豆豉發(fā)酵常用毛霉和米曲霉菌株產(chǎn)生物胺能力的評(píng)價(jià)

張仁鳳，陳光靜，楊萬明，黃遠(yuǎn)輝，成學(xué)東，曾凡玉，闞建全*

1(西南大學(xué) 食品科學(xué)學(xué)院，重慶，400715) 2(重慶市農(nóng)產(chǎn)品加工及貯藏重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室，重慶，400715) 3(農(nóng)業(yè)部農(nóng)產(chǎn)品貯藏保鮮質(zhì)量安全風(fēng)險(xiǎn)評(píng)估實(shí)驗(yàn)室(重慶)，重慶，400715) 4(重慶出入境檢驗(yàn)檢疫局永川辦事處，重慶，400715) 5(永川豆豉食品有限公司，重慶，400715)

豆豉發(fā)酵常用毛霉和米曲霉菌株產(chǎn)生物胺能力的評(píng)價(jià)

張仁鳳1,2,3，陳光靜1,2,3，楊萬明4，黃遠(yuǎn)輝4，成學(xué)東4，曾凡玉5，闞建全1,2,3*

1(西南大學(xué) 食品科學(xué)學(xué)院，重慶，400715) 2(重慶市農(nóng)產(chǎn)品加工及貯藏重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室，重慶，400715) 3(農(nóng)業(yè)部農(nóng)產(chǎn)品貯藏保鮮質(zhì)量安全風(fēng)險(xiǎn)評(píng)估實(shí)驗(yàn)室(重慶)，重慶，400715) 4(重慶出入境檢驗(yàn)檢疫局永川辦事處，重慶，400715) 5(永川豆豉食品有限公司，重慶，400715)

采用微生物學(xué)、高效液相色譜、分子生物學(xué)技術(shù)(PCR)和酶學(xué)技術(shù)，系統(tǒng)檢測(cè)和評(píng)價(jià)了豆豉發(fā)酵中常用的6株毛霉和米曲霉菌株產(chǎn)生物胺的情況。研究結(jié)果表明，采用微生物學(xué)、高效液相色譜、分子生物學(xué)技術(shù)(PCR)和酶學(xué)4種評(píng)價(jià)方法所得評(píng)價(jià)結(jié)果基本一致，總狀毛霉、雅致放射毛霉、五通橋毛霉、米曲霉2339、米曲霉41380、米曲霉40188這6株試驗(yàn)菌株均產(chǎn)生酪胺，雅致放射毛霉和3株米曲霉能產(chǎn)生色胺，3株米曲霉能產(chǎn)生腐胺，而僅總狀毛霉具有組氨酸脫羧酶活性。霉菌代謝產(chǎn)生生物胺及產(chǎn)生生物胺的種類和含量無種屬特異性，但有菌株個(gè)體特異性。

豆豉；生物胺；毛霉；米曲霉；氨基酸脫羧酶

生物胺是一類含氮低分子量有機(jī)化合物[1]，廣泛存在于多類食品中，對(duì)人體細(xì)胞發(fā)揮正常生理功能起著重要作用，但攝入的濃度過高會(huì)對(duì)人體產(chǎn)生毒害作用，造成人體心血管和神經(jīng)系統(tǒng)的損傷[2]。其中，組胺毒性最大，酪胺次之[3]。腐胺和尸胺雖然本身的毒性很低，但是它們的存在會(huì)使組胺和酪胺的毒性增強(qiáng)[4]。豆豉是以黃豆或大豆為主要原料，利用曲霉、毛霉或者細(xì)菌制曲產(chǎn)生的復(fù)雜酶系，分解大豆中營養(yǎng)物質(zhì)發(fā)酵而成的一種傳統(tǒng)豆制品[5]，可以分為細(xì)菌型、米曲霉型、毛霉型和根霉型豆豉等[6]。生物胺的形成通常需要滿足以下3個(gè)條件[7-8]：含游離氨基酸、存在產(chǎn)氨基酸脫羧酶的微生物和微生物生長的有利環(huán)境。豆豉發(fā)酵過程中微生物代謝產(chǎn)生的氨基酸脫羧酶能催化相應(yīng)的游離氨基酸脫羧生成相應(yīng)的生物胺。此外，游離氨基酸大量存在于豆豉中，所以控制豆豉中生物胺含量的關(guān)鍵在于控制豆豉發(fā)酵過程中能夠產(chǎn)生生物胺的微生物的種類和數(shù)量。

本研究采用微生物學(xué)、高效液相色譜及分子生物學(xué)技術(shù)，同時(shí)結(jié)合測(cè)定菌株氨基酸脫羧酶活性，以評(píng)價(jià)發(fā)酵豆豉常用的6株霉菌產(chǎn)生物胺的情況，重點(diǎn)評(píng)價(jià)其產(chǎn)組胺、酪胺和腐胺的能力。

1 材料與方法

1.1試驗(yàn)菌株

總狀毛霉(Mucorracemosus)、雅致放射毛霉(Actinomucorelegans)、五通橋毛霉(Mucorwutungkiao)、米曲霉2339(滬釀3.042)(Aspergillusoryzae2339)、米曲霉41380(Aspergillusoryzae41380)、米曲霉40188(Aspergillusoryzae40188)6株霉菌，購自中國工業(yè)微生物菌株保藏管理中心(CICC)。

1.2培養(yǎng)基

麥芽浸粉肉湯(MEB)培養(yǎng)基(g/L)：麥芽浸粉20，pH 6.9±0.2，121 ℃高壓滅菌15 min。

麥芽浸粉瓊脂(MEA)培養(yǎng)基(g/L)：麥芽浸粉30，大豆蛋白胨3，瓊脂15，蒸餾水，pH 5.6±0.2，121 ℃高壓滅菌15 min。

液體生物胺檢測(cè)培養(yǎng)基[9](g/L)：MEB培養(yǎng)基中添加 5'-磷酸吡多醛 0.05，溴甲酚紫 0.06，前體氨基酸(L-組氨酸、L-酪氨酸、L-賴氨酸、L-鳥氨酸、L-色氨酸、L-精氨酸和L-苯丙氨酸)各1.0，pH5.3，121 ℃高壓滅菌15 min。

1.3主要試劑

生物胺標(biāo)準(zhǔn)品：腐胺(≥98%)、尸胺(≥98%)、色胺(≥98%)、2-苯乙胺(≥98%)、精胺(≥98%)、亞精胺(≥98%)、組胺(≥99%)、酪胺(≥99%)；5′-磷酸吡哆醛、苯甲酰氯(≥99%)、酪氨酸脫羧酶標(biāo)準(zhǔn)品，美國Sigma公司；甲醇(色譜純)，成都科龍化工試劑廠；L-組氨酸、L-酪氨酸、L-賴氨酸、L-鳥氨酸、L-色氨酸、L-精氨酸、L-苯丙氨酸(分析純)，BIOSHARP公司；Tris、PEP單環(huán)己胺鹽(>98%)，生工生物工程(上海)股份有限公司；磷酸稀醇式丙酮酸(PEP)羧化酶(5 U/mg)、固紫B(≥60%)，上海寶曼生物科技公司；總蛋白定量測(cè)定試劑盒，南京建成生物工程研究所；DNA提取試劑盒，Omega公司；2×Tap mastermi，天根生化科技有限公司；瓊脂糖，Biowest Agarose。其他試劑均為分析純。

1.4主要儀器與設(shè)備

SW-CJ-1F型單人雙面凈化工作臺(tái)，蘇州凈化設(shè)備有限公司；不銹鋼手提式壓力蒸汽滅菌鍋，上海博訊實(shí)業(yè)醫(yī)療設(shè)備廠；DHP-9272型恒溫培養(yǎng)箱，上海齊欣科學(xué)儀器有限公司；Agilent 1260型高效液相色譜儀，安捷倫科技有限公司；5810型冷凍離心機(jī)，德國Eppendorf公司；PGC-21D型可調(diào)式氮吹儀，北京中諾遠(yuǎn)東公司；UV-2450S(E)型紫外分光光度計(jì)，日本島津公司；溫度梯度PCR儀、凝膠成像儀，美國Bio-Rad公司；瓊脂糖凝膠水平電泳裝置，北京東方儀器廠。

2 試驗(yàn)方法

2.1菌種的活化

購買菌種為凍干管，打管后用無菌滴管吸取0.5 mL左右MEB培養(yǎng)基于凍干管中溶解全部凍干菌粉，然后將溶解后的菌懸液轉(zhuǎn)移至盛有4～5 mL MEB培養(yǎng)基的試管中混勻，并取100 μL轉(zhuǎn)接到MEA培養(yǎng)基上。28 ℃靜置培養(yǎng)5～7 d，連續(xù)傳代3次，進(jìn)行活化。

2.2試驗(yàn)菌株產(chǎn)胺能力的微生物學(xué)顯色法

將活化后的試驗(yàn)菌株，分別接種于裝有一定量液體生物胺檢測(cè)培養(yǎng)基的試管中進(jìn)行檢測(cè)，做3組平行，將不接種菌株的空白試管作為對(duì)照試驗(yàn)。28 ℃培養(yǎng)5 d后，觀察培養(yǎng)基顏色變化。

2.3試驗(yàn)菌株產(chǎn)胺能力的HPLC測(cè)定法

2.3.1 生物胺標(biāo)準(zhǔn)曲線的繪制

準(zhǔn)確稱取腐胺、尸胺、色胺、2-苯乙胺、亞精胺、精胺、組胺和酪胺標(biāo)準(zhǔn)品各50 mg于50 mL的容量瓶中，用0.1 mol/L的HCl定容，制成標(biāo)準(zhǔn)儲(chǔ)備液，于4 ℃保存?zhèn)溆谩?/p>

分別吸取上述標(biāo)準(zhǔn)儲(chǔ)備液，用0.1 mol/L的HCl稀釋，配制成終質(zhì)量濃度分別為0.5、1.0、2.0、5.0、10、20、40、60和80 μg/mL的混合標(biāo)準(zhǔn)溶液。然后按2.3.2進(jìn)行柱前衍生處理并上機(jī)分析，繪制出生物胺標(biāo)準(zhǔn)曲線。

2.3.2 生物胺測(cè)定的柱前衍生

吸取2 mL上述各濃度的生物胺混合標(biāo)準(zhǔn)溶液，分別加入2 mol/L NaOH溶液1 mL和苯甲酰氯10 μL，旋渦振蕩混勻后，在30 ℃下避光反應(yīng)40 min，期間每10 min振蕩混勻1次。反應(yīng)完成后，加入飽和NaCl溶液2 mL中斷反應(yīng)。然后加入無水乙醚3 mL進(jìn)行萃取，1 200 r/min離心10 min后，小心移取乙醚層于10 mL離心管中，再重復(fù)萃取1次，合并乙醚層。用氮吹儀35 ℃下吹干，最后用 1 mL甲醇(色譜級(jí))溶解，過有機(jī)相0.45 μm濾膜后進(jìn)行HPLC分析[10]。

2.3.3 樣品的預(yù)處理[11]

將活化后的試驗(yàn)菌株接種于麥芽浸粉肉湯(MEB)培養(yǎng)基中培養(yǎng)24 h后，吸取1 mL菌懸液加入9 mL添加了0.1%前體氨基酸(L-組氨酸、L-酪氨酸、L-賴氨酸、L-鳥氨酸、L-色氨酸、L-精氨酸和L-苯丙氨酸) 的MEB培養(yǎng)基中。28 ℃靜置培養(yǎng)5 d后，吸取培養(yǎng)液2 mL，加入0.1 mol/L HCl溶液2 mL， 4 ℃、12 000 r/min離心5 min，小心吸取上清液2 mL按照2.3.2中的方法進(jìn)行衍生處理。

2.3.4 液相色譜分析條件

色譜柱：Agilent XDB-C18(250 mm×4.6 mm,5 μm)，流動(dòng)相A和B:超純水和甲醇；流速：1.0 mL/min，進(jìn)樣量：20 μL，紫外檢測(cè)波長：254 nm，柱溫：30 ℃[12-13]。進(jìn)行梯度洗脫，洗脫程序見表1。

表1 梯度洗脫程序

2.4試驗(yàn)菌株產(chǎn)胺能力的分子生物學(xué)檢測(cè)法

2.4.1 試驗(yàn)菌株DNA的提取

按照DNA提取試劑盒(Omega Fungal DNA Kit)的操作要求分別提取試驗(yàn)菌株的DNA，分裝后于-20 ℃冰箱待用。

2.4.2 引物的設(shè)計(jì)與選擇

目前，用于擴(kuò)增毛霉中氨基酸脫羧酶基因片段的特異性引物尚未有文獻(xiàn)報(bào)道，本試驗(yàn)選用了文獻(xiàn)[14-20]中報(bào)道最多的10對(duì)用于擴(kuò)增乳酸菌氨基酸脫羧酶片段的引物，以及根據(jù)NCBI數(shù)據(jù)庫中查出已報(bào)道的米曲霉中鳥氨酸和酪氨酸脫羧酶序列設(shè)計(jì)的2對(duì)引物Tdc-F/Tdc-R和Odc-F/Odc-R，它們分別可以特異擴(kuò)增出組氨酸脫羧酶基因片段、酪氨酸脫羧酶基因片斷和鳥氨酸脫羧酶基因片斷。本試驗(yàn)所用引物的設(shè)計(jì)與合成均由生工生物工程(上海)股份有限公司完成。引物序列及擴(kuò)增片段長度見表2。

表2 試驗(yàn)所用引物

2.4.3 PCR擴(kuò)增氨基酸脫羧酶基因片段

①25 μL擴(kuò)增體系：2×Tapmastermix 12.5 μL，引物(10 μmol/L)各1 μL，模板DNA 1 μL，加雙蒸水補(bǔ)足至25 μL。充分混勻后，進(jìn)行PCR擴(kuò)增。

②PCR擴(kuò)增條件[17]：95 ℃預(yù)變性，5 min；循環(huán)30次；95 ℃變性，45s；50 ℃退火，1 min；72 ℃延伸，1 min；72 ℃終延伸，10 min。最后將PCR擴(kuò)增產(chǎn)物在1.4%瓊脂糖凝膠上進(jìn)行電泳驗(yàn)證。

2.4.4 PCR擴(kuò)增產(chǎn)物的測(cè)序及同源性分析

將所得的PCR擴(kuò)增產(chǎn)物送至生工生物工程(上海)股份有限公司進(jìn)行測(cè)序，測(cè)定結(jié)果在NCBI的Blast進(jìn)行同源性分析。

2.5試驗(yàn)菌株氨基酸脫羧酶活力的測(cè)定

采用鄧歡[21]的一種快速定量檢測(cè)氨基酸脫羧酶活力的比色方法測(cè)定，稍作如下修改。

2.5.1 氨基酸脫羧酶標(biāo)準(zhǔn)曲線的繪制

準(zhǔn)確稱取酪氨酸脫羧酶標(biāo)準(zhǔn)品，用勻漿介質(zhì)(pH 7.4，0.01 mol/L Tris-HCl，0.000 1 mol/L EDTA-2Na， 0.8% NaCl溶液，0.01 mol/L蔗糖)配制成終濃度分別為0、0.001、0.002、0.003、0,004、0.005、0.006、0.007 U/μL的標(biāo)準(zhǔn)溶液備用。

吸取反應(yīng)液450 μL (pH 7.5，50 mmol/L Tris， 2 mmol/L PEP單環(huán)己胺鹽，10 mmol/L MgCl2，1 U/mL 磷酸稀醇式丙酮酸羧化酶，5 mmol/L酪氨酸，現(xiàn)配現(xiàn)用)于已編號(hào)的1.5 mL離心管中，對(duì)應(yīng)加入上述不同濃度的酪氨酸脫羧酶標(biāo)準(zhǔn)溶液50 μL，旋渦振蕩混勻后，于37 ℃下反應(yīng)1 h，每隔10 min振蕩混勻1次。反應(yīng)完成后，加入顯色液25 μL(50 mg/mL 固紫B，1% 吐溫80溶液，以上所配溶液均采用無CO2蒸餾水配置)，旋渦振蕩混勻。靜置5 min后用光徑1 cm的比色皿，蒸餾水調(diào)零，空白管用勻漿介質(zhì)代替標(biāo)準(zhǔn)品，于520 nm處測(cè)定各管吸光值。以吸光值為縱坐標(biāo)，以標(biāo)準(zhǔn)品酪氨酸脫羧酶活力單位(U)為橫坐標(biāo)，繪制標(biāo)準(zhǔn)曲線，獲得線性方程：y=0.527 4x+0.098 5，R2=0.998 5。

因本氨基酸脫羧酶活力測(cè)定的原理是通過捕捉氨基酸脫羧酶催化前體氨基酸脫羧形成胺而釋放的CO2顯色，故不同種類的氨基酸脫羧酶的活力均可按上述線性方程來計(jì)算(同時(shí)做空白對(duì)照來排除試劑與樣品造成的顏色誤差，用絕對(duì)OD值進(jìn)行計(jì)算)。

2.5.2 試驗(yàn)菌株樣品的前處理

將試驗(yàn)菌絲放入干凈的研缽中，在液氮條件下充分研磨至白色粉末后，立即轉(zhuǎn)移至預(yù)冷的2 mL離心管中，加入適量預(yù)冷的無菌生理鹽水。用超聲波細(xì)胞粉碎機(jī)冰浴處理3 min，每超聲3 s間隔7 s，功率為300 W。破碎液于4 ℃、16 000 r/min離心15 min。最后小心移取上清液至預(yù)冷的無菌1.5 mL離心管中，置于冰上待測(cè)。

2.5.3 試驗(yàn)菌株樣品的測(cè)定

將預(yù)處理后的菌絲樣品按照2.5.1中的方法測(cè)定吸光值，代入所得標(biāo)準(zhǔn)曲線的線性方程中算出對(duì)應(yīng)的氨基酸脫羧酶活力E實(shí)際(U)。樣品氨基酸脫羧酶比活力(U/mg pro)E樣品=E實(shí)際×稀釋倍數(shù)/總蛋白濃度，其中樣品的總蛋白濃度采用總蛋白定量測(cè)定試劑盒(考馬斯亮藍(lán)法)測(cè)定。

2.6試驗(yàn)數(shù)據(jù)處理

做3組平行試驗(yàn)，數(shù)據(jù)采用Excel 2010與Vector NTI 11軟件進(jìn)行統(tǒng)計(jì)分析和處理，其中以p<0.05說明差異顯著，采用SPSS兩兩比較進(jìn)行顯著性分析。

3 結(jié)果與分析

3.1試驗(yàn)菌株產(chǎn)胺能力的微生物學(xué)法顯色結(jié)果

利用液體生物胺檢測(cè)培養(yǎng)基顯色法，對(duì)6株試驗(yàn)菌株產(chǎn)生物胺的情況進(jìn)行初步檢測(cè)。由圖1可以看出，相較于未接菌株的空白對(duì)照管，氨基酸脫羧酶陰性管表面有菌絲生長且培養(yǎng)基呈現(xiàn)黃色，因?yàn)槠錄]有催化游離氨基酸脫羧產(chǎn)生堿性生物胺的能力，培養(yǎng)基酸堿度沒有發(fā)生改變。而氨基酸脫羧酶陽性管同樣有菌絲生長，其可以催化游離的前體氨基酸脫羧產(chǎn)生生物胺，使培養(yǎng)基偏堿性，而最終呈現(xiàn)紫紅色或紫色。

圖1 液體生物胺檢測(cè)培養(yǎng)基的檢測(cè)結(jié)果Fig.1 Test result of liquid biogenic amine detection medium

微生物顯色法檢測(cè)結(jié)果見表3。除五通橋毛霉外，其余5株試驗(yàn)霉菌均能夠產(chǎn)生不同種類的生物胺，其中5株霉菌產(chǎn)生酪胺，4株霉菌產(chǎn)生色胺，3株霉菌產(chǎn)生腐胺，但只有1株霉菌(總狀毛霉)具有組氨酸脫羧酶活性。但是，由于微生物學(xué)顯色法自身存在一定的局限性，容易出現(xiàn)假陽性或假陰性結(jié)果，故需要進(jìn)一步與其他方法結(jié)合驗(yàn)證。

表3 試驗(yàn)菌株氨基酸脫羧酶活性的的培養(yǎng)基檢測(cè)結(jié)果

注:+表示陽性；-表示陰性。

3.2試驗(yàn)菌株產(chǎn)生物胺能力的HPLC法測(cè)定結(jié)果

3.2.1 標(biāo)準(zhǔn)曲線的繪制

由圖2可知，在液相圖譜上各種生物胺的苯甲酰氯衍生物的分離效果較好，在18 min內(nèi)8種生物胺苯甲酰氯衍生物全部岀峰，速度較快。各生物胺的回歸方程及相關(guān)系數(shù)，見表4。結(jié)果表明，該HPLC法測(cè)定的8種生物胺標(biāo)品，在0.50～80.0 μg/L范圍內(nèi)線性關(guān)系良好(R>0.995)，說明用該方法來測(cè)定8種生物胺具有良好的可靠性。

圖2 生物胺混合標(biāo)準(zhǔn)品溶液的液相色譜圖Fig.2 Chromatogram of biogenic amines standards

生物胺回歸方程相關(guān)系數(shù)R2線性范圍/(μg·L-1)保留時(shí)間/min腐胺y=101.45x+114.930.99740.50-80.06.018尸胺y=70.003x+61.3110.99850.50-80.06.875色胺y=52.319x+139.90.99890.50-80.08.2212-苯乙胺y=51.88x+43.7240.99930.50-80.09.601亞精胺y=69.215x+73.7830.99610.50-80.010.249精胺y=72.624x+45.6210.99840.50-80.013.523組胺y=24.692x-20.6640.99730.50-80.014.990酪胺y=40.771x+92.0620.99790.50-80.017.592

3.2.2 HPLC測(cè)定試驗(yàn)菌株培養(yǎng)液中生物胺含量的結(jié)果

由表5可知，6株菌均產(chǎn)酪胺，含量在1.19～6.57 μg/mL之間；3株菌產(chǎn)腐胺、色胺和精胺，其含量分別在1.02～3.57 μg/mL、0.6～23.91 μg/mL和23.96～72.81 μg/mL之間；僅1株菌產(chǎn)組胺，含量為1.42 μg/mL。與表3得出的結(jié)果大致相同。

3.3試驗(yàn)菌株氨基酸脫羧酶活力的測(cè)定結(jié)果

由表6可以看出，6株菌均具有酪氨酸脫羧酶活力，且活力大小在1.45～6.34 U/mg(pro)；4株菌具有色氨酸脫羧酶活力，活力大小在1.26～8.00 U/mg(pro)；3株菌具有鳥氨酸脫羧酶活力，活力大小在1.35～6.37 U/mg(pro)；僅有1株菌檢測(cè)出具有組氨酸脫羧酶活力。結(jié)合表5各試驗(yàn)菌株的產(chǎn)生物胺能力大小可看出其對(duì)應(yīng)氨基酸脫羧酶活力均與產(chǎn)各生物胺含量成正相關(guān)。

表5 試驗(yàn)菌株培養(yǎng)液中生物胺的HPLC測(cè)定結(jié)果

注:ND表示未檢出，同一列相同字母表示差異不具有顯著性(p>0.05)。

表6 試驗(yàn)菌株氨基酸脫羧酶活力的測(cè)定結(jié)果

注:“—”表示未檢測(cè)出氨基酸脫羧酶活力。

3.4試驗(yàn)菌株產(chǎn)生物胺能力的分子生物學(xué)法檢測(cè)結(jié)果

3.4.1 鳥氨酸、組氨酸和酪氨酸脫羧酶基因的PCR擴(kuò)增結(jié)果

使用12對(duì)不同試驗(yàn)引物分別進(jìn)行PCR擴(kuò)增，結(jié)果表明：以6株試驗(yàn)菌株DNA為模板，以O(shè)dc-F/Odc-R和Tdc-F/Tdc-R為引物，檢測(cè)到3株米曲霉均攜帶有鳥氨酸脫羧酶基因和酪氨酸脫羧酶基因。其PCR 擴(kuò)增條帶的瓊脂糖凝膠電泳圖如圖3。

圖3 PCR法檢測(cè)鳥氨酸脫羧酶和酪氨酸脫羧酶基因Fig.3 PCR detecting for ODC and TDC gene

可以看出擴(kuò)增條帶清晰，且與目標(biāo)條帶大小相符。而其他10對(duì)試驗(yàn)引物PCR均擴(kuò)增不出相應(yīng)的目標(biāo)條帶，說明用于擴(kuò)增乳酸菌和米曲霉中氨基酸脫羧酶基因片段的引物不適用于擴(kuò)增霉菌中氨基酸脫羧酶基因片段，故毛霉中氨基酸脫羧酶基因序列還有待進(jìn)一步研究。

3.4.2 鳥氨酸和酪氨酸脫羧酶基因序列同源性分析

將3株米曲霉鳥氨酸脫羧酶和酪氨酸脫羧酶的PCR擴(kuò)增產(chǎn)物進(jìn)行測(cè)序，測(cè)序結(jié)果在NCBI的Blast上進(jìn)行同源性比對(duì)。分析結(jié)果表明Aspergillusoryzae2339，Aspergillusoryzae41380，Aspergillusoryza40188的PCR擴(kuò)增序列均與AspergillusoryzaeR1B40的鳥氨酸脫羧酶基因和酪氨酸脫羧酶基因序列具有高度同源性(99%)，可初步證明該P(yáng)CR擴(kuò)增產(chǎn)物分別是鳥氨酸脫羧酶基因片段和酪氨酸脫羧酶基因片段。

然后使用Vector NTI 11軟件進(jìn)行比對(duì)，黃色部分表示堿基完全一致，藍(lán)色和空白區(qū)域表示個(gè)別堿基略有差異。由比對(duì)結(jié)果可明顯看出，3株試驗(yàn)米曲霉鳥氨酸脫羧酶和酪氨酸脫羧酶的PCR擴(kuò)增產(chǎn)物測(cè)序結(jié)果與NCBI已報(bào)道的鳥氨基酸脫羧酶和酪氨酸脫羧酶的序列具有高度同源性。由此可以證明采用PCR法擴(kuò)增得到的基因序列確定為鳥氨基酸脫羧酶基因序列和酪氨酸脫羧酶序列。

4 結(jié)論

結(jié)合微生物學(xué)、高效液相色譜(HPLC)、分子生物學(xué)技術(shù)(PCR)和酶學(xué)技術(shù)4種方法，檢測(cè)出總狀毛霉、雅致放射毛霉、五通橋毛霉、米曲霉2339、米曲霉41380、米曲霉40188這6株試驗(yàn)菌株均產(chǎn)生酪胺，雅致放射毛霉和3株米曲霉能產(chǎn)生色胺，3株米曲霉能產(chǎn)生腐胺，而僅總狀毛霉具有組氨酸脫羧酶活性?？梢姡咕a(chǎn)生物胺的種類和含量無種屬特異性，但有菌株特異性，即同一種屬不同菌株產(chǎn)生物胺的能力各不相同，但還需要通過實(shí)際生產(chǎn)來進(jìn)一步驗(yàn)證說明。

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EvaluationofbiogenicaminesproducedbyMucorandAspergillusoryzaeinDouchifermentationprocess

ZHANG Ren-feng1,2,3,CHEN Guang-jing1,2,3,YANG Wan-ming4,HUANG Yuan-hui4, CHENG Xue-dong4,ZENG Fan-yu5,KAN Jian-quan1,2,3*

1(College of Food Science，Southwest University，Chongqing 400715， China) 2(Key Laboratory of Products Processing and Storage of Chongqing,Chongqing 400715， China) 3(Laboratory of Quality & Safety Risk Assessment for Agro-products on Storage and Preservationg (Chongqing), Ministry of Agriculture,Chongqing 400715,China) 4(Chongqing Entry Exit Inspection and Quarantine Bureau Yongchuan Office，Chongqing 400715， China) 5(Yongchuan Douchi Food company limited，Chongqing 400715,China)

The change of biogenic amines content produced by 6 strains ofMucorandAspergillusoryzaein Douchi fermentation process was analyzed using four methods including microbial method, high performance liquid chromatography (HPLC), molecular biology technology (PCR) and the enzyme technology. The results showed that similar results were obtained using these four methods. Six strains ofMucorracemosus,Actinomucorelegans,Mucorwutungkiao,Aspergillusoryzae2339,Aspergillusoryzae41380 andAspergillusoryzae40188 could produce tyramine.Actinomucorelegansand 3 strains ofAspergillusoryzaecould produce tryptamine. Three strains ofAspergillusoryzaecould produce putrescine. OnlyMucorracemosushad histidine decarboxylase activity. Whether mold metabolism produced biogenic amines was not species-specific, but strains-specific.

douci; biogenic amines;Mucor;Aspergillusoryzae; amino acid decarboxylase

碩士研究生(闞建全教授為通訊作者，E-mail：ganjq1965@163.com)。

重慶市永川區(qū)科技計(jì)劃項(xiàng)目(Ycstc,2015ac1015)“永川毛霉型豆豉中生物胺控制的關(guān)鍵技術(shù)研究與應(yīng)用(2015)”資助；重慶市現(xiàn)代特色效益農(nóng)業(yè)技術(shù)體系創(chuàng)新團(tuán)隊(duì)建設(shè)調(diào)味品產(chǎn)業(yè)技術(shù)體系項(xiàng)目(2017[7]號(hào))

2017-05-05，改回日期：2017-06-06

10.13995/j.cnki.11-1802/ts.014726