一測多評(píng)法測定青錢柳中5種黃酮類成分含量

蔣向輝， 蔣天智， 苑 靜， 王 翔

(凱里學(xué)院 化學(xué)與材料工程學(xué)院， 貴州 凱里 556011)

一測多評(píng)法測定青錢柳中5種黃酮類成分含量

蔣向輝*， 蔣天智， 苑 靜， 王 翔

(凱里學(xué)院 化學(xué)與材料工程學(xué)院， 貴州 凱里 556011)

建立青錢柳中5種主要的黃酮類成分的一測多評(píng)法，驗(yàn)證該方法在青錢柳質(zhì)量評(píng)價(jià)中應(yīng)用的準(zhǔn)確性及可行性.以木犀草素為內(nèi)標(biāo)，分別建立木犀草素與黃酮苷、山奈酚、槲皮素、異槲皮苷的相對(duì)較正因子，計(jì)算青錢柳中黃酮苷、山奈酚、槲皮素與異槲皮苷的量，實(shí)現(xiàn)一測多評(píng).對(duì)來自3個(gè)不同地方的5個(gè)批次的青錢柳樣品，同時(shí)采用外標(biāo)法與一測多評(píng)法測定青錢柳中5種黃酮類成分的含量，并兩種方法測得結(jié)果的差異，對(duì)一測多評(píng)法進(jìn)行含量測定的科學(xué)性與可行性進(jìn)行評(píng)價(jià).結(jié)果表明5種黃酮類成分的相對(duì)校正因子在不樣品中重復(fù)性較好，對(duì)于同批次樣品采用一測多評(píng)法與外標(biāo)法測得的結(jié)果之間沒有顯著性差異.以木犀草素為內(nèi)標(biāo)同時(shí)測定黃酮苷、山奈酚、槲皮素與異槲皮苷的一測多評(píng)法可用于青錢柳的定量分析.

青錢柳； 一測多評(píng)； 黃酮類成分； 含量

青錢柳(Cyclocaryapaliuru)又名搖錢樹、麻柳、青錢李、山麻柳，系胡桃科(Juglandaceae)、青錢柳屬我國特有的藥用植物[1]，主要生長于我國南方山區(qū)[2].青錢柳提取物對(duì)動(dòng)物脂質(zhì)的過氧化有很好的抑制效果，具有較好的抗高血糖癥、抗高脂血與抗炎癥活性，它是我國用于預(yù)防與治療高脂血、肥胖與糖尿病的傳統(tǒng)中藥[3-4].我國加工制造的青錢柳茶是第一個(gè)被美國食品藥品監(jiān)督管理局認(rèn)證的抗高血糖植物茶[5].青錢柳還有抗菌、抗病毒、提神與免疫調(diào)節(jié)的作用[6].青錢柳葉片提取物中有三萜類、多糖類、黃酮類和酚類等多種植物化學(xué)成分[7]，大量的研究表明，青錢柳多糖有良好的降血脂效果[8]，但青錢柳多糖不是僅有的降血脂成分，三萜皂苷類與黃酮類成分與青錢柳的降血脂作用緊密相關(guān)[9].黃酮類成分除具有抗菌、抗癌、抗氧化、抗誘變、抗炎、抗過敏活性外，也具有良好抗糖尿病活性[10].至今已有青錢柳苷、青錢柳酸、山柰酚、槲皮素、異槲皮苷等多種黃酮類成分被分離[11].黃酮類成分是酚類植物成分中的主要類型，其不同化合物種類的生物利用度各不相同[10].植物黃酮類成分作為一種功能性食物成分成為了近年來研究與開發(fā)的熱點(diǎn).

近年來，對(duì)中藥中主要成分進(jìn)行定量分析被認(rèn)為是對(duì)中藥進(jìn)行質(zhì)量控制的有效方法，但該方法必須提供待測目標(biāo)物的高純度標(biāo)準(zhǔn)品.而一測多評(píng)法只須提供一種標(biāo)準(zhǔn)品可以同時(shí)檢測多種成分的含量，該方法作為對(duì)黃連進(jìn)行質(zhì)量評(píng)價(jià)的方法已經(jīng)被2010年版藥典所采納，隨著藥材成分檢測分離技術(shù)的不斷完善，一測多評(píng)法在大黃、三黃、白芷、赤芍等我國大宗中藥材的質(zhì)量評(píng)價(jià)中越來越被推廣使用[12].本研究擬對(duì)青錢柳中黃酮類成分含量進(jìn)行評(píng)估，為采用一測多評(píng)法進(jìn)行青錢柳或青錢柳制劑中活性成分的定量分析提供參考，并為探索各成分在降血糖與降血脂中的作用機(jī)制打下基礎(chǔ).

1 儀器和試藥

Waters2695高效液相色譜儀；PDA紫外檢測器；hermo Hypersil ODS-2 column(5 μm，4.6 mm×250 mm)、 Elite Hypersil ODS-2 column(5 μm，4.6 mm×250 mm)、Thermo Fisher ODS-2 column(5 μm，4.6 mm×250 mm)與Waters Spherisorb ODS-2 column(5 μm，4.6 mm×250 mm)4種色譜柱；EmpowerTM色譜工作站軟件；KQ-500DE型數(shù)控超聲波清洗器；Milli-Q超純水機(jī).甲醇、磷酸為色譜純，其他試劑為優(yōu)級(jí)純.木犀草素、黃酮苷、山奈酚、槲皮素與異槲皮苷標(biāo)準(zhǔn)品均購自湖南省食品藥品檢驗(yàn)研究院.

2 材料與方法

2.1 材料

青錢柳幼葉與老葉與于2011年4月與11月采收于湖南通道(109.77°E，26.16°N)、貴州雷山(108.07°E，26.38°N)、江西新余(114.92°E，27.81N)，經(jīng)湖南懷化學(xué)院劉光華教授鑒定材料均為青錢柳老葉.

2.2 供試品溶液制備

取青錢柳藥材，60℃烘干至恒重，粉碎過20目篩，取過篩后粉末5.00 g，加入250 mL具塞錐形瓶中，按料液比1∶15加入80%的乙醇溶液浸泡2 h，在55℃超聲(60 kHz)提取1 h，繼續(xù)加適量80%的乙醇以補(bǔ)充減少量，振搖，充分溶解，減壓抽濾.再減壓抽濾3次，旋轉(zhuǎn)蒸發(fā)回收乙醇至干，殘?jiān)?5%甲醇轉(zhuǎn)移至10 mL量瓶中，加95%甲醇至刻度，搖勻，采用0.45 μm的微孔濾膜對(duì)溶液進(jìn)行過濾，所得濾液即為供試品溶液.

2.3 混合對(duì)照品溶液的制備

取異槲皮苷、槲皮素、木犀草素、山奈酚、黃酮苷對(duì)照品適量，精密稱定，用甲醇溶解，制成質(zhì)量濃度分別為155.30，110.35，174.50，125.40，137.45 μg/mL的混合對(duì)照品溶液，于4℃冰箱中避光保存，備用.

2.4 標(biāo)準(zhǔn)曲線的制備

精密吸取混合對(duì)照品溶液0.5，1.0，2.0，4.0，6.0，8.0，10.0 mL至10 mL量瓶中，分別加95%甲醇至刻度，搖勻，經(jīng)0.45 μm的微孔濾膜濾過后，采用微量取樣器分別吸取20 μL異槲皮苷、槲皮素、木犀草素、山奈酚與黃酮苷標(biāo)準(zhǔn)品濾液注入高效液相色譜儀.以濃度(C)的對(duì)數(shù)值對(duì)峰面積(A)的對(duì)數(shù)值進(jìn)行線性回歸處理，得異槲皮苷、槲皮素、木犀草素、山奈酚、黃酮苷的回歸方程.結(jié)果表明，5種黃酮類成分在相應(yīng)范圍內(nèi)線性關(guān)系良好(表1).

2.5 統(tǒng)計(jì)分析

實(shí)驗(yàn)數(shù)據(jù)結(jié)果采用平均數(shù)(M)表示，采用SPSS16.0軟件進(jìn)行方差分析與成對(duì)數(shù)據(jù)T檢驗(yàn)，P<0.05表示兩者之間差異達(dá)到顯著水平.

3 方法與結(jié)果

3.1 一測多評(píng)方法學(xué)考察

3.1.1 色譜條件 反相C18柱(5 μm，250 mm × 4.6 mm)；流動(dòng)相：甲醇-0.5%冰醋酸(20∶80)；流速：0.4 mL/min；進(jìn)樣量：20 μL；檢測波長 350 nm；柱溫：30℃.在該色譜條件下，混合對(duì)照品和青錢柳供試品溶液分別進(jìn)樣，不同批次樣品中黃酮類成分都能達(dá)到基線分離(圖1).

1-異槲皮苷; 2-槲皮素; 3-木犀草素; 4-山奈酚; 5-黃酮苷1-isoquercitrin; 2-quercetin; 3-luteolin; 4-kaempferol; 5-flavonoid glycoside圖1 混合對(duì)照品(A)和樣品(B)HPLC圖Fig.1 HPLC chromatograms of reference substances(A) and sample (B)

3.1.2 相對(duì)校正因子(fsi)的計(jì)算 以木犀草素為內(nèi)參物，計(jì)算fsi.fsi=fs/fi=lgAs×lgCi/lgCs×lgAi.As為內(nèi)參物木犀草素峰而積，Cs為木犀草素質(zhì)量百分比濃度，Ai為某待測成分i的峰而積，Ci為待測成分i的質(zhì)量百分比濃度.結(jié)合“2.4”項(xiàng)下系列質(zhì)量百分比濃度對(duì)照品溶液所得峰面積數(shù)據(jù)，分別計(jì)算木犀草素對(duì)異槲皮苷、槲皮素、山奈酚與黃酮苷的fsi，結(jié)果見表2.

表1 5種黃酮類成分的線性關(guān)系和范圍Tab.1 Linear relationship and ranges of five flavonoids

表2 5種黃酮類成分的相對(duì)校正因子Tab.2 RCF of five flavonoids

3.1.3 精密度試驗(yàn) 采用微得取樣器吸取混合對(duì)照品溶液20 μL，按“3.1.1”項(xiàng)色譜條件連續(xù)進(jìn)樣6次，計(jì)算色譜峰的峰面積，異槲皮苷、槲皮素、木犀草素、山奈酚與黃酮苷峰面積的RSD分別為2.15%， 2.66%， 1.92%， 2.45%與1.88%， 結(jié)果表明，儀器精密度較好.

3.1.4 穩(wěn)定性試驗(yàn) 分別取產(chǎn)自湖南通道、貴州雷山與江西新余的青錢柳供試品溶液各3份，分別于制備后0，2，4，8，16， 20，24 h進(jìn)樣測定，異槲皮苷、槲皮素、木犀草素、山奈酚與黃酮苷峰面積的RSD分別為2.51%，1.87%， 2.43%，1.82%與1.93%，結(jié)果表明供試品溶液穩(wěn)定性良好.

3.1.5 重復(fù)性試驗(yàn) 精密稱取產(chǎn)自湖南通道、貴州雷山與江西新余的青錢柳供試品樣品各3份，按“2.2”項(xiàng)下方法制備供試品溶液，測得異槲皮苷、槲皮素、木犀草素、山奈酚與黃酮苷質(zhì)量分?jǐn)?shù)的RSD值分別為1.92%，2.43%，1.74%，2.42%與2.18%，表明本方法重復(fù)性良好.

3.1.6 加樣回收率試驗(yàn) 取已測定的青錢柳老葉粉末約2.5 g，精密稱定，平行6份，分別加入相當(dāng)于藥材中各指標(biāo)成分量的對(duì)照品溶液，根據(jù)“2.2”項(xiàng)的方法制備供試品溶液，測定各黃酮類成分含量，計(jì)算加樣回收率.結(jié)果顯示，異槲皮苷、槲皮素、木犀草素、山奈酚與黃酮苷的加樣回收率分別為99.32%，103.2%，99.12%，98.34%與102.76%，RSD值分別為2.52%，2.47%，2.19%，1.88%與2.93%.

3.2 QAMS耐用性和系統(tǒng)適應(yīng)性評(píng)價(jià)

3.2.1 校正因子的重現(xiàn)性考察 取5種黃酮類成分的混和對(duì)照品溶液，標(biāo)為1號(hào)，另取混和對(duì)照品溶液分別稀釋2×、10×、20×、40×，分別為2號(hào)、3號(hào)、4號(hào)和5號(hào)，在高效液相色譜儀上考察 Thermo Hypersil ODS-2 column(5 μm，4.6 mm×250 mm)、Elite Hypersil ODS-2 column(5 μm，4.6 mm×250 mm)、Thermo Fisher ODS-2 column(5 μm，4.6 mm×250 mm)與Waters Spherisorb ODS-2 column(5 μm， 4.6 mm×250 mm)4種色譜柱對(duì)校正因子的影響.測得的相對(duì)校正因子及其相對(duì)標(biāo)準(zhǔn)差(RSD)如表3所示，結(jié)果顯示不同色譜柱所測得的青錢柳中5種黃酮類成分的相對(duì)校正因子之間沒有顯著性差異，且RSD也均小于2%.

表3 不同色譜柱對(duì)fsi的影響Tab.3 Effect of different columns on RCFs

3.2.2 待測組分色譜峰的定位 通過計(jì)算在不同色譜柱中各待測成分色譜峰與木犀草素色譜峰的相對(duì)保留時(shí)間(rsi)，對(duì)各待測成分進(jìn)行定位，結(jié)果見表4.結(jié)果顯示，不同儀器和色譜柱測得的rsi相對(duì)誤差均小于2%，表明利用rsi進(jìn)行峰的定位是可行的.

表4 不同色譜柱對(duì)rsi的影響Tab.4 Relative retention time (RRT) obtained by different columns

3.2.3 QAMS與外標(biāo)法測定結(jié)果的比較 取采自不同產(chǎn)地的青錢柳老葉與幼葉粉末，按“2.2”項(xiàng)下供試品溶液制備方法制備供試品溶液，精密吸取20 μL注入液相色譜儀，按“3.1.1”項(xiàng)下色譜條件測定.分別采用外標(biāo)法和QAMS計(jì)算青錢柳老葉與幼葉中異槲皮苷、槲皮素、木犀草素、山奈酚與黃酮苷的含量，結(jié)果見表5，結(jié)果顯示，對(duì)QAMS與外標(biāo)法所測得的各指標(biāo)成分含量進(jìn)行T檢驗(yàn)所得的P值均大于0.05，表明2種測定方法得到的含量之間無顯著性差異，結(jié)果表明QAMS用于青錢柳老葉與幼葉中多種黃酮類成分質(zhì)量評(píng)價(jià)是可行的.

表5 QAMS與外標(biāo)法測定青錢柳黃酮類成分含量比較Tab.5 Comparison of flavonoids content in Cyclocarya paliurus by QAMS and external standard method

4 結(jié)論

在過去20年，天然產(chǎn)物來源的化合物大部分在臨床治療中表現(xiàn)了很好的效果，從我國傳統(tǒng)的藥用植物中鑒定和分離的天然化合物為疾病新型療法的發(fā)展提供了一個(gè)很好的契機(jī)[13].藥用植物中黃酮類成分中的疏水鍵與蛋白有較好的親和作用，容易與酶形成集合體，因此表現(xiàn)出對(duì)酶的活性很好的抑制作用[14]，黃酮、黃酮醇、單寧、查爾酮、木犀草素等活性成分對(duì)胰脂肪酶有很好的抑制活性[13].Wu等[15]通過動(dòng)物實(shí)驗(yàn)發(fā)現(xiàn)，青錢柳葉的水提物與醇提取物對(duì)于降血糖、降血壓和抗腫瘤都有很好的效果.易醒等[16]分別采用水提法與醇提法從青錢柳葉中分離并確證了山柰酚、槲皮素和異槲皮苷等3個(gè)黃酮類化合物，謝明勇等[17]采用反相高效液相色譜法對(duì)青錢柳醇提物與水提物中3個(gè)黃酮類化合物的含量進(jìn)行了比較，其中醇提物中異槲皮甙、槲皮素與山奈酚含量分別為0.543%、0.0615%與0.0387%，而水提取物中異槲皮甙、槲皮素與山奈酚含量分別為0.464%、0.0603%、0.0337%，結(jié)果表明不同溶劑提取物中3個(gè)黃酮類化合物的含量差異不明顯.譚霖等[18]采用外標(biāo)法同時(shí)測定青錢柳中槲皮素含量在0.0663%～0.0815%之間，山柰酚含量在0.0587%～0.0716%之間.本研究采用一測多評(píng)法測得異槲皮甙含量與前人研究結(jié)果無明顯差異，但山柰酚含量在不同產(chǎn)地來源的青錢柳中差異較大，這可能與山柰酚的合成受氣候與生態(tài)環(huán)境的影響較大有關(guān).

本研究利用HPLC儀組合 PDA紫外檢測的方法建立了青錢柳5類黃酮類成分的檢測技術(shù).本研究所測定的5種成分中，木犀草素在各樣品中含量差異較小，對(duì)照品易得，故以其作為內(nèi)參物建立青錢柳藥材的QAMS法，該法測得青錢柳中5種黃酮類成分含量與采用傳統(tǒng)外標(biāo)法測得值之間沒有顯著性差異，表明本方法可以在對(duì)照品缺失的情況下，以木犀草素為對(duì)照品進(jìn)行青錢柳藥材中多種黃酮類成分的分析評(píng)價(jià).本研究考察了4種不同品牌、不同型號(hào)的色譜柱對(duì)5種黃酮類成分相對(duì)校正因子重現(xiàn)性的影響，對(duì)相對(duì)校正因子應(yīng)用性與可行性進(jìn)行評(píng)價(jià)，結(jié)果表明相對(duì)校正因子不同色譜柱之間重現(xiàn)性較好，一測多評(píng)法測定結(jié)果與傳統(tǒng)外標(biāo)法測定結(jié)果無顯著性差異，說明一測多評(píng)可以同時(shí)測定青錢柳藥材異槲皮苷、槲皮素、木犀草素、山奈酚與黃酮苷.本研究為一測多評(píng)法在青錢柳藥材質(zhì)量控制中的應(yīng)用提供了參考和依據(jù).

在植物藥中同時(shí)進(jìn)行多種有效成分的含量檢測將是藥材質(zhì)量控制發(fā)展的趨勢(shì).一測多評(píng)法是基于檢測器響應(yīng)與成分含量之間的線性關(guān)系的原理，通過同一標(biāo)準(zhǔn)物來換算中藥材中共存的藥用成分的相對(duì)轉(zhuǎn)換因子，相對(duì)轉(zhuǎn)換因子是根據(jù)其紫外吸收與標(biāo)準(zhǔn)品紫外吸收的相對(duì)比率來確定，這種方法適合于有相似的紫外吸收特性的多種化合物的分析.在一測多評(píng)法檢測中實(shí)驗(yàn)參數(shù)對(duì)檢測的準(zhǔn)確性至關(guān)重要，但至今很少有準(zhǔn)確性與影響參數(shù)的相關(guān)研究，為了進(jìn)一步增強(qiáng)一測多評(píng)法在中藥材質(zhì)量評(píng)價(jià)中可行性與可信度，影響一測多評(píng)法準(zhǔn)確性的主要實(shí)驗(yàn)參數(shù)及其影響方式急待全面深入的研究.

[1] ZHU K N， JIANG C H， TIAN Y S， et al. Two triterpeniods fromCyclocaryapaliurus(Batal) Iljinsk (Juglandaceae) promote glucose uptake in 3T3-L1 adipocytes: The relationship to AMPK activation[J]. Phytomedicine， 2015，6: 1-10．

[2] XIE M Y， LI L. Review in studies on chemical constituents and bioactivities ofCyclocaryapaliurus[J]. Chin Tradit Herb Drugs，2001，32:365-366．

[3] DONG C J， XIE M Y， NIE S P， et al. Study on antioxidant activity ofCyclocaryapaliurus(Bata1.) Iljinskaya extracts in vitro[J]. Food Sci， 2007，28:31-34．

[4] JIANG C， YAO N， WANG Q， et al.Cyclocaryapaliurusextract modulates adipokine expression and improves insulin sensitivity by inhibition of inflammation in mice[J]. J Ethnopharmacol， 2014，153: 344-351．

[5] WANG Q Q， JIANG C H， FANG S Z， et al. Antihyperglycemic， antihyperlipidemic and antioxidant effects of ethanol and aqueous extracts ofCyclocaryapaliurusleaves in type 2 diabetic rats[J]. J Ethnopharmacol， 2013，150: 1119-1127．

[6] DENG L H， LEI J D， HE J， et al. Evaluation on genotoxicity and teratogenicity of aqueous extract fromCyclocaryapaliurusleaves[J]. The Scientific World J， 2014，2014: 1-12．

[7] XIE M Y， XIE J H. Review about the research onCyclocaryapaliurus(Batal.) Il-jinskaja[J]. J Food Sci Biotechnol， 2008，27: 113-121．

[8] HUANG M Q， SHANGGUAN X C， XU M S， et al. Studies on hypolipemic effect ofCyclocaryapaliurus(Batal) Iljinskaja polysaccharide[J]. Acta Agric Univ Jiangxiensis， 2011，33: 157-161．

[9] JIANG C H， WANG Q Q， WEI Y J， et al. Cholesterol-lowering effects and potential mechanisms of different polar extracts fromCyclocaryapaliurusleave in hyperlipidemic mice[J]. J Ethnopharmacol， 2015，176: 17-26．

[10] DENG B， SHANG X L， FANG S G， et al. Integrated effects of light intensity and fertilization on growth and flavonoid accumulation inCyclocaryapaliurus[J]. J Agric Food Chem， 2012，60: 6286-6292．

[11] XIE J H， DONG C J， NIE S P， et al. Extraction， chemical composition and antioxidant activity of flavonoids fromCyclocaryapaliurus(Batal.) Iljinskaja leaves[J]. Food Chem， 2014，6(106): 1-9．

[12] WANG C Q， JIA X H， ZHU S， et al. A systematic study on the influencing parameters and improvement of quantitative analysis of multi-component with single marker method using notoginseng as research subject[J]. Talanta， 2015，134: 587-595．

[13] YAMAMOTO M，SHIMURA S， ITOH Y， et al. Anti-obesity effects of lipase inhibitor CT-II， an extract from edible herbs， Nomame Herba， on rats fed a high-fat diet[J]. Int J Obes， 2000，24: 758-764．

[14] RAHUL B B， KAMLESH K B. Pancreatic lipase inhibitors from natural sources: unexplored potential[J]. Drug Discov Today， 2007，12(19): 879-889．

[15] WU Z F， GAO T H， ZHONG R L， et al. Antihyperlipidaemic effect of triterpenic acid enriched fraction fromCyclocaryapaliurusleaves in hyperlipidaemic rats[J]. Pharm Biol， 2016，55(1): 712-721．

[16] 易 醒， 石建功， 周光雄， 等. 青錢柳化學(xué)成分研究[J]. 中國中藥雜志， 2002，27(1)：43-45．

[17] 謝明勇， 余迎利， 王遠(yuǎn)興， 等. 青錢柳黃酮化合物結(jié)構(gòu)及含量[J]. 南昌大學(xué)學(xué)報(bào)(理科版)， 2002，27(1): 49-52．

[18] 譚 霖， 楊 鑫， 龍 瀅， 等. 黔東南州產(chǎn)青錢柳黃酮類成分的含量測定研究[J].貴州科學(xué)， 2016，34(4):77-81.

DeterminationoffivemainflavonoidsincontentinCyclocaryapaliurusbymulti-componentswithsinglemarker

JIANG Xianghui， JIANG Tianzhi， YUAN Jing， WANG Xiang

(College of Chemistry and Materials Engineering， Kaili University， Kaili， Guizhou 556011)

To establish a method for simultaneously determination for the content of five main flavonoids (luteolin， flavonoid glycoside， kaempferol， quercetin and isoquercitrin) inCyclocaryapaliurusby single marker， which is feasible and accurate. Taking luteolin as internal standard substance， to establish a method for quantitative analysis of multi-components with single marker. To determinate the content of luteolin， flavonoid glycoside， kaempferol， quercetin and isoquercitrin inCyclocaryapaliurus. The contents in 5 batches of samples came from 3 different regions were determined by both external standard method and quantitative analysis multi-components by single marker(QAMS). The scientificity and feasibility of the method were evaluated by comparison of the quantitative results between external standard method and QAMS. The results showed that the relative correction factor (RCF) was perfect. The results calculated with a single marker were consistent with the results by the external standard method. The method with a single marker is accurate and feasible to evaluate the quality of Cyclocarya paliuru．

Cyclocaryapaliuru; quantitative analysis multi-components by single marker; flavonoids; content

O626.9

A

2017-04-10.

貴州省科技廳聯(lián)合基金項(xiàng)目(黔科合LH字[2014]7219)；貴州省科學(xué)技術(shù)基金項(xiàng)目(黔科合J字[2015]2131)；貴州省教育廳重點(diǎn)項(xiàng)目(黔教合KY字[2014]281; 黔教合KY字[2014]228)；湖南省科技計(jì)劃重點(diǎn)項(xiàng)目(2013FJ4324).

*通訊聯(lián)系人. E-mail: jxfei789@163.com.

10.19603/j.cnki.1000-1190.2017.05.011

1000-1190(2017)05-0620-06