費(fèi)氏弧菌急性毒性微孔板檢測方法優(yōu)化

余露軍，劉衛(wèi)麗，陳小曲，李建軍

（1. 廣東省實(shí)驗(yàn)動物監(jiān)測所/廣東省實(shí)驗(yàn)動物重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室，廣東 廣州 510663；2. 中海油田服務(wù)股份有限公司，河北 三河 065201）

費(fèi)氏弧菌急性毒性微孔板檢測方法優(yōu)化

余露軍1，劉衛(wèi)麗2，陳小曲1，李建軍1

（1. 廣東省實(shí)驗(yàn)動物監(jiān)測所/廣東省實(shí)驗(yàn)動物重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室，廣東 廣州 510663；2. 中海油田服務(wù)股份有限公司，河北 三河 065201）

為優(yōu)化費(fèi)氏弧菌（Vibrio fischeri）急性毒性微孔板法測試條件，以發(fā)光強(qiáng)度或發(fā)光抑制率為指標(biāo)，研究溫度、鹽度、pH、反應(yīng)體系、稀釋比例、傳代次數(shù)對費(fèi)氏弧菌新鮮菌液生物毒性測試的影響。結(jié)果表明：費(fèi)氏弧菌適宜培養(yǎng)溫度為15～20℃；檢測適宜溫度為15℃，鹽度為15‰～35‰，pH為5～10，檢測體系為1∶10，傳代次數(shù)不宜超過10代，不同稀釋比例對新鮮培養(yǎng)的生長平臺期費(fèi)氏弧菌毒性測試無顯著影響。基于優(yōu)化后的方法，七水硫酸鋅、氯化汞、十二烷基硫酸鈉、苯酚對費(fèi)氏弧菌急性毒性具有顯著的劑量-效應(yīng)關(guān)系，表明該優(yōu)化方法適用于上述物質(zhì)的毒性評價(jià)。

費(fèi)氏弧菌；急性毒性；微孔板；影響因子

隨著工業(yè)化進(jìn)程的推進(jìn)，環(huán)境污染問題日益突出，大量有毒有害污染物被排放到河流、湖泊和海洋，對水生生態(tài)及人體健康造成嚴(yán)重危害，發(fā)展快速高效的水環(huán)境監(jiān)測技術(shù)對環(huán)境保護(hù)具有重要意義。以微孔板為反應(yīng)載體的發(fā)光細(xì)菌光度計(jì)法是近年快速發(fā)展的一種毒性檢測技術(shù)，已應(yīng)用于重金屬［1］、環(huán)境激素類物質(zhì)［2］、有機(jī)磷農(nóng)藥［3］等多種污染物的毒性評價(jià)，具有靈敏度高、測量范圍廣、高通量等優(yōu)點(diǎn)［4］。

費(fèi)氏弧菌、明亮發(fā)光桿菌、青海弧菌是目前應(yīng)用較為廣泛的幾種海、淡水發(fā)光細(xì)菌［5-7］，由于海水、淡水環(huán)境的差異，如鹽度和離子差異直接影響污染物的結(jié)構(gòu)形態(tài)或解吸附效應(yīng)等［8］，從而改變污染物的毒性大小，因此海水、淡水發(fā)光細(xì)菌的應(yīng)用各有側(cè)重。劉保奇等［9］系統(tǒng)研究了pH、菌密度、反應(yīng)時間等試驗(yàn)條件對淡水發(fā)光細(xì)菌青?；【毙远拘晕⒖装宸y試的影響，而海洋發(fā)光細(xì)菌急性毒性微孔板法影響因子研究較少。為此，我們研究了溫度對費(fèi)氏弧菌生長和發(fā)光強(qiáng)度的影響，系統(tǒng)開展了鹽度、pH、檢測溫度、反應(yīng)體系、稀釋比例及傳代次數(shù)對費(fèi)氏弧菌微孔板法毒性測試影響研究，并采用七水硫酸鋅等參比毒物驗(yàn)證優(yōu)化后的測試方法，為建立穩(wěn)定、可重復(fù)的費(fèi)氏弧菌急性毒性微孔板測試方法提供依據(jù)。

1 材料與方法

1.1 試驗(yàn)材料

費(fèi)氏弧菌（Vibrio fischeri）由國家海洋局第一海洋研究所崔志松博士惠贈，-80℃保存。實(shí)驗(yàn)用七水硫酸鋅（ZnSO4·7H2O）、氯化汞（HgCl2）、十二烷基硫酸鈉（SDS）、苯酚為分析純試劑。

主要儀器：微孔板生物發(fā)光光度計(jì)（瑞士TECAN公司，Spark 10M），生化培養(yǎng)箱（上海一恒科學(xué)儀器有限公司，BPMJ-250F），恒溫培養(yǎng)搖床（上海一恒科學(xué)儀器公司，THZ-300C），分光光度計(jì)（島津儀器有限公司，UV1800），鹽度計(jì)（梅特勒-托利，S7），pH計(jì)（梅特勒-托利，S8）。

1.2 試驗(yàn)方法

1.2.1 溫度對生長密度與發(fā)光強(qiáng)度的影響 將菌種接種于2216E平板，20℃培養(yǎng)48 h，挑取單菌落接種到2216E液體培養(yǎng)基，20℃、180 r/min培養(yǎng)24 h至對數(shù)期；按2%轉(zhuǎn)接至100 mL 2216E培養(yǎng)基中，分別于15、20、25℃溫度下，180 r/min培養(yǎng)，定時取樣（1 mL菌液）測定發(fā)光強(qiáng)度（20 μL菌液）和OD600吸光值。

1.2.2 鹽度、pH對發(fā)光抑制率的影響 用NaCl配制不同鹽度的水溶液（pH 7.0±0.2），設(shè)定0‰～45‰鹽度梯度（間隔5‰），以20‰鹽度為對照，每個濃度處理3次重復(fù)，測定15 min的發(fā)光抑制率；配制鹽度為20‰的NaCl溶液，用NaOH和HCl調(diào)節(jié)pH為4～10.5（間隔0.5），以pH 7.0為對照，每個處理3次重復(fù)，測定15 min的發(fā)光抑制率。

微孔板發(fā)光測定方法：20℃、180 r/min條件下培養(yǎng)30（±2）h的新鮮菌液，用20‰ NaCl溶液洗滌處理后，取20 μL加入96孔全白微孔板，測定初始發(fā)光強(qiáng)度；立即加入180 μL試驗(yàn)溶液，15℃恒溫15 min后測定發(fā)光強(qiáng)度；發(fā)光抑制率計(jì)算方法參照 ISO 11348-1：2007［5］。

1.2.3 反應(yīng)體系、檢測溫度、稀釋比例及傳代次數(shù)對毒性測試的影響 選用七水硫酸鋅（ZnSO4·7H2O）作為參比毒物，根據(jù)預(yù)實(shí)驗(yàn)結(jié)果設(shè)定毒性物質(zhì)濃度為60、30、15、7.5、3.75 mg/L，以20‰ NaCl溶液為對照，每個處理3次重復(fù)，測定步驟和結(jié)果計(jì)算同1.2.2中微孔板發(fā)光測定方法。

反應(yīng)體系：在15℃檢測溫度下，利用同一次培養(yǎng)的菌液按1∶10、1∶5、1∶1反應(yīng)體系（菌液與總試液溶液的體積比）進(jìn)行毒性測試。

檢測溫度：按1∶10反應(yīng)體系分別在15℃和20℃進(jìn)行測試。

稀釋比例：新鮮培養(yǎng)的菌液按不同比例稀釋（稀釋后初始發(fā)光強(qiáng)度分別為1.0×105～2.0×105、3.0×105～1.0×106、2.0×106～3.0×106、大于3.0×106），在反應(yīng)體系1∶10、檢測溫度15℃條件下進(jìn)行測試。

傳代次數(shù)：將新鮮培養(yǎng)的菌液按2%轉(zhuǎn)接進(jìn)行傳代培養(yǎng)，每30（±2）h傳代1次，傳至20代，在反應(yīng)體系1∶10、檢測溫度15℃條件下，每5代進(jìn)行毒性測試評價(jià)。

1.2.4 費(fèi)氏弧菌微孔板法測試ZnSO4·7H2O、HgCl2、SDS、苯酚毒性 根據(jù)預(yù)實(shí)驗(yàn)結(jié)果，ZnSO4·7H2O設(shè)定濃度同1.2.3，HgCl2濃度設(shè)定為 0.1、0.067、0.045、0.03、0.02 mg/L，SDS濃度設(shè)定為 200、100、50、25、12.5 mg/L，苯酚濃度設(shè)定為 400、200、100、50、25 mg/L，以 20‰NaCl溶液為對照，每個處理3次重復(fù)，每個污染物測試5次，測定方法和結(jié)果計(jì)算同1.2.2中微孔板發(fā)光測定方法。

采用SPSS17.0軟件進(jìn)行回歸分析和毒性測試結(jié)果顯著分析，毒性測試數(shù)據(jù)對數(shù)轉(zhuǎn)換后，EXCEL擬合曲線并作圖。

2 結(jié)果與分析

2.1 培養(yǎng)溫度對費(fèi)氏弧菌生長密度（OD600）及發(fā)光強(qiáng)度的影響

由圖1可知，15℃條件下，費(fèi)氏弧菌24 h進(jìn)入生長對數(shù)期（OD600達(dá)0.7），36 h進(jìn)入生長平臺期（OD600達(dá)1.6），60 h OD600達(dá)到峰值2.1，之后緩慢下降，發(fā)光強(qiáng)度在60 h達(dá)到峰值（1.2×107），56～72 h發(fā)光強(qiáng)度大于最大發(fā)光強(qiáng)度的60%；20℃條件下，費(fèi)氏弧菌9 h進(jìn)入生長對數(shù)期（OD600達(dá)0.6），18 h進(jìn)入生長平臺期（OD600達(dá)1.6），39 h OD600達(dá)到峰值2.1，之后緩慢下降，發(fā)光強(qiáng)度在34 h達(dá)到峰值（1.045×107），24～42 h發(fā)光強(qiáng)度大于最大發(fā)光強(qiáng)度的60%；25℃條件下，費(fèi)氏弧菌6 h進(jìn)入生長對數(shù)期（OD600達(dá)0.47），15 h進(jìn)入生長平臺期（OD600達(dá)1.4），33 h OD600達(dá)到峰值1.7，之后緩慢下降，發(fā)光強(qiáng)度在24 h達(dá)到峰值（3.91×106），12～29 h發(fā)光強(qiáng)度大于最大發(fā)光強(qiáng)度的60%。結(jié)果表明15℃和20℃條件下費(fèi)氏弧菌最大生長密度和發(fā)光強(qiáng)度沒有明顯差別，發(fā)光穩(wěn)定（大于最大發(fā)光強(qiáng)度的60%時間較長），20℃條件下費(fèi)氏弧菌更快達(dá)到生長平臺期和發(fā)光峰值，但15℃和20℃條件下的生長密度和發(fā)光峰值明顯高于25℃條件下的生長密度和發(fā)光峰值，表明費(fèi)氏弧菌適宜培養(yǎng)溫度為15～20℃。

圖1 不同溫度費(fèi)氏弧菌發(fā)光強(qiáng)度及生長密度變化規(guī)律

2.2 鹽度和pH對費(fèi)氏弧菌發(fā)光抑制率的影響

從圖2可見，鹽度15‰～35‰的水體對費(fèi)氏弧菌發(fā)光抑制率小于10%，表明費(fèi)氏弧菌適宜鹽度為15‰～35‰；從圖3可見，pH 5～10的水體對費(fèi)氏弧菌發(fā)光抑制率小于10%，表明費(fèi)氏弧菌適宜pH為5～10。

2.3 反應(yīng)體系、檢測溫度、稀釋比例對費(fèi)氏弧菌毒性測試的影響

ZnSO4·7H2O對不同反應(yīng)體系費(fèi)氏弧菌的半數(shù)抑制濃度EC50差異極顯著，1∶10反應(yīng)體系下ZnSO4·7H2O對費(fèi)氏弧菌EC50最低（表1）。

15℃條件下ZnSO4·7H2O對費(fèi)氏弧菌EC50極顯著高于20℃條件下檢測結(jié)果，但20℃條件下的變異系數(shù)為58%，高于15℃條件下的變異系數(shù)19%（表1）。

ZnSO4·7H2O對不同稀釋比例（不同初始發(fā)光強(qiáng)度）的菌液毒性測試結(jié)果表明，不同初始發(fā)光強(qiáng)度對費(fèi)氏弧菌EC50沒有顯著差異（表1）。

圖2 鹽度對費(fèi)氏弧菌發(fā)光抑制作用

圖3 pH對費(fèi)氏弧菌發(fā)光抑制作用

表1 反應(yīng)體系、檢測溫度、稀釋比例對發(fā)光細(xì)菌毒性檢測的影響

2.4 傳代次數(shù)對費(fèi)氏弧菌毒性測試的影響

費(fèi)氏弧菌連續(xù)傳代20代，ZnSO4·7H2O對不同傳代次數(shù)費(fèi)氏弧菌毒性測試結(jié)果（表2）顯示，ZnSO4·7H2O 對 F1、F5、F10代費(fèi)氏弧菌EC50無顯著差異，傳代至F15代、F20代時，ZnSO4·7H2O對其EC50顯著降低，表明過多的傳代次數(shù)可顯著影響發(fā)光細(xì)菌毒性測試結(jié)果。

表2 ZnSO4·7H2O對不同傳代次數(shù)費(fèi)氏弧菌半數(shù)抑制濃度

2.5 ZnSO4·7H2O、HgCl2、苯酚、SDS毒性測試結(jié)果

由圖 4可知，ZnSO4·7H2O、HgCl2、苯酚、SDS濃度與費(fèi)氏弧菌發(fā)光抑制度具極顯著的劑量—效應(yīng)關(guān)系（R2=0.98～0.99，P＜0.01）；ZnSO4·7H2O、HgCl2、苯酚、SDS對費(fèi)氏弧菌 EC50分別為 16.4±2.2、0.045±0.01、96.7±13.9、37.0（±5.5）mg/L，變異系數(shù)分別為13%、12%、14%、15%。

3 結(jié)論與討論

圖4 費(fèi)氏弧菌急性毒性微孔板法測試結(jié)果擬合曲線

pH、鹽度對重金屬、多環(huán)芳烴等多種石油污染物的存在形態(tài)、吸附與解吸、遷移性具有不同程度的影響［10-12］，從而影響污染物的生態(tài)毒性，因此生物毒性評價(jià)時應(yīng)盡可能不改變樣品的pH、鹽度等特性。已有研究表明明亮發(fā)光桿菌適宜pH為5.5～8.0［13］，青海弧菌適宜pH為5.0～9.0［14］，而本研究結(jié)果顯示，費(fèi)氏弧菌適宜pH為5～10，適宜鹽度為15‰～35‰，與趙洋甬等［15］研究結(jié)果類似，表明費(fèi)氏弧菌具有較寬的pH和鹽度適應(yīng)范圍，在環(huán)境污染物的毒性評價(jià)中具有一定優(yōu)勢。

國內(nèi)現(xiàn)有方法多以氯化汞作為參比毒物［6，16］。王麗莎等［17］研究表明 Zn2+具有毒性中等、結(jié)果穩(wěn)定、便宜易得等優(yōu)點(diǎn)，且Zn2+與Hg2+毒性之間存在一定相關(guān)性，因此本研究毒性測試選擇ZnSO4·7H2O作為參比毒物。在現(xiàn)有的發(fā)光細(xì)菌毒性研究中，發(fā)光細(xì)菌反應(yīng)體系各不相同［5，18-19］，崔志松等［19］研究表明，發(fā)光細(xì)菌RecA反應(yīng)體系在1∶100時毒性效應(yīng)最明顯。本試驗(yàn)中，反應(yīng)體系1∶10時費(fèi)氏弧菌毒性效應(yīng)最強(qiáng)，且測試結(jié)果變異系數(shù)相對較小，證實(shí)反應(yīng)體系顯著影響費(fèi)氏弧菌毒性測試結(jié)果，因此建議費(fèi)氏弧菌急性毒性微孔板測試方法最佳反應(yīng)體系為1∶10。另外，費(fèi)氏弧菌在15℃和20℃條件下最大生長密度和發(fā)光峰值沒有明顯差異，但不同檢測溫度下費(fèi)氏弧菌毒性測試結(jié)果具有顯著差異，檢測溫度20℃時ZnSO4·7H2O對費(fèi)氏弧菌毒性測試結(jié)果變異系數(shù)（58%）明顯高于15℃條件下的變異系數(shù)（19%），因此建議費(fèi)氏弧菌檢測溫度宜控制在15（±1）℃。

發(fā)光細(xì)菌急性毒性測試應(yīng)用商品化的凍干菌最為普遍，但也存在不同凍干粉批次間活性差異較大、檢測前需要復(fù)蘇等缺點(diǎn)［20］。而新鮮菌液則在一定質(zhì)控條件下可實(shí)現(xiàn)連續(xù)、大批量培養(yǎng)，更加經(jīng)濟(jì)、易得。目前，費(fèi)氏弧菌培養(yǎng)條件已開展相關(guān)研究［21］，但費(fèi)氏弧菌傳代次數(shù)對其毒性測試的影響未見報(bào)道。本研究發(fā)現(xiàn)，經(jīng)過連續(xù)多次傳代后（15代以上），費(fèi)氏弧菌毒性測試結(jié)果出現(xiàn)顯著差異，這種變化可能由發(fā)光調(diào)控相關(guān)基因缺少或突變所致［22］，具體作用機(jī)制有待進(jìn)一步研究。采用新鮮菌液進(jìn)行毒性測試時，建議使用F10代之前的菌液，并應(yīng)建立新鮮菌液的質(zhì)控方法，如依據(jù)參比毒物的毒性數(shù)據(jù)制定質(zhì)量控制圖。

采用優(yōu)化后的微孔板法對ZnSO4·7H2O、HgCl2、苯酚、SDS進(jìn)行毒性評價(jià)驗(yàn)證，費(fèi)氏弧菌發(fā)光抑制度與上述污染物濃度具有極顯著的劑量-效應(yīng)關(guān)系，相關(guān)系數(shù)和變異系數(shù)與經(jīng)典方法基本一致。如ZnSO4·7H2O、HgCl2與費(fèi)氏弧菌發(fā)光抑制度線性相關(guān)系數(shù)R2為0.99，優(yōu)于 Microtox法［23］的 0.95、0.97，ZnSO4·7H2O半數(shù)發(fā)光抑制濃度EC50變異系數(shù)為13%，與ISO11348-1：2007［5］結(jié)果一致，表明該方法適用于上述污染物的急性毒性評價(jià)，且具有較好的重復(fù)性，為建立穩(wěn)定、可重復(fù)的費(fèi)氏弧菌急性毒性微孔板測試方法提供了基礎(chǔ)數(shù)據(jù)。值得注意的是，發(fā)光細(xì)菌作為一種原核生物，在毒性評價(jià)時也存在一些缺陷。王東等［24］研究認(rèn)為發(fā)光細(xì)菌法與糠蝦法毒性測試結(jié)果相關(guān)性系數(shù)僅為0.3；Aruoja等［25］研究表明苯胺類化合物和酚類化合物對月牙藻、費(fèi)氏弧菌毒性趨勢并不一致；發(fā)光細(xì)菌毒性結(jié)果不能完全真實(shí)地反映環(huán)境中污染物對所有生物的急性毒性效應(yīng)［26］。因此，發(fā)光細(xì)菌毒性測試方法存在一定局限性，其適用于哪些物質(zhì)的毒性評價(jià)還需分別試驗(yàn)驗(yàn)證。

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Optimization of acute toxicity test method using microplate for Vibrio fischeri

YU Lu-jun1，LIU Wei-li2，CHEN Xiao-qu1，LI Jian-jun1
（1. Guangdong Laboratory Animals Mornitoring Institute/Key Laboratory of Guangdong Laboratory Animals，Guangzhou 510663，China；2. China Oilfield Services Limited，Sanhe 065201，China）

In order to determine the optimal conditions of acute toxicity test method using microplate for luminescent bacteria （Vibrio fischeri），the effects of temperature，salinity，pH，detection temperature，testing system，dilution ratio，passages on the bioassay ofV. fischeriwere systematically studied with Luminous intensity or inhibitory effect on luminescent bacteria. The results showed that the growth curve ofV. fischerireached plateau and peak value faster at 20℃，but there was no significant difference of growth density and peak value at 15℃ and 20℃. The appropriate culture temperature ofV. fischeriwas 15℃-20℃；The optimal test temperature，salinity，pH value and test system were 15℃，15‰-35‰，5-10 and 1∶10，respectively. The bioassay results were significantly affected by both test temperature and test system ofV. fischeri. There was no significant difference of bioassay results in different dilution ratio （the range of initial luminescence intensity from 10 w to 600 w），but the acute toxicity test results ofV. fischeriwere significantly affected after 15 times of passages. The toxicity of ZnSO4·7H2O，HgCl2，SDS，phenol forV. fischerihad time responses and dose responses by the method above. It showed that the acute toxicity test method using microplate forV. fischeriwas suitable for the toxicity assessment of pollutants above.

Vibrio fischeri；acute toxicity；microplate；influence factor

X502

A

1004-874X（2017）07-0076-07

余露軍，劉衛(wèi)麗，陳小曲，等. 費(fèi)氏弧菌急性毒性微孔板檢測方法優(yōu)化［J］.廣東農(nóng)業(yè)科學(xué)，2017，44（7）：76-82.

2017-04-11

中海油田服務(wù)股份有限公司油田化學(xué)事業(yè)部項(xiàng)目“鉆井液環(huán)保性能評價(jià)平臺建設(shè)”（YHB16YF009）

余露軍（1982-），男，工程師，E-mail：ljyu1212@163.com

李建軍（1972-），男，高級工程師，E-mail：ljj@gdlami.com

（責(zé)任編輯 楊賢智）