恒溫條件下采收時(shí)機(jī)對(duì)鐵皮石斛多糖的影響

王琦+劉京晶+斯金平+朱玉球+秦朗+張菊玲

[摘要]為揭示鐵皮石斛多糖積累的規(guī)律，明確采收時(shí)機(jī)對(duì)鐵皮石斛多糖的影響，該研究在組培室恒溫條件下，于2015年12月至2016年11月預(yù)培養(yǎng)鐵皮石斛D21無性系小苗至1 cm左右，然后轉(zhuǎn)接培養(yǎng)2～5個(gè)月后采收，用苯酚硫酸法測定多糖含量、柱前衍生UPLC分析單糖組分的差異，結(jié)果顯示多糖及其關(guān)鍵組分甘露糖的含量與培養(yǎng)月齡呈正相關(guān)，但各種培養(yǎng)月齡多糖含量均在5—6月份具有峰值，并與大田種植條件下的趨勢吻合，表明即使在組培室恒定條件下，采收季節(jié)仍然顯著影響多糖及其組分的含量，這種植物內(nèi)在調(diào)控的多糖積累動(dòng)態(tài)變化趨勢可能與鐵皮石斛固有的感知四季變化的生命節(jié)律有關(guān)。

[關(guān)鍵詞]鐵皮石斛； 采收季節(jié)； 培養(yǎng)月齡； 多糖； 單糖

[Abstract]In order to reveal the accumulation trend of polysaccharides in Dendrobium catenatum and determine the effect of sampling time on polysaccharides， D Catenatum D21 clone was harvested from January to December after culturing for 2 to 5 months in the growth chamber with constant temperature Polysaccharides were determined by phenolsulfuric acid method and the monosaccharide compositions were analyzed by precolumn derivativeUPLC The results showed that the content of polysaccharide and its key component mannose was positively correlated with the culture time， but the contents of polysaccharides in all kinds of culture peaked from 5 to 6 months， which were consistent with the trend of field planting The results suggested that the trend of polysaccharide accumulation in the plant could be related to the life rhythm of the sensory seasons of D catenatum， which was significantly affected by the harvesting season， even under the constant condition of the culture chamber.

[Key words]Dendrobium catenatum； sampling time； culture time； polysaccharides； monosaccharide composition

鐵皮石斛Dendrobium catenatum （D officinale）[1]是我國傳統(tǒng)名貴中藥材，具有增強(qiáng)免疫力、抗腫瘤、滋陰清熱、益胃生津等功效[2]。20世紀(jì)90年代以來，隨著鐵皮石斛產(chǎn)業(yè)化關(guān)鍵技術(shù)的突破，產(chǎn)業(yè)得到迅速發(fā)展[37]，但目前仍然存在生產(chǎn)周期長、成本高，產(chǎn)品質(zhì)量易受環(huán)境影響等問題，因而有學(xué)者提出組培、發(fā)酵工廠化生產(chǎn)的建議。為此，本文以無菌、恒溫培養(yǎng)的鐵皮石斛無性系為研究對(duì)象，以其主要的功效成分多糖為評(píng)價(jià)指標(biāo)，研究恒溫條件下采收季節(jié)與培養(yǎng)月齡對(duì)鐵皮石斛多糖及其組分的影響，探索鐵皮石斛多糖積累機(jī)制與工廠化生產(chǎn)的可行性。

1材料與方法

11樣品供試材料為鐵皮石斛D21無性系，由浙江農(nóng)林大學(xué)國家林業(yè)局鐵皮石斛工程技術(shù)研究中心自主選育。供試幼苗在接種后在（24±1） ℃，16 h·d-1光照條件下無菌培養(yǎng)。

2015年12月至2016年11月預(yù)培養(yǎng)鐵皮石斛D21無性系小苗至1 cm左右，然后挑選生長狀態(tài)相似，高度約為1 cm的鐵皮石斛組培苗轉(zhuǎn)接于玻璃瓶（直徑55 cm，高105 cm）內(nèi)，每瓶10株。并按此方法處理：每月25日分別對(duì)供試組培苗進(jìn)行轉(zhuǎn)接，共12批次，每一批次包括4個(gè)處理，分別培養(yǎng)2，3，4，5個(gè)月的供試組培苗，每個(gè)處理為30瓶。

12儀器與試劑AB104N電子分析天平（梅特勒托利多儀器上海有限公司）；DKS24型電熱恒溫水浴鍋（上海森信實(shí)驗(yàn)儀器有限公司）；DHG9070型電熱恒溫鼓風(fēng)干燥箱（上海森信實(shí)驗(yàn)儀器有限公司）；紫外可見分光光度計(jì)（Thermo Scientific GENESYS 10s UVVIS）；D37520型高速離心機(jī)（德國Heraeus公司）；Acquity超高效液相色譜儀（PDA檢測器，美國Waters公司）。

重蒸酚（國藥集團(tuán)化學(xué)試劑有限公司）；1苯基3甲基5吡唑啉酮（PMP）為化學(xué)純；甘露糖、鼠李糖、半乳糖醛酸、葡萄糖醛酸、葡萄糖、半乳糖、木糖和阿拉伯糖對(duì)照品全部購于中國食品藥品檢定研究

院（批號(hào)分別為140651200602，111683200401，111646200301，110833200503，02269602，1508200001，1506200203）；其余所用試劑均為分析純；水為蒸餾水。

13多糖含量和單糖組分分析將培養(yǎng)特定時(shí)間后的組培苗取出，洗凈培養(yǎng)基后去除根部和葉片，將莖置于60 ℃烘干至恒重，粉碎，過60目篩，干燥器儲(chǔ)存待用。莖多糖量測定采用苯酚硫酸法，單糖采用柱前衍生方法[5]。色譜條件為：ACQUITY UPLC BEH C18色譜柱（21 nm×150 nm，17 μm）；柱溫30 ℃；流動(dòng)相 002 mmol·L-1乙酸銨乙腈，梯度洗脫；流速 02 mL·min-1；進(jìn)樣量5 μL；檢測波長254 nm。endprint

2結(jié)果與分析

21采收時(shí)機(jī)對(duì)莖多糖量的影響采收季節(jié)和培養(yǎng)月齡對(duì)鐵皮石斛D21莖多糖量存在顯著影響（表1）。不同采收季節(jié)的樣品從整體上看多糖量隨著培養(yǎng)月齡增加而增加。培養(yǎng)月齡相同的D21無性系采收季節(jié)不同其多糖量存在顯著差異，其中5—6月采收多糖量最高，培養(yǎng)月齡3個(gè)月，5月份采收多糖量為943%，超過全年均值5778%；培養(yǎng)月齡4個(gè)月，5月份采收多糖量達(dá)到1183%，超過全年均值5744%；培養(yǎng)月齡5個(gè)月，6月份采收多糖量達(dá)到1327%，超過全年均值5962%。該變異規(guī)律與大田栽培DD21（曾用名6A2B）[7]存在顯著的相關(guān)性（圖1）。這表明在恒定培養(yǎng)條件下，鐵皮石斛多糖含量仍然存在動(dòng)態(tài)變化，且與大田栽培的趨勢一致。

為了確切地反映培養(yǎng)月齡、采收季節(jié)及交互作用對(duì)鐵皮石斛D21多糖量的影響，采用雙因素方差分析，結(jié)果顯示培養(yǎng)月齡、采收季節(jié)及培養(yǎng)月齡×采收季節(jié)交互均對(duì)多糖量存在極顯著影響（表2），其影響大小為培養(yǎng)月齡>采收季節(jié)>培養(yǎng)月齡×采收季節(jié)。

22采收時(shí)機(jī)對(duì)單糖組成的影響供試鐵皮石斛D21單糖衍生后檢測出5種單糖成分，分別為甘露糖、半乳糖醛酸、葡萄糖、半乳糖和阿拉伯糖（圖2）。鐵皮石斛D21多糖中各單糖量在不同采收季節(jié)和培養(yǎng)月齡下均存在明顯差異，其主要組分甘露糖，從整體上看隨培養(yǎng)月齡增長的變化趨勢與多糖量變化一致，培養(yǎng)月齡相同的甘露糖積累較明顯的季節(jié)為5—6月；不同采收季節(jié)單糖含量及其比例存在顯著差異，說明不同采收季節(jié)多糖的組分也存在顯著差異（表3）。

1甘露糖；2鼠李糖；3葡萄糖醛酸；4半乳糖醛酸；5葡萄糖；6半乳糖；7阿拉伯糖。

3結(jié)論與討論

鐵皮石斛D21無性系在組培室恒溫環(huán)境條件下培養(yǎng)，培養(yǎng)月齡、采收季節(jié)（對(duì)應(yīng)自然季節(jié)）均顯著影響多糖量及其組分。培養(yǎng)月齡（苗齡）與多糖及其關(guān)鍵組分甘露糖的含量存在顯著的正相關(guān)，但培養(yǎng)月齡相同、采收季節(jié)不同的鐵皮石斛D21多糖量變化規(guī)律與大田栽培基本一致，在5—6月份多糖含量最高。研究結(jié)果表明在外界條件恒定的情況下，鐵皮石斛多糖含量及其組分仍然具有季節(jié)性的動(dòng)態(tài)變化，這可能由植物內(nèi)在感知季節(jié)規(guī)律的生物鐘調(diào)控有關(guān)。這種多糖積累動(dòng)態(tài)變化，使鐵皮石斛在無菌、恒溫培養(yǎng)條件下周年循環(huán)生產(chǎn)中無法獲得穩(wěn)定多糖產(chǎn)量與組分，從而需要進(jìn)一步探索鐵皮石斛工廠化生產(chǎn)的工藝。

[參考文獻(xiàn)]

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[7]俞巧仙，郭英英，斯金平，等.鐵皮石斛多糖和醇溶性浸出物動(dòng)態(tài)累積規(guī)律研究[J]. 中國中藥雜志，2014，39（24）：4769

[責(zé)任編輯呂冬梅]endprint