黃酒及其原料中微量氰化物的測(cè)定

鄒偉,王棟,徐巖

(江南大學(xué),工業(yè)生物技術(shù)教育部重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室，食品安全與營(yíng)養(yǎng)協(xié)同創(chuàng)新中心，江南大學(xué)生物工程學(xué)院釀造微生物及應(yīng)用酶學(xué)研究室，江蘇 無(wú)錫，214122)

黃酒及其原料中微量氰化物的測(cè)定

鄒偉,王棟*,徐巖

(江南大學(xué),工業(yè)生物技術(shù)教育部重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室，食品安全與營(yíng)養(yǎng)協(xié)同創(chuàng)新中心，江南大學(xué)生物工程學(xué)院釀造微生物及應(yīng)用酶學(xué)研究室，江蘇 無(wú)錫，214122)

基于氰化物衍生化及LC-MS/MS聯(lián)用技術(shù)，建立了適用于黃酒及其原料中游離態(tài)氰化物及總氰化物測(cè)定的方法，該方法具有良好的準(zhǔn)確度、精密度和靈敏度，檢出限為0.01 μg/L，相對(duì)標(biāo)準(zhǔn)偏差低于5%，回收率在93.6%～106.0%。利用該方法對(duì)不同黃酒及其釀造原料中的游離態(tài)和總氰化物的含量進(jìn)行了分析檢測(cè)。結(jié)果表明，黃酒釀造原料大米和麥曲及黃酒中均含有微量氰化物。其中，麥曲氰化物含量相對(duì)較高，其游離態(tài)氰化物含量20.35～93.73 μg/L，總氰含量98.09～1 032.03 μg/L。黃酒中游離態(tài)氰化物的含量低于15 μg/L，總氰含量一般低于30 μg/L，表明在黃酒儲(chǔ)存和銷(xiāo)售過(guò)程中，氰化物可能不是影響黃酒氨基甲酸乙酯(EC)增加的主要因素。該研究結(jié)果為進(jìn)一步明確黃酒中氰化物與EC的關(guān)系提供了技術(shù)手段和研究基礎(chǔ)。

黃酒；麥曲；氰化物；檢測(cè)

氨基甲酸乙酯(ethyl carbamate，EC)廣泛存在于發(fā)酵食品和飲料酒中，如葡萄酒、黃酒、蒸餾酒、醬油等[1]。由于其具有潛在的危害性，近年受到越來(lái)越多的重視。2007年國(guó)際癌癥研究機(jī)構(gòu)(International Agency for Research on Cancer，IARC)將EC定義為2A類(lèi)致癌物質(zhì)[2]。黃酒中EC含量較高[3]?？刂艵C的含量對(duì)于黃酒產(chǎn)業(yè)的發(fā)展至關(guān)重要。

飲料酒中EC的形成一般認(rèn)為有2種途徑。在葡萄酒和清酒等發(fā)酵酒中，EC的形成主要由前體物質(zhì)尿素及瓜氨酸等氨甲?；衔锱c乙醇反應(yīng)生成[4]。尿素等前體物質(zhì)主要來(lái)源于酵母代謝和原料[5-7]。而在蒸餾酒中，包括中國(guó)白酒[8]、威士忌、白蘭地、利口酒等[9-10]，EC主要由氰化物(cyanide，CN)與乙醇反應(yīng)生成，而且氰化物轉(zhuǎn)化生成EC的速率相對(duì)較快[11]。氰化物作為EC形成的重要前體物質(zhì)，主要來(lái)自于釀酒原料中的生氰糖苷(cyanogenic glycoside)。世界上有超過(guò)2 000種植物含有生氰糖苷[12]，它們經(jīng)β-葡萄糖苷水解酶或者高溫酸解釋放出氰化物[13]。由于黃酒釀造原料中存在生氰糖苷[14-15]，黃酒中的EC除了主要由尿素形成外，釀造過(guò)程中氰化物的釋放也可能會(huì)增加EC的含量，目前尚未有明確的研究報(bào)道。

氰化物可分為游離態(tài)氰化物和結(jié)合態(tài)氰化物(如生氰糖苷)[16]。對(duì)于飲料酒中氰化物的測(cè)定較多針對(duì)蒸餾酒領(lǐng)域，常見(jiàn)的測(cè)定方法包括比色法、氣相色譜-氮磷檢測(cè)法(gas chromatography-nitrogen phosphorus detector,GC-NPD)、氣相色譜-質(zhì)譜法(gas chromatography-mass spectrography,GC-MS)等[17-19]。國(guó)內(nèi)外現(xiàn)行的蒸餾酒中氰化物測(cè)定方法是歐盟[20]及GB 5009.36—2016推薦的異煙酸-吡唑啉酮比色法[21]。但該方法定量限較高(0.015 mg/L)，易出現(xiàn)顏色干擾，難以滿足釀造酒中微量氰化物測(cè)定的要求。由于氰化物是一種對(duì)人體具有嚴(yán)重毒害作用的物質(zhì)[22]，為滿足對(duì)氰化物準(zhǔn)確定量的需要，近年來(lái)一些微量氰化物測(cè)定方法已用于血液[23]、環(huán)境[17]等樣品的檢測(cè)，但用于釀造酒中則少見(jiàn)報(bào)道。本研究基于氰根離子與2,3-萘基二縮醛(NDA)和?；撬嵋子诎l(fā)生衍生化反應(yīng)生成一種苯環(huán)衍生物(N-substituted 1-cyanobenzoisoindole，CBI)的原理[24]，利用氰化物柱前衍生和液相色譜-二級(jí)質(zhì)譜連用(liquid chromatography-mass spectrography/mass spectrography，LC-MS/MS)聯(lián)用，建立了黃酒及其原料中微量氰化物的測(cè)定方法。

1 材料和方法

1.1材料與試劑

1.1.1 實(shí)驗(yàn)材料

麥曲、大米等黃酒釀造原料由浙江、江蘇等地黃酒釀造工廠提供，黃酒樣品為市售商品。

1.1.2 實(shí)驗(yàn)試劑

乙腈，甲醇，磷酸：色譜純，上海安譜實(shí)驗(yàn)科技股份有限公司；無(wú)水乙醇，2,3-萘基二縮醛(NDA)，C13N15-氰化鉀：色譜純，上海百靈威；乙酸銨，牛磺酸：色譜純，美國(guó)Sigma-Aldrich公司；氨水，硫酸，酒石酸，乙酸鋅，氫氧化鈉，氰化鉀：分析純，上海國(guó)藥集團(tuán)。

1.2實(shí)驗(yàn)儀器

Xevo TQ三重四級(jí)桿液質(zhì)聯(lián)用儀(LC-MS/MS)、C18色譜柱(Acquity UPLC BEH 100 mm×2.1 mm，1.7 μm)，美國(guó)Waters公司；Milli-Q超純水機(jī)，美國(guó)Millipore公司。

1.3實(shí)驗(yàn)方法

1.3.1 黃酒樣品預(yù)處理

游離態(tài)氰化物預(yù)處理方法：參考文獻(xiàn)[24]的方法。在20 mL的頂空瓶中加入2 mL的黃酒樣品和10 μL質(zhì)量濃度為1 mg/L的內(nèi)標(biāo)C13N15-氰化鉀標(biāo)準(zhǔn)品溶液，頂空瓶?jī)?nèi)放入1個(gè)裝有40 μL衍生劑(2.71 mmol/L用甲醇溶解的2,3-萘基二縮醛(NDA)溶液、50 mmol/L的牛磺酸溶液、甲醛和氨水體積比為25∶25∶45∶5的混合溶液)的1.5 mL的離心管。沿壁添加2 mL濃硫酸后立即密封頂空瓶。室溫下振蕩30 min，得到衍生后產(chǎn)物，進(jìn)樣檢測(cè)游離氰化物含量。

總氰化物預(yù)處理：按參考文獻(xiàn)[21]的預(yù)處理方法。量取25 mL酒樣于250 mL蒸餾瓶中，加入100 mL超純水，將冷凝管下端插入盛有10 mL衍生劑(2.71 mmol/L用甲醇溶解的2,3-萘基二縮醛(NDA)溶液、50 mmol/L的牛磺酸溶液、甲醛和氨水體積比為25∶25∶45∶5的混合溶液)比色管的液面下。加入1～2 g酒石酸，迅速連蒸餾裝置進(jìn)行水蒸氣蒸餾，收集蒸餾液約50 mL，然后用甲醇定容至50 mL，混合均勻，加入內(nèi)標(biāo)進(jìn)行取樣檢測(cè)。

1.3.2 固體樣品預(yù)處理

游離態(tài)氰化物預(yù)處理方法：參照文獻(xiàn)[25]的方法。使用磷酸/25%乙醇溶液提取固體樣品中的氰化物，然后將提取液按照與1.3.1中黃酒游離態(tài)氰化物相同的方法進(jìn)行處理。

總氰化物預(yù)處理方法：參照文獻(xiàn)[21]的方法。稱(chēng)取20 g試樣于500 mL水蒸氣蒸餾裝置中，加水約200 mL，塞嚴(yán)瓶口，在室溫下放置2 h，然后加入20 mL乙酸鋅溶液和2.0 g酒石酸，迅速連接好裝置，將冷凝管下端插入盛有10 mL衍生劑(2.71 mmol/L用甲醇溶解的2,3-萘基二縮醛(NDA)溶液、50 mmol/L的?；撬崛芤?、甲醛和氨水體積比為25∶25∶45∶5的混合溶液)比色管的液面下。收集蒸餾液約50 mL，然后用甲醇定容至50 mL，混合均勻，加入內(nèi)標(biāo)進(jìn)行取樣檢測(cè)。

1.3.3 樣品檢測(cè)

報(bào)道的檢測(cè)條件[24]，在本實(shí)驗(yàn)條件下，主要對(duì)色譜分析中的流動(dòng)相及洗脫程序和質(zhì)譜檢測(cè)條件碰撞能量等進(jìn)行了優(yōu)化。從3種流動(dòng)相(乙酸銨、乙腈；乙酸銨、甲醇；水、乙腈)中確定2 mmol/L乙酸銨和乙腈作為流動(dòng)相，響應(yīng)值最高；通過(guò)調(diào)整洗脫程序得到較好的峰形。優(yōu)化后的具體條件如下。

色譜條件：色譜柱：Acquity UPLC BEH，100 mm×2.1 mm，1.7 μm；柱溫40 ℃；進(jìn)樣量2 μL；流動(dòng)相：A為2 mmol/L乙酸銨，B為乙腈，流速0.3 mL/min；流動(dòng)相梯度洗脫程序如表1所示。

表1 流動(dòng)相洗脫梯度

質(zhì)譜條件：電離方式ESI(-)；多反應(yīng)檢測(cè)掃描質(zhì)譜模式；離子源溫度為150 ℃；碰撞能量30 eV；錐孔電壓25 V；毛細(xì)管壓力2 500 V。

1.3.4 標(biāo)準(zhǔn)曲線

將10 mg/L氰化鉀標(biāo)準(zhǔn)品儲(chǔ)備液稀釋成一系列質(zhì)量濃度的標(biāo)準(zhǔn)液，取上述溶液各2 mL，按照與樣品相同的方法加入頂空瓶中進(jìn)行衍生化處理。衍生物經(jīng)LC-MS/MS檢測(cè)，將所測(cè)得的峰面積與同位素峰面積的比值作為縱坐標(biāo)，氰化物CN質(zhì)量濃度為橫坐標(biāo)進(jìn)行線性回歸分析，得到標(biāo)準(zhǔn)曲線方程(y=0.023 05x+0.116 16，R2=0.991 34)。

2 結(jié)果與分析

2.1氰化物測(cè)定方法的建立與評(píng)價(jià)

2.1.1 目標(biāo)物定性分析

按照1.3.1的操作步驟對(duì)氰化物標(biāo)準(zhǔn)品和黃酒樣品進(jìn)行衍生化操作，在優(yōu)化的檢測(cè)條件下氰化物衍生物及其同位素衍生物的質(zhì)譜圖如圖1所示，衍生后的產(chǎn)物CBI分子量為300，在設(shè)定的質(zhì)譜條件下，負(fù)離子模式分別選擇離子對(duì)m/z299→191、m/z301→193和m/z299→81、m/z301→81作為定量離子對(duì)和定性離子對(duì)。

圖1 氰化物衍生物質(zhì)譜圖Fig.1 Mass spectrum of CBI

按照1.3.3中的檢測(cè)條件，對(duì)氰化物標(biāo)準(zhǔn)品和黃酒酒樣進(jìn)行分析，得到色譜圖結(jié)果如圖2所示。在本檢測(cè)條件下，衍生后的產(chǎn)物保留時(shí)間為2.21 min。且在MRM(Multi Reaction Monitoring，多反應(yīng)檢測(cè)掃描)模式下，黃酒酒樣和標(biāo)準(zhǔn)品的衍生后產(chǎn)物峰形良好，無(wú)干擾。

2.1.2 方法的精密度

為評(píng)估衍生化及LC-MS/MS聯(lián)用測(cè)定黃酒及其原料中游離態(tài)和總氰化物方法的適用性，對(duì)該方法的

精確度、檢測(cè)限、準(zhǔn)確性等指標(biāo)進(jìn)行了考察。首先對(duì)10 μg/L的標(biāo)準(zhǔn)氰化鉀溶液按照與樣品相同的處理方法及測(cè)定條件進(jìn)行日內(nèi)和日間6次測(cè)定，結(jié)果如表2所示。測(cè)定結(jié)果表明，該測(cè)定方法較為穩(wěn)定，相對(duì)標(biāo)準(zhǔn)偏差在2%～4%之間，精確度達(dá)到實(shí)驗(yàn)要求，具有較高重現(xiàn)性。

a-氰化鉀標(biāo)準(zhǔn)溶液；b-黃酒圖2 LC-MS/MS法測(cè)定氰化物衍生產(chǎn)物色譜圖Fig.2 MRM chromatogram of CBI by LC-MS/MS

氰化物質(zhì)量濃度/(μg·L-1)測(cè)定次數(shù)123456平均值/(μg·L-1)相對(duì)標(biāo)準(zhǔn)偏差/%日內(nèi)10.2010.1610.409.8510.5010.2310.222.19日間10.4910.0410.2010.4110.619.5710.223.70

2.1.3 方法的檢測(cè)限和定量限

根據(jù)檢測(cè)限和定量限的常用計(jì)算方法[26]，當(dāng)待測(cè)樣品的信號(hào)與空白基質(zhì)噪音的比值為3，即S/N=3時(shí)的濃度為氰化物測(cè)定的檢測(cè)限；當(dāng)待測(cè)樣品信號(hào)與空白基質(zhì)噪音的比值為10，即S/N=10時(shí)的濃度為氰化物測(cè)定的定量限。在本研究條件下，通過(guò)測(cè)定不同氰化物濃度樣品，計(jì)算信噪比，可得氰化物測(cè)定的檢測(cè)限和定量限分別為0.01 μg/L和0.05 μg/L。由于MS/MS的應(yīng)用，使得微量氰化物測(cè)定的靈敏性得到了很大的提高[27]。與已報(bào)道的分析方法相比[22]，本方法具有更低的檢測(cè)限。

2.1.4 乙醇含量的影響

由于黃酒是酒精飲料，為考察乙醇對(duì)該測(cè)定方法的影響，分別對(duì)乙醇體積分?jǐn)?shù)不同(0、5%、10%、15%、20%)的10 μg/L氰化物CN溶液，按照與樣品相同的處理方法及測(cè)定條件進(jìn)行測(cè)定，結(jié)果如圖3所示。不同乙醇體積分?jǐn)?shù)對(duì)氰化物測(cè)定結(jié)果沒(méi)有顯著影響。因此，該方法可用于酒精飲料中氰化物的測(cè)定。

圖3 乙醇含量對(duì)測(cè)定的影響Fig.3 Effect of ethanol on determination of cyanide

2.1.5 方法的準(zhǔn)確性

在此基礎(chǔ)上，進(jìn)一步通過(guò)檢測(cè)回收率分別考察了該方法對(duì)于黃酒中游離態(tài)氰化物和總氰化物(含結(jié)合態(tài))測(cè)定的準(zhǔn)確性。

在游離態(tài)氰化物質(zhì)量濃度為4.71 μg/L的黃酒樣品中，分別準(zhǔn)確加入終濃度為2.5、10 μg/L的氰化物標(biāo)準(zhǔn)品，按照游離態(tài)氰化物測(cè)定的處理方法進(jìn)行處理和分析，計(jì)算其回收率及相對(duì)標(biāo)準(zhǔn)偏差，結(jié)果如表3所示。添加不同質(zhì)量濃度標(biāo)準(zhǔn)品的測(cè)定回收率分別為106.0%和93.6%，相對(duì)標(biāo)準(zhǔn)偏差為2.50%和5.61%，該方法對(duì)于黃酒中游離態(tài)氰化物的測(cè)定是準(zhǔn)確的。

表3 游離態(tài)氰化物測(cè)定方法的準(zhǔn)確度和回收率

在總氰化物質(zhì)量濃度為24.0 μg/L的黃酒樣品中，分別準(zhǔn)確添加終質(zhì)量濃度為500、1 000和2 000 μg/L的蜀黍糖苷(理論上可以轉(zhuǎn)化生成41.6、83.2和166.4 μg/L的CN)，按照總氰化物測(cè)定的處理方法進(jìn)行處理和分析，測(cè)定衍生化后的產(chǎn)物濃度，計(jì)算其回收率及相對(duì)標(biāo)準(zhǔn)偏差，結(jié)果如表4所示。結(jié)果表明，添加不同濃度結(jié)合態(tài)氰化物的測(cè)定平均回收率分別為89.9%、105.5%和89.7%，相對(duì)標(biāo)準(zhǔn)偏差也均在實(shí)驗(yàn)要求范圍內(nèi)。表明該方法對(duì)于黃酒中總氰化物(含結(jié)合態(tài)氰化物)的測(cè)定也是準(zhǔn)確的。

表4 總氰化物測(cè)定方法的準(zhǔn)確度和回收率

2.2黃酒不同釀造原料中氰化物的含量

利用上述氰化物測(cè)定方法，對(duì)不同來(lái)源用于黃酒釀造的大米、麥曲以及其他相關(guān)原料進(jìn)行了游離態(tài)和總氰化物的測(cè)定，測(cè)定結(jié)果見(jiàn)表5。在所分析的黃酒釀造原料大米和麥曲中均含有微量的氰化物。其中大米中氰化物的含量較低，總氰化物含量在45 μg/kg以下，且主要是游離態(tài)氰化物，占總氰化物含量的54%以上。麥曲中游離態(tài)氰化物的含量為20.35～93.73 μg/kg，但總氰化物的含量相對(duì)較高，為98.09～1032.3 μg/kg，平均達(dá)到438.57 μg/kg。不同麥曲氰化物含量差異較大，而且麥曲中的氰化物主要以結(jié)合態(tài)為主，游離態(tài)氰化物所占比例較低。麥曲以小麥為主要原料，對(duì)小麥及其麩皮的氰化物含量測(cè)定結(jié)果表明，小麥中游離態(tài)氰化物的含量為15.32～42.05 μg/kg，總氰化物為63.02～168.95 μg/kg，而麩皮的氰化物含量相對(duì)較高，總氰化物的含量在96.94～828.77 μg/kg，說(shuō)明小麥的總氰化物，特別是結(jié)合態(tài)氰化物，可能主要在麩皮中。黃酒釀造原料中，由小麥制得的麥曲中含有相對(duì)較高的總氰化物含量，在釀造過(guò)程中可能會(huì)分離出游離氰化物進(jìn)而反應(yīng)引起EC的增加，因此黃酒釀造對(duì)麥曲原料的選擇可能需引起注意。相關(guān)研究還需進(jìn)一步進(jìn)行。

表5 釀酒原料中的氰化物含量

2.3黃酒中氰化物的含量

利用本研究建立的氰化物測(cè)定方法，進(jìn)一步對(duì)市售的不同黃酒樣品進(jìn)行了測(cè)定分析，結(jié)果如表6所示。在所檢測(cè)的黃酒樣品中，均含有微量游離態(tài)氰化物，但含量低于15 μg/L，總氰化物絕大部分在30 μg/L以下。美國(guó)環(huán)保署和世界衛(wèi)生組織對(duì)飲用水中氰化物的限量標(biāo)準(zhǔn)分別是200 μg/L[28]和70 μg/L[29]，黃酒中氰化物的含量遠(yuǎn)低于飲用水限量標(biāo)準(zhǔn)。由于黃酒產(chǎn)品中的氰化物含量較低，可以認(rèn)為氰化物對(duì)于黃酒貯存過(guò)程中EC的增加沒(méi)有顯著影響。

表6 黃酒中氰化物的含量

3 結(jié)論

為考察氰化物對(duì)黃酒EC形成可能的影響，本研究基于氰化物衍生化及LC-MS/MS聯(lián)用技術(shù)，建立了適用于黃酒及其原料中游離態(tài)氰化物及總氰化物測(cè)定的方法。該方法具有檢測(cè)限低、準(zhǔn)確度與精密度良好等特點(diǎn)，適用于黃酒中游離態(tài)氰化物及總氰化物的檢測(cè)。利用該方法對(duì)不同黃酒及其釀造原料中的游離態(tài)和總氰化物含量的分析檢測(cè)結(jié)果表明，黃酒及釀酒原料中存在微量氰化物。黃酒釀造主要原料大米的氰化物含量相對(duì)較低，麥曲中總氰化物含量較高，主要是結(jié)合態(tài)氰化物。而且不同麥曲氰化物含量差異較大，制曲時(shí)需要注意對(duì)小麥原料的選擇。大量麥曲的使用可能會(huì)對(duì)黃酒釀造過(guò)程中EC的形成產(chǎn)生影響。黃酒中氰化物含量較低，對(duì)于黃酒貯存過(guò)程中EC的增加可能沒(méi)有顯著影響。研究結(jié)果為進(jìn)一步明確黃酒中氰化物與EC的關(guān)系提供了技術(shù)手段和研究基礎(chǔ)。

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DeterminationoftracecyanidesinChinesericewineanditsrawmaterials

ZOU Wei,WANG Dong*,XU Yan

(Key Laboratory of Industrial Biotechnology,Ministry of Education Synergetic Innovation Center for Food Safety and Nutrition Laboratory of Brewing Microbiology and Applied Enzymology,School of Biotechnology,Jiangnan University,Wuxi 214122,China)

A LC-MS/MS method coupled with cyanide derivatization was applied to the determination of free and total cyanide (CN) inHuangjiu(Chinese rice wine) and its raw materials. This method was precise, accurate and sensitive. Under the established conditions, the limit of detection LOD was 0.01 μg/L, the relative standard deviation RSD was less than 5% and the recovery was 93.6%-106.0%, respectively. Using this method, free and total cyanide were detected inHuangjiuand raw materials, and trace cyanides were found. A rather higher concentration of cyanides was detected in the raw material wheatQu, with a concentration range of 20.35-93.73 μg/L for the free cyanide and 98.09-1 032.03 μg/L for the total cyanide. Free cyanide and total cyanide inHuangjiuwere lower than 15 μg/L and 30 μg/L, respectively. This result suggested that cyanide might not be an important factor to increase the formation of ethyl carbamate during the storage and sale ofHuangjiu. This work provided an efficient analytical method and a basis for further studying the relationship between ethyl carbamate and cyanide inHuangjiu.

Huangjiu(Chinese rice wine); wheatQu; cyanide; determination

碩士研究生(王棟副教授為通訊作者，E-mail:dwang@jiangnan.edu.cn)。

國(guó)家重點(diǎn)研發(fā)計(jì)劃項(xiàng)目(No.2016YFD0400503)；國(guó)家高技術(shù)研究發(fā)展計(jì)劃(863計(jì)劃，2013AA102108)；江蘇省高校品牌特色專(zhuān)業(yè)建設(shè)工程(No.PPZY2015A056)

2017-03-03，改回日期：2017-05-03

10.13995/j.cnki.11-1802/ts.014209