• <tr id="yyy80"></tr>
  • <sup id="yyy80"></sup>
  • <tfoot id="yyy80"><noscript id="yyy80"></noscript></tfoot>
  • 99热精品在线国产_美女午夜性视频免费_国产精品国产高清国产av_av欧美777_自拍偷自拍亚洲精品老妇_亚洲熟女精品中文字幕_www日本黄色视频网_国产精品野战在线观看 ?

    骨質疏松腎陽虛和腎陰虛證型下左歸丸含藥血清干預成骨細胞ERK1/2,Wnt/βcatenin信號通路的研究

    2017-11-11 16:03:30章建華邢婧范連霞尹華
    中國中藥雜志 2017年20期
    關鍵詞:左歸丸腎陰虛含藥

    章建華 邢婧 范連霞 尹華

    [摘要]該文研究骨質疏松(OP)腎陽虛和腎陰虛證型下左歸丸含藥血清對成骨細胞增殖和堿性磷酸酶(ALP)表達及對成骨細胞ERK1/2,Wnt/βcatenin信號通路相關因子βcatenin,ERK1,ERK2 mRNA及蛋白表達的作用。采用手術去卵巢法造成大鼠骨質疏松模型,并在手術10周后,分別注射氫化可的松、灌胃甲狀腺素造成大鼠OP腎陽虛及OP腎陰虛模型;用新生24 h乳鼠顱骨體外培養(yǎng)得成骨細胞,以堿性磷酸酶和茜素紅染色進行鑒定,分別用OP腎陽虛、OP腎陰虛及OP組(對照組)所得的左歸丸含藥血清、空白血清干預成骨細胞,采用MTS法檢測細胞增殖情況,ELISA法檢測ALP表達,RTPCR法檢測ERK1/2,βcatenin mRNA的表達,Western blot法檢測ERK1/2,βcatenin蛋白表達。結果表明:OP腎陰虛證型下左歸丸含藥血清在促進成骨細胞增殖、ALP表達、成骨細胞ERK1/2,Wnt/βcatenin信號通路相關因子βcatenin,ERK1,ERK2 mRNA及蛋白表達方面比OP腎陽虛證型下左歸丸含藥血清的作用更強。這與“左歸丸滋腎陰”的中醫(yī)理論相吻合,為臨床辯證治療骨質疏松癥提供科學依據(jù)。左歸丸通過ERK1/2和Wnt/βcatenin信號通路調控成骨細胞的增殖與分化,可能是左歸丸防治骨質疏松腎陰虛證的機制之一。

    [關鍵詞]左歸丸; 成骨細胞; 含藥血清; 骨質疏松腎陽虛; 骨質疏松腎陰虛; Wnt/βcatenin信號通路; ERK1/2信號通路

    [Abstract]To clarify the effects of Zuoguiwan containing serum on osteoblast proliferation and alkaline phosphatase(ALP) expression and its effects on the expression of βcatenin, ERK1, ERK2 mRNA and protein of osteoblast through ERK1/2, Wnt/βcatenin signaling pathway in models with osteoporosis(OP) kidneyYangdeficiency, osteoporosis(OP) kidneyYindeficiency syndrome Rat osteoporosis models were established by ovariectomy surgery, and 10 weeks after surgery, hydrocortisone was injected and thyroxine was administered by intragastric administration to establish OP kidneyYangdeficiency rat model, and OP kidneyYindeficiency rat model Osteoblasts were obtained from 24 h newborn rat skull and were identified by alkaline phosphatase and alizarin red staining Zuoguiwan containing serum of OP, OP kidneyYangdeficiency, and OP kidneyYindeficiency, as well as the blank serum were used to intervene the osteoblast, and the cells proliferation was detected by MTS ELISA assay was used to detect ALP expression RTPCR assay was used to detect the mRNA expression of ERK1, ERK2, βcatenin and protein expression levels were detected by Western blot The results showed that Zuoguiwan containing serum in OP kidneyYindeficiency model had stronger effect than OP kidneyYangdeficiency in promoting osteoblast proliferation, ALP expression, osteoblast ERK1/2, Wnt/βcatenin signaling pathway related factors βcatenin, ERK1, ERK2 mRNA and protein expression levels This was consistent with the TCM theory of "Zuoguiwan nourishes kidney Yin", providing a scientific basis for the clinical and dialectical treatment of osteoporosis Zuoguiwan could regulate the proliferation and differentiation of bone cells by ERK1/2 and Wnt/βcatenin signaling pathway, which may be one of the mechanisms of Zuoguiwan for the prevention of osteoporosis.

    [Key words]Zuoguiwan; osteoblasts; drug containing serum; OP kidneyYangdeficiency; OP kidneyYindeficiency; Wnt/βcatenin signaling pathway; ERK1/2 signaling pathwayendprint

    骨質疏松癥(OP)是機體自然衰老、退化過程的表現(xiàn),以骨量減少,骨小梁變細、斷裂、數(shù)量減少,骨皮質多孔、變薄為特征,并由此導致骨的脆性增高及骨折危險性增加的一種全身性骨代謝性疾病。隨著社會人口老齡化的日趨嚴重,骨質疏松癥已成為常見病。中醫(yī)學將骨質疏松歸屬于“骨痹”[1],認為腎虛是本病的主要病機[28],故中醫(yī)藥治療骨質疏松癥多從補腎入手,實驗室與臨床研究結果均顯示該治療主方向的有效性[3,912]。根據(jù)個體的體征差異,主要有腎陽虛和腎陰虛2種證候。補腎名方左歸丸,始載于明朝張介賓所著《景岳全書》中,方中熟地黃、枸杞、菟絲子、山茱萸、山藥、鹿角膠、龜板膠、牛膝共用,具有滋補腎陰的功效?;谥嗅t(yī)理論辨證論治的思想,本課題借助骨質疏松腎陽、腎陰虛證型制備左歸丸的含藥血清與空白血清,分別干預成骨細胞,通過檢測細胞增殖情況、ALP表達情況以及與ERK1/2,Wnt/βcatenin信號通路相關的各因子mRNA及蛋白表達情況,研究骨質疏松腎陽、腎陰虛證候下左歸丸含藥血清干預成骨細胞ERK1/2,Wnt/βcatenin信號通路作用的差異,從而闡釋左歸丸“辨證”治療骨質疏松癥的作用機制和理論基礎。

    1材料

    11動物清潔級SD大鼠,雌性,體質量(200±20) g,由浙江中醫(yī)藥大學實驗動物中心提供,動物許可證號SCXK(滬)20080016,用于骨質疏松不同證型的制備及含藥血清的制備;新生24 h內乳鼠,用于成骨細胞的分離培養(yǎng)。

    12試藥與試劑熟地黃(130807,產(chǎn)地:河南)、山藥(140226,產(chǎn)地:浙江)、枸杞(140211,產(chǎn)地:寧夏)、山茱萸(131115,產(chǎn)地:浙江)、牛膝(141225,產(chǎn)地:四川)、菟絲子(141204,產(chǎn)地:遼寧)、肉桂(131226,產(chǎn)地:廣西)、鹿角膠(20120103,產(chǎn)地:河南)、龜板膠(20120103,產(chǎn)地:河南),均購自華東醫(yī)藥股份有限公司藥材參茸分公司,經(jīng)浙江中醫(yī)藥大學張如松教授鑒定為正品。

    Ⅰ型膠原酶(Gibco分裝);DMEM高糖型培養(yǎng)液(Hyclone);胎牛血清(Gibco,USA);025%胰酶EDTA(Sigma,USA);001 mol·L-1PBS(吉諾生物醫(yī)藥技術有限公司);紅細胞裂解液(碧云天生物科技);堿性磷酸酶染液(南京建成生物工程研究所);茜素紅(Sigma,USA);MTS(Promaga,0000094244); RIPA裂解液(批號00011401,康為生物);蛋白酶抑制劑混合物(WBP1265,達文生物);ALP含量測定試劑盒(南京建成生物工程研究所);BCA蛋白定量試劑盒(00061311,康為世紀);甘氨酸(amresco,9978c366);十二烷基硫酸鈉(SDS)(amresco2227);AP(amresco0496);TEMED(上海遠慕科技); Trisbase (amresco0497);TBST緩沖液(上海樊克生物); 15 mol·L-1 TrisCl (pH 88),10 mol·L-1TrisCl(pH 68)(碧云天生物科技);5×SDS上樣緩沖液、預染marker(康為世紀);PVDF膜(K4AA7969,Immobilon);1×TAE電泳緩沖液、溴化乙錠溶液(EB)、瓊脂糖、6×加樣緩沖液、細胞總RNA提取試劑盒(杭州寶賽生物,RE02050);Dnase I(Promega,M6101);反轉錄試劑盒(杭州寶賽,RT02020);熒光定量試劑盒(杭州寶賽,PM10003)。Western blot所需抗體見表1。

    13左歸丸藥液的制備按處方量稱取各味藥材,左歸丸:熟地黃24 g、山藥12 g、枸杞12 g、山茱萸12 g、牛膝9 g、菟絲子12 g、龜甲膠12 g、鹿角膠12 g,分別加入10倍量50%乙醇,室溫下浸泡1 h,45 ℃條件下超聲提取30 min,2次,合并藥液,過濾,減壓濃縮至生藥4 g·mL-1,4 ℃保存?zhèn)溆谩?/p>

    14儀器Sartorius BS110S 1/1萬電子天平(德國塞多利斯公司);Heidolph 5804R超速冷凍離心機(德國海道夫公司);KQ5200B型超聲波清洗器(昆山市超聲儀器有限公司);SENCO R系列旋轉蒸發(fā)儀(上海申生科技有限公司);倒置相差顯微鏡(日本Olympus公司);CO2培養(yǎng)箱(德國賽默飛世爾科技有限公司);超凈工作臺(蘇州蘇凈公司);多功能酶標分析儀(德國賽默飛世爾科技有限公司);旋轉式恒溫振蕩儀(江蘇培英公司);Odyssey雙波長成像系統(tǒng)(Licor,美國);電泳儀(BioRad,美國);定量PCR儀(安捷倫,Agilent Stratagene Mx3005P);微量離心機(美國AndyBio公司,AndyBio Mcentrifuge)。

    2方法

    21動物模型的建立與評價取SD雌性大鼠,分成正常組與模型組,正常組行假手術,切除卵巢附近一小塊脂肪,模型組切除雙側卵巢造成骨質疏松模型。將模型組分成OP組、OP腎陰虛組、OP腎陽虛組。OP腎陽虛組于術后10周開始,每日臀部肌肉注射氫化可的松,劑量為0025 mg·g-1,連續(xù)10 d;OP腎陰虛組于術后第10周開始,每日灌胃給予甲狀腺素,劑量為016 mg·g-1,連續(xù)10 d。造模期間觀察記錄OP組、OP腎陰虛組、OP腎陽虛組動物的一般行為狀態(tài)、體質量、肛溫,并且測定血清cAMP和cGMP的含量。由于OP模型的建立方法較為經(jīng)典,故OP模型的確定依據(jù)為病理切片及骨密度檢測,病理切片結果見圖1。

    22新生24 h乳鼠顱骨成骨細胞體外培養(yǎng)頸椎脫臼法處死1日齡乳鼠,75%乙醇浸泡消毒15 min。無菌分離出顱蓋骨,除去附著的血管及結締組織,

    A正常大鼠股骨;B骨質疏松癥大鼠股骨。

    PBS 沖洗3次,剪成1 mm3大小的碎塊,用PBS清洗3次,加入2 mL的025%胰蛋白酶,于37 ℃水浴中預消化30 min,加入等體積的10%胎牛血清DMEM雙抗完全培養(yǎng)基終止消化。棄除消化液,加入濃度為01%Ⅰ型膠原酶5 mL,于37 ℃水浴下,振蕩消化1 h,取上清液置于另一個離心管中,1 000 r·min-1離心5 min 后棄上清液,加入適量完全培養(yǎng)基,制成細胞懸液,剩余的骨片中再繼續(xù)重復振蕩消化1次,混勻2次消化的細胞懸液,接種至培養(yǎng)瓶,endprint

    于37 ℃,含5%CO2,飽和濕度的培養(yǎng)箱內培養(yǎng),3 d后換液去除未貼壁細胞。此后每隔3 d 換液1次,直至細胞約80%融合時按1∶3傳代,反復純化,傳至第3代進行實驗,成骨細胞堿性磷酸酶染色及茜素紅染色結果見圖2。

    A堿性磷酸酶染色;B茜素紅染色。

    23骨質疏松、骨質疏松腎陽、腎陰虛證型下左歸丸含藥血清的制備隨機取OP大鼠、OP兼腎陽虛大鼠、OP兼腎陰虛大鼠各20只,隨機分為2組,一組灌胃純水,另一組灌胃左歸丸藥液。具體方法如下:按照每100 g灌胃15 mL,1 d 2次,連續(xù)6次后,于末次給藥后1 h,心臟取血。4 ℃靜置2 h,于4 ℃,4 000 r·min-1離心25 min,即得,同組血清混合。56 ℃水浴滅活30 min,過膜,儲存于-80 ℃冰箱,備用。臨用前,將血清用DMEM雙抗基礎培養(yǎng)基(不含F(xiàn)BS)稀釋成各所需濃度。

    24不同狀態(tài)下左歸丸含藥血清對成骨細胞增殖的影響取生長良好的第3代成骨細胞,以3 000個/孔接種于96孔板中,24 h貼壁后,更換成含2% FBS的DMEM培養(yǎng)液饑餓培養(yǎng),使細胞同步化;24 h后,更換成各組左歸丸含藥血清與空白血清。每組設置6個復孔,繼續(xù)培養(yǎng)72 h后,吸棄舊的培養(yǎng)液,PBS沖洗2次,并于每孔中加入100 μL基礎培養(yǎng)液(不含F(xiàn)BS),再加入20 μL MTS,于37 ℃,5%CO2,飽和濕度細胞培養(yǎng)箱中繼續(xù)避光培養(yǎng)2 h,酶標儀上490 nm測定吸光度(A)。

    25不同證型左歸丸含藥血清對成骨細胞ALP表達的影響取第3代成骨細胞,以5萬個/孔接種于24孔板中,24 h貼壁后,更換成含2%FBS的培養(yǎng)液饑餓24 h,分別加入各種證候下的左歸丸含藥血清與空白血清,每組設6孔。72 h后,吸取細胞培養(yǎng)上清液,4 ℃,1 500 r·min-1離心20 min,取上清,用堿性磷酸酶試劑盒測定堿性磷酸酶表達情況。

    26RTPCR法檢測成骨細胞βcatenin,ERK1,ERK2 mRNA表達取第3代成骨細胞,以5萬個/孔接種于24孔板中按25項下方法進行干預,每組3瓶。72 h后,用Trizol試劑盒提取細胞總RNA。用RTPCR試劑盒采用二步法將其逆轉錄成cDNA,以不同引物進行RTPCR,檢測樣品中ERK1,ERK2,βcatenin基因mRNA表達情況,以βactin作為內參基因,引物序列見表2。

    27Western blot法測定成骨細胞βcatenin,ERK1,ERK2蛋白表達取第3代成骨細胞,以1×106個/瓶的密度接種于25 cm2細胞培養(yǎng)瓶中,按25項下方法進行干預,每組3瓶。72 h后,胰酶消化下細胞,移至15 mL離心管。每瓶細胞加250~500 μL RIPA裂解液,14 000 r·min-1,4 ℃,離心30 min,收獲蛋白,測定蛋白濃度。用SDSPAGE電泳

    分離蛋白,將蛋白轉移至PVDF膜上。5%脫脂奶粉室溫下封閉2 h,一抗室溫振搖孵育2 h,4 ℃過夜,二抗室溫振搖孵育2 h。用增強型DAB底物顯色試劑盒進行顯影,將PVDF膜進行掃描。用蛋白圖像分析軟件檢測條帶灰度值,計算蛋白相對表達量。

    28統(tǒng)計學處理采用SPSS 160統(tǒng)計軟件進行數(shù)據(jù)分析,計量數(shù)據(jù)以±s表示,t檢驗進行分析,P<005表示具有統(tǒng)計學意義。

    3結果

    31不同證型下左歸丸含藥血清對成骨細胞增殖的影響OP,OP腎陰虛,OP腎陽虛左歸丸含藥血清與相應狀態(tài)下的空白血清比較,均能促進成骨細胞增殖,且具有顯著性差異(P<005),其中OP腎陰虛左歸丸含藥血清對成骨細胞增殖的促進作用最強,見表3。

    32不同證型下左歸丸含藥血清對成骨細胞ALP表達的影響OP,OP腎陰虛,OP腎陽虛左歸丸含藥血清與相應狀態(tài)下的空白血清比較,均能促進成骨細胞培養(yǎng)上清液中ALP表達,且具有顯著性差異(P<005),其中OP腎陰虛左歸丸含藥血清對成骨細胞培養(yǎng)上清液中ALP表達的促進作用最強,見表4。

    33不同證型左歸丸含藥血清干預成骨細胞ERK1/2,Wnt/βcatenin信號通路相關因子mRNA表達的影響OP,OP腎陰虛,OP腎陽虛左歸丸含藥血清均能上調βcatenin,ERK2 mRNA的表達,其中OP,OP腎陰虛左歸丸含藥血清,與相應證型下的空白血清比較,具有顯著性差異(P<005);OP,OP腎陰虛左歸丸含藥血清能上調ERK2 mRNA的表達,與相應證型下的空白血清比較,具有顯著性差異(P<005);OP腎陽虛左歸丸含藥血清,與相應證型下的空白血清比較,反而抑制ERK2 mRNA的表達。與OP腎陽虛左歸丸含藥血清比較,OP腎陰虛左歸丸含藥血清組能夠顯著上調βcatenin,ERK1,ERK2 mRNA的表達(P<005)。與OP左歸丸含藥血清比較,OP腎陰虛左歸丸含藥血清能夠顯著上調ERK1,ERK2 mRNA的表達(P<005),但對βcatenin的作用無明顯差異,見表5。

    34不同證型左歸丸含藥血清干預成骨細胞ERK1/2,Wnt/βcatenin信號通路相關因子蛋白表達的影響OP,OP腎陰虛、OP腎陽虛左歸丸含藥血清均能上調βcatenin,ERK1,ERK2蛋白的表達,其中OP,OP腎陰虛左歸丸含藥血清在上調βcatenin蛋白表達方面,與相應證候下的空白血清比較,具有顯著性差異(P<005),OP腎陽虛左歸丸含藥血清在上調ERK2蛋白表達方面,與相應證候下的空白血清比較,具有顯著性差異(P<005)。與OP腎陽虛左歸丸含藥血清比較,OP腎陰虛左歸丸含藥血清能顯著上調βcatenin蛋白的表達(P<005),亦能上調ERK1,ERK2蛋白的表達,但無顯著性差異,見表6及圖3。

    A,B,COP、OP腎陰虛、OP腎陽虛證候下的左歸丸含藥血清;A1,B1,C1為相應證候下的空白血清。endprint

    4討論

    隨著對骨質疏松癥病因病機認識的發(fā)展,已知Wnt,BMP,MAPK和Hedgehog多種信號通路與疾病的形成發(fā)展有關。目前研究較多的是經(jīng)典Wnt信號通路(即Wnt/βcatenin信號通路)和ERK1/2信號通路[1415]。βcatenin由130個氨基酸殘基構成,存在于細胞質、細胞膜和細胞核中,且以細胞質中含量最多[16]。βcatenin是經(jīng)典Wnt信號通路中關鍵的中樞性因子,調節(jié)其在胞內的穩(wěn)定的積累對通路的激活至關重要。當細胞質內的βcatenin積累到一定量后,進而進入細胞核內,促進基因的轉錄。βcatenin在成骨細胞中存在廣泛的表達,能促進成骨細胞的分化與存活。ERK1/2信號通路是目前研究的最為透徹的促分裂原活化蛋白激酶(MAPKA)通路,它是多數(shù)生長因子、細胞因子調控細胞增殖的重要途徑[17]。袁曉軍等[18]在探討小鼠成骨細胞暴露于金屬鈷、鉻離子條件下對RANKL表達的影響及ERK信號通路在這一過程中作用,尋找防治假體周圍骨溶解的方法的實驗中發(fā)現(xiàn)金屬離子可刺激成骨細胞RANKL mRNA的表達并促進RANKL蛋白的分泌;ERK信號通路抑制劑PD98059可一定程度抑制RANKL的表達,從側面證實了兩者之間的聯(lián)系。

    OP腎陰虛左歸丸含藥血清對成骨細胞增殖、ALP活性、βcatenin,ERK1,ERK2蛋白及mRNA的表達的促進作用最強。作者認為可能原因如下:左歸丸以熟地黃為君藥,有研究表明[23]熟地黃中主要有效成分梓醇在較低濃度時可以促進成骨細胞增殖;以山茱萸、山藥、枸杞為臣藥,亦有研究表明這些中藥的有效成分對成骨細胞增殖及ALP活性有一定的促進作用[1921]。作者推測左歸丸含藥血清是通過以上這些成分發(fā)揮對成骨細胞促增殖、促進ALP活性及相關因子蛋白及mRNA表達的作用,且這些成分在OP腎陰虛狀態(tài)下發(fā)揮最佳效果,并且這種作用是通過干預Wnt/βcatenin信號通路和ERK1/2信號而產(chǎn)生的。但目前關于這些成分如梓醇、馬錢苷、莫諾苷等抗骨質疏松的體外實驗(對成骨細胞作用)和整體研究報道較少,缺少相關對照,還需進一步深入研究。

    [參考文獻]

    [1]韋堅義祖國醫(yī)學對骨質疏松癥的認識[J]. 浙江中醫(yī)學院學報,1992,16(5):9.

    [2]李晴晴,潘智敏原發(fā)性骨質疏松癥中醫(yī)病變機制的研究進展[J]. 浙江中醫(yī)雜志,2010,45(2):147.

    [3]張穎,Gary Guishan Xiao,榮培晶,等. 杜仲、千年健對去卵巢大鼠骨質疏松癥的治療作用及其機理探討[J]. 中國中醫(yī)基礎醫(yī)學雜志,2011,17(9):960.

    [4]王翔,趙詠芳,石印玉,等. 健脾方對去勢大鼠維生素D代謝的影響[J]. 中國骨質疏松雜志,2007,13(6):423.

    [5]文利,齊亮,陳平國,等. 健脾養(yǎng)骨湯合用溫針治療骨質疏松癥臨床研究[J]. 長春中醫(yī)藥大學學報,2011,27(4):533.

    [6]支英杰,謝雁鳴,徐桂琴傳統(tǒng)醫(yī)學對絕經(jīng)后骨質疏松癥病因病機的認識[J]. 遼寧中醫(yī)藥大學學報,2010,12(6):144.

    [7]趙治友,鄔亞軍骨質疏松癥的中醫(yī)辨證思路與治法研究[J]. 浙江中醫(yī)藥大學學報,2007,31(3):275.

    [8]韓秀文,王進 心腎相交理論對治療骨質疏松癥指導作用的研究[J]. 湖北中醫(yī)雜志,2011,33(6):32.

    [9]王昭洪,曾濤補腎中藥治療骨質疏松的實驗進展[J]. 環(huán)球中醫(yī)藥, 2011, 4(3):235.

    [10]王新祥,張允嶺,黃啟福對骨質疏松癥中醫(yī)主要病機和現(xiàn)代病因學的認識與探討[J]. 中西醫(yī)結合學報, 2010,8(12):1119.

    [11]梁建明原發(fā)性骨質疏松癥的中醫(yī)認識與治療[J]. 臨床合理用藥, 2011,4(7B):172.

    [12]鄭洪新,燕燕,王思程,等. “腎藏精主髓生骨”藏象理論研究——腎虛骨質疏松癥大鼠轉化生長因子相關基因與蛋白表達的異常[J]. 世界科學技術——中醫(yī)藥現(xiàn)代化,2010,12(1):57.

    [13]孫暉,張寧,李麗靜,等. 六味地黃丸主要血中移行成分對培養(yǎng)大鼠成骨細胞促進增殖作用的研究[J]. 中國中藥雜志,2008,33(17):2161.

    [14]許應星,吳承亮,吳巖,等. Wnt/βcatenin信號通路相關蛋白在補腎活血顆粒含藥血清影響成骨細胞過程中的表達及意義[J]. 中國中西醫(yī)結合雜志,2011,31(4):537.

    [15]董世武,應大君MAPK信號轉導在成骨細胞分化中的作用[J]. 國外醫(yī)學·分子生物學分冊,2003,25(1):37.

    [16]任翔,吳劍,李嘉航,等. Wnt/βcatenin通路在成骨細胞中的作用[J]. 現(xiàn)代生物醫(yī)學進展, 2014,14(25):4991.

    [17]鄒薇,劉慧通,焦富勇ERK信號傳導通路在人臍帶間充質干細胞向成骨細胞分化作用中的研究進展[J]. 中國美容醫(yī)學, 2010,19(9): 1569.

    [18]袁曉軍,戴閩,艾江波,等. ERK信號通路調節(jié)金屬離子誘導成骨細胞RANKL表達的實驗研究[J]. 骨科,2010,1(1):5.

    [19]江洋珍,王俊俊,梁繼超,等. 薯蕷皂苷元對大鼠成骨細胞增殖、分化及OPG/RANKL mRNA表達的影響[J]. 中華中醫(yī)藥雜志,2010,25(1):134.

    [20]徐鋼,裴啟洋,鞠成國,等. CCK8法檢測狗脊不同炮制品對成骨細胞的影響[J]. 中國中藥雜志,2013,38(24):4319.

    [21]武密山,趙素芝,李恩,等. 地黃活性成分梓醇對大鼠成骨細胞MC3T3E1增殖、分化和礦化的影響[J]. 中國藥理學通報,2010,26(4):509

    [責任編輯張寧寧]endprint

    猜你喜歡
    左歸丸腎陰虛含藥
    自擬安更湯對腎陰虛型圍絕經(jīng)期綜合征患者癥狀改善及性激素水平的影響
    Protective effects of Zuogui Jiangtang Jieyu Formula on hippocampal neurons in rats of diabetes complicated with depression via the TRP/KYN metabolic pathway
    龜甲膠對腎陰虛大鼠抗氧化活性和Bax、Bcl-2蛋白表達的影響
    Zuogui Wan(左歸丸)improves trabecular bone microarchitecture in ovariectomy-induced osteoporosis rats by regulating orexin-A and orexin receptors
    急救含藥姿勢要正確
    乳病消片含藥血清對MCF-7細胞增殖的抑制作用
    中成藥(2018年10期)2018-10-26 03:40:44
    腎陰虛
    大家健康(2016年8期)2016-12-26 16:04:06
    左歸丸對化療致卵巢早衰小鼠卵巢功能的影響
    中成藥(2016年4期)2016-05-17 06:07:30
    左歸丸上調雷公藤多苷誘導卵巢功能低下大鼠卵巢PLGF及Flt-1水平
    冠心II號含藥血清對心肌缺血再灌注樣損傷的保護作用
    久久精品夜色国产| 亚洲中文av在线| 欧美精品人与动牲交sv欧美| av又黄又爽大尺度在线免费看| 久久久久久久精品精品| 亚洲欧美一区二区三区国产| 日本欧美视频一区| 女人久久www免费人成看片| 这个男人来自地球电影免费观看 | 成人特级av手机在线观看| 一级毛片我不卡| 纯流量卡能插随身wifi吗| a级片在线免费高清观看视频| 亚洲欧美一区二区三区黑人 | 久久这里有精品视频免费| 在线天堂最新版资源| 精品久久久久久久久亚洲| 99九九线精品视频在线观看视频| 国产中年淑女户外野战色| 在线观看人妻少妇| 老司机影院毛片| 国产一区二区在线观看日韩| 91精品国产国语对白视频| 亚洲成人一二三区av| 人人妻人人看人人澡| 边亲边吃奶的免费视频| √禁漫天堂资源中文www| 国产精品久久久久成人av| 高清毛片免费看| 不卡视频在线观看欧美| av播播在线观看一区| 91久久精品国产一区二区三区| 五月天丁香电影| 乱码一卡2卡4卡精品| 成人免费观看视频高清| 菩萨蛮人人尽说江南好唐韦庄| 久久97久久精品| 欧美3d第一页| 亚洲性久久影院| 久久久午夜欧美精品| 午夜久久久在线观看| 一本一本综合久久| 成人美女网站在线观看视频| 欧美精品一区二区大全| 成人特级av手机在线观看| 日韩 亚洲 欧美在线| 青春草视频在线免费观看| 欧美日韩一区二区视频在线观看视频在线| 国产精品人妻久久久影院| 国语对白做爰xxxⅹ性视频网站| 纯流量卡能插随身wifi吗| 国产欧美亚洲国产| www.色视频.com| 毛片一级片免费看久久久久| 新久久久久国产一级毛片| 国产精品一区二区在线观看99| 又大又黄又爽视频免费| 最后的刺客免费高清国语| 黑人巨大精品欧美一区二区蜜桃 | 一级片'在线观看视频| 一区二区三区乱码不卡18| 精品亚洲乱码少妇综合久久| 亚洲中文av在线| 日韩不卡一区二区三区视频在线| 欧美日韩国产mv在线观看视频| 国产深夜福利视频在线观看| 精品酒店卫生间| av福利片在线| 日韩欧美精品免费久久| 国产日韩欧美亚洲二区| 纵有疾风起免费观看全集完整版| 久久ye,这里只有精品| 国产精品国产三级国产专区5o| 另类亚洲欧美激情| 成人黄色视频免费在线看| 人人妻人人添人人爽欧美一区卜| 特大巨黑吊av在线直播| av天堂中文字幕网| 亚洲av福利一区| 亚洲av免费高清在线观看| 午夜影院在线不卡| 亚洲国产精品一区二区三区在线| av一本久久久久| 亚洲欧美日韩另类电影网站| 国产成人精品福利久久| 99久久中文字幕三级久久日本| 精品久久久精品久久久| 在线观看人妻少妇| 午夜日本视频在线| 日本av手机在线免费观看| 亚洲成人一二三区av| 久久鲁丝午夜福利片| 日韩中字成人| 嫩草影院入口| 在线观看人妻少妇| 国产黄色免费在线视频| 高清不卡的av网站| 老女人水多毛片| 三级国产精品欧美在线观看| av天堂久久9| 美女视频免费永久观看网站| 99精国产麻豆久久婷婷| 一本—道久久a久久精品蜜桃钙片| 我要看黄色一级片免费的| 国产日韩欧美在线精品| 亚洲精品亚洲一区二区| 黄色毛片三级朝国网站 | 多毛熟女@视频| 国产日韩欧美视频二区| 久久久久久久久久成人| 亚洲国产精品专区欧美| 水蜜桃什么品种好| 日韩,欧美,国产一区二区三区| 日韩中字成人| 国产精品嫩草影院av在线观看| 日韩电影二区| 亚洲精品,欧美精品| 亚洲欧美日韩卡通动漫| 国产成人精品一,二区| 人妻夜夜爽99麻豆av| 有码 亚洲区| 亚洲欧美日韩另类电影网站| 国产白丝娇喘喷水9色精品| 亚洲伊人久久精品综合| 黄色视频在线播放观看不卡| 伊人久久精品亚洲午夜| 97超视频在线观看视频| 天堂俺去俺来也www色官网| 精品少妇黑人巨大在线播放| 成人国产av品久久久| 亚洲av不卡在线观看| 成人亚洲精品一区在线观看| 免费不卡的大黄色大毛片视频在线观看| 国产精品熟女久久久久浪| 亚洲丝袜综合中文字幕| 免费播放大片免费观看视频在线观看| 国产精品久久久久久精品电影小说| 赤兔流量卡办理| 街头女战士在线观看网站| av在线播放精品| 国产在线一区二区三区精| av.在线天堂| 国产成人精品婷婷| 性色av一级| 久久精品国产亚洲av涩爱| 最新中文字幕久久久久| 久久久久精品性色| 九草在线视频观看| 久久久国产一区二区| 亚洲精品成人av观看孕妇| 一个人看视频在线观看www免费| 久久精品久久久久久噜噜老黄| 一级毛片我不卡| 秋霞伦理黄片| 又大又黄又爽视频免费| 国产中年淑女户外野战色| 十八禁网站网址无遮挡 | 日韩一区二区视频免费看| 如日韩欧美国产精品一区二区三区 | 97超视频在线观看视频| 三级国产精品片| 黄色配什么色好看| 七月丁香在线播放| 麻豆精品久久久久久蜜桃| www.av在线官网国产| 七月丁香在线播放| 免费看日本二区| 你懂的网址亚洲精品在线观看| 免费久久久久久久精品成人欧美视频 | 3wmmmm亚洲av在线观看| 麻豆成人午夜福利视频| 免费看光身美女| 色婷婷av一区二区三区视频| 国产无遮挡羞羞视频在线观看| 亚洲中文av在线| 国产男人的电影天堂91| 自线自在国产av| 女人久久www免费人成看片| 国产精品国产三级专区第一集| 最近中文字幕高清免费大全6| 在线免费观看不下载黄p国产| 日韩欧美一区视频在线观看 | 老女人水多毛片| 日产精品乱码卡一卡2卡三| 一二三四中文在线观看免费高清| 亚洲人成网站在线观看播放| 亚洲一级一片aⅴ在线观看| 狂野欧美白嫩少妇大欣赏| 亚洲中文av在线| 国产亚洲欧美精品永久| 蜜桃久久精品国产亚洲av| 天堂中文最新版在线下载| 亚洲情色 制服丝袜| av线在线观看网站| av不卡在线播放| 久久久欧美国产精品| 草草在线视频免费看| 亚洲国产精品成人久久小说| 亚洲成色77777| 免费久久久久久久精品成人欧美视频 | 色婷婷av一区二区三区视频| 亚洲成人一二三区av| 高清午夜精品一区二区三区| a级毛片免费高清观看在线播放| 黑人巨大精品欧美一区二区蜜桃 | 亚洲电影在线观看av| 亚洲欧洲精品一区二区精品久久久 | 最近2019中文字幕mv第一页| 一级毛片黄色毛片免费观看视频| 亚洲av电影在线观看一区二区三区| 天堂俺去俺来也www色官网| 人体艺术视频欧美日本| 午夜免费鲁丝| 久久这里有精品视频免费| 国产极品粉嫩免费观看在线 | 婷婷色av中文字幕| 欧美精品一区二区大全| 午夜福利影视在线免费观看| 国产一区二区三区综合在线观看 | 国产成人免费观看mmmm| 美女视频免费永久观看网站| 亚洲av中文av极速乱| 嫩草影院入口| 国产一区二区三区综合在线观看 | 国产成人91sexporn| 日韩一区二区三区影片| 国产免费一级a男人的天堂| 嫩草影院新地址| 久久国产精品男人的天堂亚洲 | 只有这里有精品99| 老司机亚洲免费影院| 99国产精品免费福利视频| 18禁裸乳无遮挡动漫免费视频| 超碰97精品在线观看| 在线看a的网站| 免费观看性生交大片5| 日韩一区二区视频免费看| 九九久久精品国产亚洲av麻豆| 51国产日韩欧美| 国产白丝娇喘喷水9色精品| av一本久久久久| 91成人精品电影| 少妇人妻一区二区三区视频| 韩国av在线不卡| 亚洲电影在线观看av| 精品少妇久久久久久888优播| 在线观看一区二区三区激情| 亚洲av成人精品一二三区| 狂野欧美激情性bbbbbb| 亚洲第一区二区三区不卡| 观看美女的网站| 久久精品熟女亚洲av麻豆精品| 草草在线视频免费看| 国产视频内射| 久久久久久久久久久久大奶| 高清欧美精品videossex| 国产精品99久久久久久久久| 成人特级av手机在线观看| 91成人精品电影| 日本午夜av视频| 黄色视频在线播放观看不卡| 国产免费福利视频在线观看| 国产在视频线精品| 一个人看视频在线观看www免费| 日本猛色少妇xxxxx猛交久久| 久久精品国产鲁丝片午夜精品| 国产午夜精品久久久久久一区二区三区| 久久久久网色| 永久网站在线| 午夜老司机福利剧场| 亚洲性久久影院| 国产亚洲欧美精品永久| 观看免费一级毛片| 日本wwww免费看| 国产无遮挡羞羞视频在线观看| 欧美精品人与动牲交sv欧美| 在线 av 中文字幕| 国产有黄有色有爽视频| videossex国产| 亚洲性久久影院| 色哟哟·www| 免费黄网站久久成人精品| 在线观看免费日韩欧美大片 | h视频一区二区三区| 亚洲国产av新网站| 内地一区二区视频在线| 日本色播在线视频| 国产精品国产三级国产专区5o| 国产成人精品无人区| 亚洲成人手机| 黄色一级大片看看| 欧美日韩视频高清一区二区三区二| 大又大粗又爽又黄少妇毛片口| 色婷婷av一区二区三区视频| 久久久久久久久久久丰满| 一区在线观看完整版| 亚洲国产色片| 永久网站在线| 亚洲av免费高清在线观看| 国产男女超爽视频在线观看| 91精品国产国语对白视频| 欧美+日韩+精品| 国产男女内射视频| 一级毛片aaaaaa免费看小| 最近最新中文字幕免费大全7| 极品教师在线视频| av免费观看日本| 建设人人有责人人尽责人人享有的| 高清黄色对白视频在线免费看 | 亚洲av国产av综合av卡| 简卡轻食公司| 午夜福利网站1000一区二区三区| 国产亚洲精品久久久com| 老司机影院毛片| 中文字幕av电影在线播放| 欧美老熟妇乱子伦牲交| 国产视频首页在线观看| 国产在线男女| 国产精品人妻久久久影院| 新久久久久国产一级毛片| 成人国产麻豆网| 久热久热在线精品观看| 精品久久久久久久久亚洲| 丰满饥渴人妻一区二区三| 精品人妻偷拍中文字幕| 简卡轻食公司| 天天躁夜夜躁狠狠久久av| 欧美 亚洲 国产 日韩一| 国产男女超爽视频在线观看| 99九九在线精品视频 | 99久国产av精品国产电影| 亚洲精品一二三| 婷婷色综合大香蕉| 国产精品久久久久久精品古装| 国产av码专区亚洲av| 狂野欧美激情性xxxx在线观看| 国产日韩欧美在线精品| 啦啦啦在线观看免费高清www| 国产乱人偷精品视频| 精品国产乱码久久久久久小说| 久久99热6这里只有精品| 婷婷色麻豆天堂久久| 亚洲国产色片| a级毛片在线看网站| 曰老女人黄片| 交换朋友夫妻互换小说| 国产精品久久久久久精品电影小说| 午夜福利在线观看免费完整高清在| 99久久综合免费| 三级经典国产精品| 成人无遮挡网站| 夫妻性生交免费视频一级片| 王馨瑶露胸无遮挡在线观看| 一本—道久久a久久精品蜜桃钙片| 亚洲av在线观看美女高潮| 国产一区二区在线观看日韩| 高清毛片免费看| 又大又黄又爽视频免费| 欧美成人精品欧美一级黄| 亚洲精品日韩av片在线观看| 三上悠亚av全集在线观看 | 午夜影院在线不卡| 日韩av免费高清视频| 亚洲第一av免费看| 午夜激情久久久久久久| 国产淫语在线视频| 夫妻午夜视频| 免费看不卡的av| 国产视频首页在线观看| 色5月婷婷丁香| 噜噜噜噜噜久久久久久91| 蜜桃在线观看..| 噜噜噜噜噜久久久久久91| 97超碰精品成人国产| 亚洲精品国产成人久久av| 日本欧美视频一区| 夫妻午夜视频| 久久av网站| 少妇裸体淫交视频免费看高清| 亚洲在久久综合| 日本爱情动作片www.在线观看| 亚洲国产日韩一区二区| 大片免费播放器 马上看| 五月开心婷婷网| 亚洲成人手机| 精品熟女少妇av免费看| 久久久久网色| 这个男人来自地球电影免费观看 | 99国产精品免费福利视频| 天美传媒精品一区二区| 黄色配什么色好看| videossex国产| 全区人妻精品视频| 老司机影院成人| 我的老师免费观看完整版| 在线 av 中文字幕| 午夜日本视频在线| 久热久热在线精品观看| 精品久久久久久电影网| 国产亚洲av片在线观看秒播厂| 国产成人免费观看mmmm| 在线观看一区二区三区激情| √禁漫天堂资源中文www| 两个人免费观看高清视频 | 亚洲成色77777| 最后的刺客免费高清国语| 久久人妻熟女aⅴ| 2021少妇久久久久久久久久久| 国产精品一区二区性色av| 水蜜桃什么品种好| 街头女战士在线观看网站| 亚洲国产欧美日韩在线播放 | 久久狼人影院| 在线观看国产h片| a级片在线免费高清观看视频| 视频中文字幕在线观看| 色94色欧美一区二区| 好男人视频免费观看在线| 一级毛片黄色毛片免费观看视频| 人妻少妇偷人精品九色| 亚洲精品久久久久久婷婷小说| 另类精品久久| 国产一区二区在线观看av| 又爽又黄a免费视频| 十分钟在线观看高清视频www | 美女国产视频在线观看| 亚洲国产毛片av蜜桃av| 精品一区在线观看国产| 日韩,欧美,国产一区二区三区| 国产精品久久久久久av不卡| 欧美xxⅹ黑人| 国产日韩欧美视频二区| 国产极品粉嫩免费观看在线 | 久久久欧美国产精品| 久久ye,这里只有精品| 亚洲久久久国产精品| 久久精品久久精品一区二区三区| 色网站视频免费| 老司机影院成人| 午夜日本视频在线| 亚洲av不卡在线观看| 亚洲国产av新网站| 中文字幕久久专区| 美女xxoo啪啪120秒动态图| 精品少妇黑人巨大在线播放| 国模一区二区三区四区视频| av.在线天堂| 熟女人妻精品中文字幕| 街头女战士在线观看网站| 午夜精品国产一区二区电影| 亚洲精品色激情综合| 赤兔流量卡办理| 校园人妻丝袜中文字幕| 免费av不卡在线播放| 一本一本综合久久| 久久99精品国语久久久| 中文字幕免费在线视频6| 成人国产av品久久久| 国产免费福利视频在线观看| 久久久久国产精品人妻一区二区| 婷婷色综合大香蕉| 国产精品麻豆人妻色哟哟久久| 免费久久久久久久精品成人欧美视频 | av国产精品久久久久影院| 国产白丝娇喘喷水9色精品| 久久国内精品自在自线图片| 日韩一本色道免费dvd| 男人狂女人下面高潮的视频| 女人精品久久久久毛片| 秋霞伦理黄片| av在线播放精品| 肉色欧美久久久久久久蜜桃| 狂野欧美激情性bbbbbb| 少妇丰满av| 欧美精品高潮呻吟av久久| av一本久久久久| 亚洲国产日韩一区二区| 欧美 亚洲 国产 日韩一| 亚洲一区二区三区欧美精品| 精品99又大又爽又粗少妇毛片| 国产成人免费观看mmmm| 欧美变态另类bdsm刘玥| 久久99热这里只频精品6学生| 免费av不卡在线播放| 麻豆成人午夜福利视频| 哪个播放器可以免费观看大片| 乱人伦中国视频| 亚州av有码| 人人妻人人看人人澡| 免费观看无遮挡的男女| 在线看a的网站| 色视频www国产| 极品人妻少妇av视频| 中文字幕久久专区| 国产黄片视频在线免费观看| 天堂中文最新版在线下载| 免费在线观看成人毛片| 国内揄拍国产精品人妻在线| 国产色婷婷99| 嫩草影院新地址| 欧美三级亚洲精品| 欧美丝袜亚洲另类| 亚洲一级一片aⅴ在线观看| kizo精华| 99九九在线精品视频 | 午夜精品国产一区二区电影| 久久人人爽人人爽人人片va| 免费看光身美女| 国产亚洲精品久久久com| 一区二区三区精品91| 亚洲av在线观看美女高潮| 亚洲欧洲日产国产| 日本黄色日本黄色录像| 日韩亚洲欧美综合| 亚洲美女黄色视频免费看| 国产乱人偷精品视频| 久久久精品94久久精品| 久久女婷五月综合色啪小说| 欧美xxxx性猛交bbbb| 视频区图区小说| 精品一区二区三卡| 啦啦啦中文免费视频观看日本| 成年美女黄网站色视频大全免费 | 国产成人freesex在线| 亚洲va在线va天堂va国产| 国产极品天堂在线| videos熟女内射| 成人18禁高潮啪啪吃奶动态图 | 婷婷色麻豆天堂久久| 乱人伦中国视频| 国产亚洲最大av| av天堂中文字幕网| 国产日韩欧美视频二区| 国产成人免费观看mmmm| 日日摸夜夜添夜夜添av毛片| 成人无遮挡网站| 亚洲精品久久久久久婷婷小说| 伊人久久国产一区二区| 中国国产av一级| 熟女电影av网| 99热这里只有是精品在线观看| 我的女老师完整版在线观看| 亚洲欧美成人精品一区二区| 亚洲欧美清纯卡通| 午夜av观看不卡| 国产高清三级在线| 青青草视频在线视频观看| 天堂中文最新版在线下载| 国产一级毛片在线| xxx大片免费视频| 国产亚洲精品久久久com| 国产精品福利在线免费观看| 亚洲av成人精品一区久久| 亚洲情色 制服丝袜| 欧美三级亚洲精品| 欧美成人精品欧美一级黄| 国产男女内射视频| 人人妻人人澡人人爽人人夜夜| 国产精品久久久久成人av| 亚洲天堂av无毛| 免费人成在线观看视频色| 国精品久久久久久国模美| 精品人妻偷拍中文字幕| 日日啪夜夜爽| 在线观看国产h片| 欧美三级亚洲精品| 特大巨黑吊av在线直播| 欧美另类一区| 精品国产一区二区三区久久久樱花| 99热全是精品| 久久久久视频综合| 国产欧美亚洲国产| 狂野欧美白嫩少妇大欣赏| 亚洲综合色惰| 内射极品少妇av片p| 国产精品久久久久久精品电影小说| 人人妻人人澡人人看| kizo精华| 男人和女人高潮做爰伦理| av免费观看日本| 两个人免费观看高清视频 | 日韩av在线免费看完整版不卡| 97在线人人人人妻| 成人漫画全彩无遮挡| 大话2 男鬼变身卡| 成年av动漫网址| 97超视频在线观看视频| 国产欧美亚洲国产| 99热6这里只有精品| 亚洲精品乱久久久久久| 久久久久国产网址| 午夜激情福利司机影院| 桃花免费在线播放| 麻豆成人av视频| 日韩亚洲欧美综合| 精品国产一区二区久久| kizo精华| 五月天丁香电影| 99久久精品热视频| 中国美白少妇内射xxxbb| 久久久久网色| 精品久久久久久电影网| 99re6热这里在线精品视频| 国产精品一区www在线观看| 久久久久久久久大av| 国产探花极品一区二区| 国产黄色视频一区二区在线观看| av免费在线看不卡| www.av在线官网国产| 韩国av在线不卡| 欧美精品国产亚洲| 老司机影院毛片| 如何舔出高潮| 欧美少妇被猛烈插入视频| 国产av码专区亚洲av|