骨質疏松腎陽虛和腎陰虛證型下左歸丸含藥血清干預成骨細胞ERK1/2，Wnt/βcatenin信號通路的研究

章建華　邢婧　范連霞　尹華

[摘要]該文研究骨質疏松（OP）腎陽虛和腎陰虛證型下左歸丸含藥血清對成骨細胞增殖和堿性磷酸酶（ALP）表達及對成骨細胞ERK1/2，Wnt/βcatenin信號通路相關因子βcatenin，ERK1，ERK2 mRNA及蛋白表達的作用。采用手術去卵巢法造成大鼠骨質疏松模型，并在手術10周后，分別注射氫化可的松、灌胃甲狀腺素造成大鼠OP腎陽虛及OP腎陰虛模型；用新生24 h乳鼠顱骨體外培養(yǎng)得成骨細胞，以堿性磷酸酶和茜素紅染色進行鑒定，分別用OP腎陽虛、OP腎陰虛及OP組（對照組）所得的左歸丸含藥血清、空白血清干預成骨細胞，采用MTS法檢測細胞增殖情況，ELISA法檢測ALP表達，RTPCR法檢測ERK1/2，βcatenin mRNA的表達，Western blot法檢測ERK1/2，βcatenin蛋白表達。結果表明：OP腎陰虛證型下左歸丸含藥血清在促進成骨細胞增殖、ALP表達、成骨細胞ERK1/2，Wnt/βcatenin信號通路相關因子βcatenin，ERK1，ERK2 mRNA及蛋白表達方面比OP腎陽虛證型下左歸丸含藥血清的作用更強。這與“左歸丸滋腎陰”的中醫(yī)理論相吻合，為臨床辯證治療骨質疏松癥提供科學依據(jù)。左歸丸通過ERK1/2和Wnt/βcatenin信號通路調控成骨細胞的增殖與分化，可能是左歸丸防治骨質疏松腎陰虛證的機制之一。

[關鍵詞]左歸丸； 成骨細胞； 含藥血清； 骨質疏松腎陽虛； 骨質疏松腎陰虛； Wnt/βcatenin信號通路； ERK1/2信號通路

[Abstract]To clarify the effects of Zuoguiwan containing serum on osteoblast proliferation and alkaline phosphatase（ALP） expression and its effects on the expression of βcatenin， ERK1， ERK2 mRNA and protein of osteoblast through ERK1/2， Wnt/βcatenin signaling pathway in models with osteoporosis（OP） kidneyYangdeficiency， osteoporosis（OP） kidneyYindeficiency syndrome Rat osteoporosis models were established by ovariectomy surgery， and 10 weeks after surgery， hydrocortisone was injected and thyroxine was administered by intragastric administration to establish OP kidneyYangdeficiency rat model， and OP kidneyYindeficiency rat model Osteoblasts were obtained from 24 h newborn rat skull and were identified by alkaline phosphatase and alizarin red staining Zuoguiwan containing serum of OP， OP kidneyYangdeficiency， and OP kidneyYindeficiency， as well as the blank serum were used to intervene the osteoblast， and the cells proliferation was detected by MTS ELISA assay was used to detect ALP expression RTPCR assay was used to detect the mRNA expression of ERK1， ERK2， βcatenin and protein expression levels were detected by Western blot The results showed that Zuoguiwan containing serum in OP kidneyYindeficiency model had stronger effect than OP kidneyYangdeficiency in promoting osteoblast proliferation， ALP expression， osteoblast ERK1/2， Wnt/βcatenin signaling pathway related factors βcatenin， ERK1， ERK2 mRNA and protein expression levels This was consistent with the TCM theory of "Zuoguiwan nourishes kidney Yin"， providing a scientific basis for the clinical and dialectical treatment of osteoporosis Zuoguiwan could regulate the proliferation and differentiation of bone cells by ERK1/2 and Wnt/βcatenin signaling pathway， which may be one of the mechanisms of Zuoguiwan for the prevention of osteoporosis.

[Key words]Zuoguiwan； osteoblasts； drug containing serum； OP kidneyYangdeficiency； OP kidneyYindeficiency； Wnt/βcatenin signaling pathway； ERK1/2 signaling pathwayendprint

骨質疏松癥（OP）是機體自然衰老、退化過程的表現(xiàn)，以骨量減少，骨小梁變細、斷裂、數(shù)量減少，骨皮質多孔、變薄為特征，并由此導致骨的脆性增高及骨折危險性增加的一種全身性骨代謝性疾病。隨著社會人口老齡化的日趨嚴重，骨質疏松癥已成為常見病。中醫(yī)學將骨質疏松歸屬于“骨痹”[1]，認為腎虛是本病的主要病機[28]，故中醫(yī)藥治療骨質疏松癥多從補腎入手，實驗室與臨床研究結果均顯示該治療主方向的有效性[3，912]。根據(jù)個體的體征差異，主要有腎陽虛和腎陰虛2種證候。補腎名方左歸丸，始載于明朝張介賓所著《景岳全書》中，方中熟地黃、枸杞、菟絲子、山茱萸、山藥、鹿角膠、龜板膠、牛膝共用，具有滋補腎陰的功效?；谥嗅t(yī)理論辨證論治的思想，本課題借助骨質疏松腎陽、腎陰虛證型制備左歸丸的含藥血清與空白血清，分別干預成骨細胞，通過檢測細胞增殖情況、ALP表達情況以及與ERK1/2，Wnt/βcatenin信號通路相關的各因子mRNA及蛋白表達情況，研究骨質疏松腎陽、腎陰虛證候下左歸丸含藥血清干預成骨細胞ERK1/2，Wnt/βcatenin信號通路作用的差異，從而闡釋左歸丸“辨證”治療骨質疏松癥的作用機制和理論基礎。

1材料

11動物清潔級SD大鼠，雌性，體質量（200±20） g，由浙江中醫(yī)藥大學實驗動物中心提供，動物許可證號SCXK（滬）20080016，用于骨質疏松不同證型的制備及含藥血清的制備；新生24 h內乳鼠，用于成骨細胞的分離培養(yǎng)。

12試藥與試劑熟地黃（130807，產(chǎn)地：河南）、山藥（140226，產(chǎn)地：浙江）、枸杞（140211，產(chǎn)地：寧夏）、山茱萸（131115，產(chǎn)地：浙江）、牛膝（141225，產(chǎn)地：四川）、菟絲子（141204，產(chǎn)地：遼寧）、肉桂（131226，產(chǎn)地：廣西）、鹿角膠（20120103，產(chǎn)地：河南）、龜板膠（20120103，產(chǎn)地：河南），均購自華東醫(yī)藥股份有限公司藥材參茸分公司，經(jīng)浙江中醫(yī)藥大學張如松教授鑒定為正品。

Ⅰ型膠原酶（Gibco分裝）；DMEM高糖型培養(yǎng)液（Hyclone）；胎牛血清（Gibco，USA）；025%胰酶EDTA（Sigma，USA）；001 mol·L-1PBS（吉諾生物醫(yī)藥技術有限公司）；紅細胞裂解液（碧云天生物科技）；堿性磷酸酶染液（南京建成生物工程研究所）；茜素紅（Sigma，USA）；MTS（Promaga，0000094244）； RIPA裂解液（批號00011401，康為生物）；蛋白酶抑制劑混合物（WBP1265，達文生物）；ALP含量測定試劑盒（南京建成生物工程研究所）；BCA蛋白定量試劑盒（00061311，康為世紀）；甘氨酸（amresco，9978c366）；十二烷基硫酸鈉（SDS）（amresco2227）；AP（amresco0496）；TEMED（上海遠慕科技）； Trisbase （amresco0497）；TBST緩沖液（上海樊克生物）； 15 mol·L-1 TrisCl （pH 88），10 mol·L-1TrisCl（pH 68）（碧云天生物科技）；5×SDS上樣緩沖液、預染marker（康為世紀）；PVDF膜（K4AA7969，Immobilon）；1×TAE電泳緩沖液、溴化乙錠溶液（EB）、瓊脂糖、6×加樣緩沖液、細胞總RNA提取試劑盒（杭州寶賽生物，RE02050）；Dnase I（Promega，M6101）；反轉錄試劑盒（杭州寶賽，RT02020）；熒光定量試劑盒（杭州寶賽，PM10003）。Western blot所需抗體見表1。

13左歸丸藥液的制備按處方量稱取各味藥材，左歸丸：熟地黃24 g、山藥12 g、枸杞12 g、山茱萸12 g、牛膝9 g、菟絲子12 g、龜甲膠12 g、鹿角膠12 g，分別加入10倍量50%乙醇，室溫下浸泡1 h，45 ℃條件下超聲提取30 min，2次，合并藥液，過濾，減壓濃縮至生藥4 g·mL-1，4 ℃保存?zhèn)溆谩?/p>

14儀器Sartorius BS110S 1/1萬電子天平（德國塞多利斯公司）；Heidolph 5804R超速冷凍離心機（德國海道夫公司）；KQ5200B型超聲波清洗器（昆山市超聲儀器有限公司）；SENCO R系列旋轉蒸發(fā)儀（上海申生科技有限公司）；倒置相差顯微鏡（日本Olympus公司）；CO2培養(yǎng)箱（德國賽默飛世爾科技有限公司）；超凈工作臺（蘇州蘇凈公司）；多功能酶標分析儀（德國賽默飛世爾科技有限公司）；旋轉式恒溫振蕩儀（江蘇培英公司）；Odyssey雙波長成像系統(tǒng)（Licor，美國）；電泳儀（BioRad，美國）；定量PCR儀（安捷倫，Agilent Stratagene Mx3005P）；微量離心機（美國AndyBio公司，AndyBio Mcentrifuge）。

2方法

21動物模型的建立與評價取SD雌性大鼠，分成正常組與模型組，正常組行假手術，切除卵巢附近一小塊脂肪，模型組切除雙側卵巢造成骨質疏松模型。將模型組分成OP組、OP腎陰虛組、OP腎陽虛組。OP腎陽虛組于術后10周開始，每日臀部肌肉注射氫化可的松，劑量為0025 mg·g-1，連續(xù)10 d；OP腎陰虛組于術后第10周開始，每日灌胃給予甲狀腺素，劑量為016 mg·g-1，連續(xù)10 d。造模期間觀察記錄OP組、OP腎陰虛組、OP腎陽虛組動物的一般行為狀態(tài)、體質量、肛溫，并且測定血清cAMP和cGMP的含量。由于OP模型的建立方法較為經(jīng)典，故OP模型的確定依據(jù)為病理切片及骨密度檢測，病理切片結果見圖1。

22新生24 h乳鼠顱骨成骨細胞體外培養(yǎng)頸椎脫臼法處死1日齡乳鼠，75%乙醇浸泡消毒15 min。無菌分離出顱蓋骨，除去附著的血管及結締組織，

A正常大鼠股骨；B骨質疏松癥大鼠股骨。

PBS 沖洗3次，剪成1 mm3大小的碎塊，用PBS清洗3次，加入2 mL的025%胰蛋白酶，于37 ℃水浴中預消化30 min，加入等體積的10%胎牛血清DMEM雙抗完全培養(yǎng)基終止消化。棄除消化液，加入濃度為01%Ⅰ型膠原酶5 mL，于37 ℃水浴下，振蕩消化1 h，取上清液置于另一個離心管中，1 000 r·min-1離心5 min 后棄上清液，加入適量完全培養(yǎng)基，制成細胞懸液，剩余的骨片中再繼續(xù)重復振蕩消化1次，混勻2次消化的細胞懸液，接種至培養(yǎng)瓶，endprint

于37 ℃，含5%CO2，飽和濕度的培養(yǎng)箱內培養(yǎng)，3 d后換液去除未貼壁細胞。此后每隔3 d 換液1次，直至細胞約80%融合時按1∶3傳代，反復純化，傳至第3代進行實驗，成骨細胞堿性磷酸酶染色及茜素紅染色結果見圖2。

A堿性磷酸酶染色；B茜素紅染色。

23骨質疏松、骨質疏松腎陽、腎陰虛證型下左歸丸含藥血清的制備隨機取OP大鼠、OP兼腎陽虛大鼠、OP兼腎陰虛大鼠各20只，隨機分為2組，一組灌胃純水，另一組灌胃左歸丸藥液。具體方法如下：按照每100 g灌胃15 mL，1 d 2次，連續(xù)6次后，于末次給藥后1 h，心臟取血。4 ℃靜置2 h，于4 ℃，4 000 r·min-1離心25 min，即得，同組血清混合。56 ℃水浴滅活30 min，過膜，儲存于-80 ℃冰箱，備用。臨用前，將血清用DMEM雙抗基礎培養(yǎng)基（不含F(xiàn)BS）稀釋成各所需濃度。

24不同狀態(tài)下左歸丸含藥血清對成骨細胞增殖的影響取生長良好的第3代成骨細胞，以3 000個/孔接種于96孔板中，24 h貼壁后，更換成含2% FBS的DMEM培養(yǎng)液饑餓培養(yǎng)，使細胞同步化；24 h后，更換成各組左歸丸含藥血清與空白血清。每組設置6個復孔，繼續(xù)培養(yǎng)72 h后，吸棄舊的培養(yǎng)液，PBS沖洗2次，并于每孔中加入100 μL基礎培養(yǎng)液（不含F(xiàn)BS），再加入20 μL MTS，于37 ℃，5%CO2，飽和濕度細胞培養(yǎng)箱中繼續(xù)避光培養(yǎng)2 h，酶標儀上490 nm測定吸光度（A）。

25不同證型左歸丸含藥血清對成骨細胞ALP表達的影響取第3代成骨細胞，以5萬個/孔接種于24孔板中，24 h貼壁后，更換成含2%FBS的培養(yǎng)液饑餓24 h，分別加入各種證候下的左歸丸含藥血清與空白血清，每組設6孔。72 h后，吸取細胞培養(yǎng)上清液，4 ℃，1 500 r·min-1離心20 min，取上清，用堿性磷酸酶試劑盒測定堿性磷酸酶表達情況。

26RTPCR法檢測成骨細胞βcatenin，ERK1，ERK2 mRNA表達取第3代成骨細胞，以5萬個/孔接種于24孔板中按25項下方法進行干預，每組3瓶。72 h后，用Trizol試劑盒提取細胞總RNA。用RTPCR試劑盒采用二步法將其逆轉錄成cDNA，以不同引物進行RTPCR，檢測樣品中ERK1，ERK2，βcatenin基因mRNA表達情況，以βactin作為內參基因，引物序列見表2。

27Western blot法測定成骨細胞βcatenin，ERK1，ERK2蛋白表達取第3代成骨細胞，以1×106個/瓶的密度接種于25 cm2細胞培養(yǎng)瓶中，按25項下方法進行干預，每組3瓶。72 h后，胰酶消化下細胞，移至15 mL離心管。每瓶細胞加250～500 μL RIPA裂解液，14 000 r·min-1，4 ℃，離心30 min，收獲蛋白，測定蛋白濃度。用SDSPAGE電泳

分離蛋白，將蛋白轉移至PVDF膜上。5%脫脂奶粉室溫下封閉2 h，一抗室溫振搖孵育2 h，4 ℃過夜，二抗室溫振搖孵育2 h。用增強型DAB底物顯色試劑盒進行顯影，將PVDF膜進行掃描。用蛋白圖像分析軟件檢測條帶灰度值，計算蛋白相對表達量。

28統(tǒng)計學處理采用SPSS 160統(tǒng)計軟件進行數(shù)據(jù)分析，計量數(shù)據(jù)以±s表示，t檢驗進行分析，P<005表示具有統(tǒng)計學意義。

3結果

31不同證型下左歸丸含藥血清對成骨細胞增殖的影響OP，OP腎陰虛，OP腎陽虛左歸丸含藥血清與相應狀態(tài)下的空白血清比較，均能促進成骨細胞增殖，且具有顯著性差異（P<005），其中OP腎陰虛左歸丸含藥血清對成骨細胞增殖的促進作用最強，見表3。

32不同證型下左歸丸含藥血清對成骨細胞ALP表達的影響OP，OP腎陰虛，OP腎陽虛左歸丸含藥血清與相應狀態(tài)下的空白血清比較，均能促進成骨細胞培養(yǎng)上清液中ALP表達，且具有顯著性差異（P<005），其中OP腎陰虛左歸丸含藥血清對成骨細胞培養(yǎng)上清液中ALP表達的促進作用最強，見表4。

33不同證型左歸丸含藥血清干預成骨細胞ERK1/2，Wnt/βcatenin信號通路相關因子mRNA表達的影響OP，OP腎陰虛，OP腎陽虛左歸丸含藥血清均能上調βcatenin，ERK2 mRNA的表達，其中OP，OP腎陰虛左歸丸含藥血清，與相應證型下的空白血清比較，具有顯著性差異（P<005）；OP，OP腎陰虛左歸丸含藥血清能上調ERK2 mRNA的表達，與相應證型下的空白血清比較，具有顯著性差異（P<005）；OP腎陽虛左歸丸含藥血清，與相應證型下的空白血清比較，反而抑制ERK2 mRNA的表達。與OP腎陽虛左歸丸含藥血清比較，OP腎陰虛左歸丸含藥血清組能夠顯著上調βcatenin，ERK1，ERK2 mRNA的表達（P<005）。與OP左歸丸含藥血清比較，OP腎陰虛左歸丸含藥血清能夠顯著上調ERK1，ERK2 mRNA的表達（P<005），但對βcatenin的作用無明顯差異，見表5。

34不同證型左歸丸含藥血清干預成骨細胞ERK1/2，Wnt/βcatenin信號通路相關因子蛋白表達的影響OP，OP腎陰虛、OP腎陽虛左歸丸含藥血清均能上調βcatenin，ERK1，ERK2蛋白的表達，其中OP，OP腎陰虛左歸丸含藥血清在上調βcatenin蛋白表達方面，與相應證候下的空白血清比較，具有顯著性差異（P<005），OP腎陽虛左歸丸含藥血清在上調ERK2蛋白表達方面，與相應證候下的空白血清比較，具有顯著性差異（P<005）。與OP腎陽虛左歸丸含藥血清比較，OP腎陰虛左歸丸含藥血清能顯著上調βcatenin蛋白的表達（P<005），亦能上調ERK1，ERK2蛋白的表達，但無顯著性差異，見表6及圖3。

A，B，COP、OP腎陰虛、OP腎陽虛證候下的左歸丸含藥血清；A1，B1，C1為相應證候下的空白血清。endprint

4討論

隨著對骨質疏松癥病因病機認識的發(fā)展，已知Wnt，BMP，MAPK和Hedgehog多種信號通路與疾病的形成發(fā)展有關。目前研究較多的是經(jīng)典Wnt信號通路（即Wnt/βcatenin信號通路）和ERK1/2信號通路[1415]。βcatenin由130個氨基酸殘基構成，存在于細胞質、細胞膜和細胞核中，且以細胞質中含量最多[16]。βcatenin是經(jīng)典Wnt信號通路中關鍵的中樞性因子，調節(jié)其在胞內的穩(wěn)定的積累對通路的激活至關重要。當細胞質內的βcatenin積累到一定量后，進而進入細胞核內，促進基因的轉錄。βcatenin在成骨細胞中存在廣泛的表達，能促進成骨細胞的分化與存活。ERK1/2信號通路是目前研究的最為透徹的促分裂原活化蛋白激酶（MAPKA）通路，它是多數(shù)生長因子、細胞因子調控細胞增殖的重要途徑[17]。袁曉軍等[18]在探討小鼠成骨細胞暴露于金屬鈷、鉻離子條件下對RANKL表達的影響及ERK信號通路在這一過程中作用，尋找防治假體周圍骨溶解的方法的實驗中發(fā)現(xiàn)金屬離子可刺激成骨細胞RANKL mRNA的表達并促進RANKL蛋白的分泌；ERK信號通路抑制劑PD98059可一定程度抑制RANKL的表達，從側面證實了兩者之間的聯(lián)系。

OP腎陰虛左歸丸含藥血清對成骨細胞增殖、ALP活性、βcatenin，ERK1，ERK2蛋白及mRNA的表達的促進作用最強。作者認為可能原因如下：左歸丸以熟地黃為君藥，有研究表明[23]熟地黃中主要有效成分梓醇在較低濃度時可以促進成骨細胞增殖；以山茱萸、山藥、枸杞為臣藥，亦有研究表明這些中藥的有效成分對成骨細胞增殖及ALP活性有一定的促進作用[1921]。作者推測左歸丸含藥血清是通過以上這些成分發(fā)揮對成骨細胞促增殖、促進ALP活性及相關因子蛋白及mRNA表達的作用，且這些成分在OP腎陰虛狀態(tài)下發(fā)揮最佳效果，并且這種作用是通過干預Wnt/βcatenin信號通路和ERK1/2信號而產(chǎn)生的。但目前關于這些成分如梓醇、馬錢苷、莫諾苷等抗骨質疏松的體外實驗（對成骨細胞作用）和整體研究報道較少，缺少相關對照，還需進一步深入研究。

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[責任編輯張寧寧]endprint