本色道免费dvd| 国产男女内射视频| 久久精品国产a三级三级三级| 欧美日韩亚洲综合一区二区三区_| 午夜激情久久久久久久| 亚洲美女搞黄在线观看| 亚洲精品久久久久久婷婷小说| 国产成人a∨麻豆精品| 精品一区二区三卡| 日韩制服骚丝袜av| 热re99久久精品国产66热6| 精品国产一区二区三区久久久樱花| 亚洲欧洲日产国产| 伊人久久国产一区二区| 亚洲激情五月婷婷啪啪| 最近手机中文字幕大全| 啦啦啦 在线观看视频| 亚洲国产欧美在线一区| 悠悠久久av| 国产伦人伦偷精品视频| 看免费av毛片| 日韩视频在线欧美| 性少妇av在线| 麻豆精品久久久久久蜜桃| 天天添夜夜摸| 国产99久久九九免费精品| 美女午夜性视频免费| 国产精品一国产av| 亚洲欧美精品综合一区二区三区| 国产在线免费精品| 丰满迷人的少妇在线观看| 国产日韩欧美亚洲二区| 日本av免费视频播放| 无限看片的www在线观看| 一本一本久久a久久精品综合妖精| 七月丁香在线播放| 晚上一个人看的免费电影| 欧美日韩亚洲综合一区二区三区_| 在线观看国产h片| 一区二区三区激情视频| 啦啦啦 在线观看视频| 亚洲国产中文字幕在线视频| 伊人久久国产一区二区| 免费观看a级毛片全部| 在线 av 中文字幕| 美女高潮到喷水免费观看| 国产精品 欧美亚洲| 日韩制服丝袜自拍偷拍| 日本色播在线视频| 麻豆乱淫一区二区| 纵有疾风起免费观看全集完整版| 一本久久精品| 看十八女毛片水多多多| 日本av手机在线免费观看| 男女无遮挡免费网站观看| 久久精品久久久久久噜噜老黄| 国产精品99久久99久久久不卡 | 9热在线视频观看99| 午夜福利免费观看在线| 日韩成人av中文字幕在线观看| 巨乳人妻的诱惑在线观看| 国产欧美日韩综合在线一区二区| 天堂俺去俺来也www色官网| 制服丝袜香蕉在线| 天天躁日日躁夜夜躁夜夜| 深夜精品福利| 国产片内射在线| 国产精品久久久av美女十八| 国产一区二区在线观看av| 一区二区三区激情视频| 午夜日本视频在线| av女优亚洲男人天堂| 夫妻性生交免费视频一级片| 国产免费视频播放在线视频| 深夜精品福利| 久久影院123| 亚洲欧美色中文字幕在线| 最黄视频免费看| 99热全是精品| 天天躁夜夜躁狠狠久久av| 一本久久精品| 国产av精品麻豆| 免费观看性生交大片5| 少妇被粗大的猛进出69影院| 色综合欧美亚洲国产小说| 久久精品国产a三级三级三级| 香蕉国产在线看| 欧美精品亚洲一区二区| 高清黄色对白视频在线免费看| 久久国产亚洲av麻豆专区| 国产午夜精品一二区理论片| 亚洲国产中文字幕在线视频| 国产淫语在线视频| 大码成人一级视频| tube8黄色片| 亚洲欧洲国产日韩| 黑人猛操日本美女一级片| 精品亚洲成a人片在线观看| 亚洲熟女精品中文字幕| 精品国产超薄肉色丝袜足j| 51午夜福利影视在线观看| 日日摸夜夜添夜夜爱| 热99久久久久精品小说推荐| 欧美少妇被猛烈插入视频| 国产成人系列免费观看| 18禁裸乳无遮挡动漫免费视频| 狠狠精品人妻久久久久久综合| 国产精品偷伦视频观看了| 777久久人妻少妇嫩草av网站| 人体艺术视频欧美日本| 99久久99久久久精品蜜桃| 成年人免费黄色播放视频| 青春草亚洲视频在线观看| 日韩视频在线欧美| 啦啦啦在线观看免费高清www| 99久久人妻综合| 亚洲色图 男人天堂 中文字幕| 最近2019中文字幕mv第一页| 天天躁夜夜躁狠狠久久av| 99久国产av精品国产电影| 大陆偷拍与自拍| 国产免费视频播放在线视频| 女人久久www免费人成看片| 丰满乱子伦码专区| 国产精品一二三区在线看| 99国产精品免费福利视频| av网站免费在线观看视频| 欧美另类一区| 国产精品免费视频内射| 亚洲国产看品久久| 满18在线观看网站| 亚洲精品国产一区二区精华液| 丝袜脚勾引网站| 亚洲第一av免费看| 在线观看免费日韩欧美大片| 成年女人毛片免费观看观看9 | 老鸭窝网址在线观看| 多毛熟女@视频| 性色av一级| 精品国产一区二区三区久久久樱花| 夫妻午夜视频| 亚洲精品久久成人aⅴ小说| 亚洲成国产人片在线观看| 人人妻,人人澡人人爽秒播 | √禁漫天堂资源中文www| 国产xxxxx性猛交| 一本色道久久久久久精品综合| 97在线人人人人妻| 最近最新中文字幕免费大全7| 久久人人97超碰香蕉20202| 观看av在线不卡| 亚洲av综合色区一区| 亚洲激情五月婷婷啪啪| 国产乱来视频区| 久久久亚洲精品成人影院| 亚洲一区中文字幕在线| 天天躁夜夜躁狠狠久久av| 亚洲国产精品成人久久小说| 国产精品 国内视频| 久久久久网色| 欧美精品人与动牲交sv欧美| 久热爱精品视频在线9| 国产精品 国内视频| 久久久久精品性色| 久久久久久久久久久久大奶| 日韩 亚洲 欧美在线| 久久免费观看电影| 国产乱来视频区| av在线观看视频网站免费| 最近的中文字幕免费完整| 久久天躁狠狠躁夜夜2o2o | 午夜免费观看性视频| 日本猛色少妇xxxxx猛交久久| 国产精品香港三级国产av潘金莲 | 久久久久网色| 久久久亚洲精品成人影院| 最近2019中文字幕mv第一页| 亚洲精品久久久久久婷婷小说| 一级黄片播放器| 亚洲精品久久久久久婷婷小说| 国产亚洲av高清不卡| 十八禁人妻一区二区| 欧美成人午夜精品| 成人黄色视频免费在线看| 老汉色∧v一级毛片| 欧美人与性动交α欧美精品济南到| 亚洲av综合色区一区| 哪个播放器可以免费观看大片| 999精品在线视频| 亚洲色图 男人天堂 中文字幕| 婷婷成人精品国产| 视频区图区小说| 国产深夜福利视频在线观看| 日韩大片免费观看网站| 日韩 欧美 亚洲 中文字幕| 免费久久久久久久精品成人欧美视频| 另类亚洲欧美激情| 欧美久久黑人一区二区| 国产欧美亚洲国产| av卡一久久| 大陆偷拍与自拍| 嫩草影视91久久| 超碰成人久久| 一区福利在线观看| 午夜av观看不卡| 婷婷色综合www| 高清视频免费观看一区二区| 中文欧美无线码| 亚洲自偷自拍图片 自拍| av视频免费观看在线观看| 观看av在线不卡| 日本欧美国产在线视频| 捣出白浆h1v1| 欧美日韩亚洲国产一区二区在线观看 | 亚洲精品日本国产第一区| 99re6热这里在线精品视频| 亚洲国产av影院在线观看| 丝袜脚勾引网站| 黄色视频不卡| svipshipincom国产片| 中文字幕亚洲精品专区| 久久人妻熟女aⅴ| 欧美精品av麻豆av| 老熟女久久久| 亚洲国产欧美一区二区综合| 国产成人免费无遮挡视频| 日韩精品免费视频一区二区三区| 黄片无遮挡物在线观看| 老司机深夜福利视频在线观看 | xxxhd国产人妻xxx| 涩涩av久久男人的天堂| 十八禁人妻一区二区| 欧美乱码精品一区二区三区| 少妇被粗大的猛进出69影院| 电影成人av| 午夜日韩欧美国产| 久久天堂一区二区三区四区| 色吧在线观看| 久热爱精品视频在线9| 夫妻性生交免费视频一级片| svipshipincom国产片| av.在线天堂| av一本久久久久| 亚洲国产毛片av蜜桃av| 国产极品粉嫩免费观看在线| 国产精品一区二区精品视频观看| 人人妻人人澡人人爽人人夜夜| 欧美精品av麻豆av| 日韩电影二区| 操出白浆在线播放| 亚洲欧美中文字幕日韩二区| 精品酒店卫生间| 久久ye,这里只有精品| av线在线观看网站| 欧美亚洲 丝袜 人妻 在线| 婷婷色综合www| 亚洲男人天堂网一区| 大码成人一级视频| 国产欧美日韩一区二区三区在线| 日韩av不卡免费在线播放| 咕卡用的链子| 深夜精品福利| 精品午夜福利在线看| 黑人巨大精品欧美一区二区蜜桃| 久久99精品国语久久久| 热99国产精品久久久久久7| 在线精品无人区一区二区三| 一边亲一边摸免费视频| 久久人人97超碰香蕉20202| 久久女婷五月综合色啪小说| 久久久久国产一级毛片高清牌| 国产精品蜜桃在线观看| 男女边摸边吃奶| 一本久久精品| 国产在线免费精品| 久久人人爽av亚洲精品天堂| 欧美在线黄色| 欧美精品一区二区免费开放| 国产片特级美女逼逼视频| 国产高清不卡午夜福利| 9色porny在线观看| 午夜福利一区二区在线看| 国产精品亚洲av一区麻豆 | 又大又爽又粗| 欧美国产精品va在线观看不卡| 国产一区二区激情短视频 | 国产精品.久久久| 精品第一国产精品| 精品视频人人做人人爽| 国产成人91sexporn| 亚洲国产欧美日韩在线播放| 亚洲精品视频女| 2021少妇久久久久久久久久久| 亚洲av日韩精品久久久久久密 | 欧美人与性动交α欧美精品济南到| 在线免费观看不下载黄p国产| 久久人妻熟女aⅴ| av国产久精品久网站免费入址| 精品少妇黑人巨大在线播放| √禁漫天堂资源中文www| 亚洲国产毛片av蜜桃av| 日韩精品有码人妻一区| 久久人人爽人人片av| 精品福利永久在线观看| 亚洲欧美清纯卡通| 午夜福利在线免费观看网站| 国产成人免费无遮挡视频| 十八禁网站网址无遮挡| 久久ye,这里只有精品| 午夜福利乱码中文字幕| 亚洲av福利一区| 免费少妇av软件| 精品一区二区免费观看| 成年av动漫网址| 亚洲一卡2卡3卡4卡5卡精品中文| 久久精品久久久久久久性| 日韩av不卡免费在线播放| 在线 av 中文字幕| 国产av码专区亚洲av| 欧美日韩国产mv在线观看视频| 国产一区二区激情短视频 | 国产精品一区二区在线观看99| 观看美女的网站| 亚洲,欧美精品.| 久久久久久久久免费视频了| 1024香蕉在线观看| 免费av中文字幕在线| 日韩一区二区视频免费看| 啦啦啦在线观看免费高清www| 日本欧美视频一区| 色综合欧美亚洲国产小说| 亚洲第一av免费看| 亚洲av福利一区| 赤兔流量卡办理| 人人妻人人添人人爽欧美一区卜| 日韩熟女老妇一区二区性免费视频| 日韩欧美精品免费久久| 成年美女黄网站色视频大全免费| 下体分泌物呈黄色| 亚洲av国产av综合av卡| 亚洲欧美激情在线| 日本午夜av视频| 人人妻,人人澡人人爽秒播 | 最新的欧美精品一区二区| 在现免费观看毛片| 国产成人精品福利久久| 亚洲精品国产色婷婷电影| 国产xxxxx性猛交| 亚洲美女视频黄频| 韩国高清视频一区二区三区| 男的添女的下面高潮视频| 亚洲婷婷狠狠爱综合网| 亚洲人成网站在线观看播放| 最黄视频免费看| 老司机在亚洲福利影院| 大陆偷拍与自拍| 在线观看免费高清a一片| 欧美人与善性xxx| av又黄又爽大尺度在线免费看| 男人舔女人的私密视频| 制服诱惑二区| 99热全是精品| 国产精品久久久久久人妻精品电影 | 国产黄色视频一区二区在线观看| 看免费成人av毛片| 国产精品亚洲av一区麻豆 | 亚洲人成77777在线视频| 在线观看国产h片| 欧美97在线视频| 国产97色在线日韩免费| 丝袜在线中文字幕| 国产黄色免费在线视频| 老司机在亚洲福利影院| 国产在线视频一区二区| 成人影院久久| 国产成人系列免费观看| 午夜av观看不卡| a级片在线免费高清观看视频| 性少妇av在线| 欧美av亚洲av综合av国产av | 国产精品久久久久久久久免| 日韩精品有码人妻一区| 国产精品麻豆人妻色哟哟久久| 2018国产大陆天天弄谢| 男女无遮挡免费网站观看| 欧美少妇被猛烈插入视频| 99re6热这里在线精品视频| 亚洲一码二码三码区别大吗| 久久久久人妻精品一区果冻| 亚洲,欧美,日韩| 91精品国产国语对白视频| 波野结衣二区三区在线| 亚洲欧美清纯卡通| 交换朋友夫妻互换小说| 韩国高清视频一区二区三区| 国产熟女午夜一区二区三区| 国产欧美日韩一区二区三区在线| 日本wwww免费看| 乱人伦中国视频|