蘇布達(dá),阿 潤(rùn),那生桑
(內(nèi)蒙古醫(yī)科大學(xué)蒙醫(yī)藥研究院,內(nèi)蒙古 呼和浩特 010110)
大黃蒙醫(yī)酒燜炮制機(jī)理及有效性研究
蘇布達(dá),阿 潤(rùn),那生桑
(內(nèi)蒙古醫(yī)科大學(xué)蒙醫(yī)藥研究院,內(nèi)蒙古 呼和浩特 010110)
目的探討蒙醫(yī)酒燜炮制大黃的原理,優(yōu)化酒燜炮制工藝,并對(duì)其安全、有效性進(jìn)行初步評(píng)價(jià)。方法采用高效液相色譜(HPLC)法分析大黃與酒燜大黃中總蒽醌與游離蒽醌的含量變化;對(duì)大黃酒燜炮制,以藥材與酒的比例、燜潤(rùn)時(shí)間和加熱時(shí)間為3個(gè)因素,每個(gè)因素選3個(gè)水平作正交試驗(yàn),優(yōu)選最佳工藝條件;通過(guò)酒燜大黃對(duì)小鼠瀉下作用和急毒性試驗(yàn)初步評(píng)價(jià)大黃炮制飲片的安全、有效性。結(jié)果酒燜大黃結(jié)合型蒽醌的含量明顯低于生大黃,瀉下作用明顯緩和,酒燜大黃組始排黑便時(shí)間長(zhǎng)于生大黃組和模型組,排便次數(shù)少于這兩組,酒燜大黃組稀便級(jí)和稀便率明顯下降;急毒試驗(yàn)最大耐受量遠(yuǎn)超過(guò)臨床劑量(0.06 g/kg)的100倍,無(wú)小鼠死亡及中毒現(xiàn)象,解剖觀察試驗(yàn)鼠主要臟器無(wú)特殊改變;正交試驗(yàn)結(jié)果顯示以大黃與酒質(zhì)量體積比1∶7.5(kg/L)、燜潤(rùn)1 h、加熱燜制4 h為效果最佳。結(jié)論大黃經(jīng)蒙醫(yī)理論的合理炮制,可明顯緩和其下瀉強(qiáng)度,消除疼痛等不良反應(yīng),降低毒性,從而增加大黃療效,擴(kuò)大用藥范圍。
蒙藥;大黃;酒燜大黃;炮制工藝;藥理;毒理
大黃為蓼科植物掌葉大黃 Rheum palmatum L.、唐古特大黃 Rheum tanguticum Maxim.ex Balf.或藥用大黃 Rheum officinale Baill.的干燥根及根莖[1]。蒙藥大黃味苦、酸,性涼,具稀、輕、動(dòng)、糙諸效,有泄瀉、清熱、解毒、收斂瘡瘍、消食等功效[2-3]?,F(xiàn)代藥理學(xué)研究表明,大黃中的活性成分具有瀉下、抗炎、抗菌、抗病毒、降壓調(diào)脂、抗腫瘤等作用[4]。大黃含有游離型和結(jié)合型蒽醌類衍生物、蒽酮類、二苯乙烯類、苯丁酮類鞣質(zhì)類、多糖類等成分。蒽醌類是大黃中研究最多的活性成分,分為游離型與結(jié)合型,其中游離型有大黃酸、大黃素、土大黃素、蘆薈大黃素、大黃素甲醚、異大黃素、大黃酚、蟲漆酸D等,結(jié)合型有大黃素甲醚葡萄糖苷、蘆薈大黃素葡萄糖苷、大黃素葡萄糖苷和大黃酚葡萄糖苷,以及番瀉苷 A,B,C,D,E,F(xiàn) 等[5]。結(jié)合型蒽醌以番瀉苷為主,是致瀉的主要活性成分。蒙醫(yī)善用大黃,根據(jù)需要行特殊炮制,以降低瀉下駿烈性。大黃炮制方法有酒燜法[6]、炒法。蒙醫(yī)酒燜炮制大黃的方法有別于中醫(yī)酒炙法和酒燉法[7],炮制目的是緩和其瀉下作用,避免導(dǎo)瀉中所致疼痛。本研究中探討了蒙醫(yī)酒燜炮制大黃的機(jī)理,旨在優(yōu)化其炮制工藝。現(xiàn)報(bào)道如下。
SCL-10AVP型液相色譜儀(日本島津公司);JA503型電子天平,AB135-S型電子分析天平,均為德國(guó)產(chǎn);HH-S8型恒溫水浴鍋(北京格外永興儀器有限公司);SKG-02500型烘干箱(廣西恒豐醫(yī)療器械有限公司);KQ-250DE型超聲波清洗器(昆山市超聲波儀器有限公司);HX-100型高速粉碎機(jī)(浙江永康儀器有限公司);電子萬(wàn)用爐(天津市中環(huán)實(shí)驗(yàn)電爐有限公司)。
大黃藥材、大黃粉及其水煎液:大黃購(gòu)自內(nèi)蒙古天康蒙中醫(yī)藥有限責(zé)任公司,經(jīng)內(nèi)蒙古食品藥品檢驗(yàn)所主任藥師康雙龍鑒定為蓼科植物藥用大黃 Rheum officinale Baill.的干燥根莖。先除去雜質(zhì),洗凈,潤(rùn)透,切8~12 mm厚片,晾干;臨用時(shí)粉碎,過(guò)4號(hào)篩,為大黃粉;取大黃粉25 g加 10倍量水浸0.5 h,煮沸 20 min,離心,取上清液,殘?jiān)偌?倍水,同法煎煮,取上清液,合并,加熱濃縮成500 g/L質(zhì)量濃度的水煎液,為大黃水煎液。
酒燜大黃粉及其水煎液:取酒燜大黃片(本實(shí)驗(yàn)室自行炮制品[8]),同上法粉碎,為酒燜大黃粉;同上法水煎制備,為酒燜大黃水煎液。
番瀉葉:購(gòu)自呼和浩特藥材公司,批號(hào)為6928798310962。試驗(yàn)臨時(shí)取番瀉葉粉加水配制成8%濃度的混懸液,備用[9]。
對(duì)照品:蘆薈大黃素(批號(hào)為110795-201007),大黃酸(批號(hào)為 110757-200206),大黃素(批號(hào)為110756-200110),大黃酚(批號(hào)為 110796-201017),大黃素甲醚(批號(hào)為110758-201013),均由中國(guó)食品藥品檢定研究院提供。
其他:印度墨汁購(gòu)自呼和浩特藥材公司;水為超純水,甲醇為色譜純,三氯甲烷、無(wú)水乙醇、乙醚等為分析純,均為市售正品。白酒(草原白酒 60°,批號(hào)為6920685030083,內(nèi)蒙古太仆寺旗草原釀酒有限責(zé)任公司)。
昆明種小鼠,體質(zhì)量(20 ±2)g,雌雄兼有,6 周齡,動(dòng)物合格證編號(hào)為內(nèi)實(shí)動(dòng)管質(zhì)<98>8號(hào),潔凈度為國(guó)家二級(jí),SPF級(jí)環(huán)境飼養(yǎng)、試驗(yàn),由內(nèi)蒙古大學(xué)試驗(yàn)動(dòng)物研究中心提供,實(shí)驗(yàn)結(jié)束后將存活小鼠在乙醚麻醉下,斷頭處死,冷凍處理,送醫(yī)學(xué)廢料處理廠處置。
2.1.1 色譜條件
色譜柱:Nuclesil ODS 柱(250 cm ×4 mm,5 μm);流動(dòng)相:含 0.1%高氯酸的 80% 甲醇溶液;流速:0.5 mL /min;檢測(cè)波長(zhǎng):254 nm。
2.1.2 溶液制備
對(duì)照品溶液:取蘆薈大黃素、大黃酸、大黃素、大黃酚和大黃素甲醚各2 mg,精密稱定,分別置25 mL棕色容量瓶中,各加入甲醇5 mL,使溶解,加甲醇定容,得標(biāo)準(zhǔn)貯備液。分別依次吸取標(biāo)準(zhǔn)貯備液 0.1,1.0,1.0,0.5,0.5 mL,置 5 mL 棕色容量瓶中,加甲醇定容,混勻,作為混合對(duì)照品溶液。
供試品溶液:取大黃粉和酒燜大黃粉0.1 g,精密稱定,置50 mL磨口具塞錐形瓶中,精密加入甲醇20 mL,室溫浸15 h,經(jīng)干燥濾紙濾過(guò),棄初濾液,取續(xù)濾液備用。精密吸取上述續(xù)濾液5 mL,置20 mL具塞試管中,水浴上蒸干甲醇,加水2 mL,振搖使殘?jiān)芙?,置冰浴中放冷后精密加入乙?0 mL及鹽酸0.2 mL,立即密塞并劇烈振搖3 min,分層,精密量取乙醚液5 mL,置具塞試管中,在氣流下?lián)]盡乙醚,加入甲醇2 mL使殘?jiān)芙?,用濾膜濾過(guò),得供試品溶液Ⅰ(游離蒽醌)。精密吸取上述續(xù)濾液2.5 mL,置20 mL具塞試管,水浴,蒸干甲醇,加水 2 mL、鹽酸 0.2 mL,置沸水浴中水解30 min,移出,冰浴,放冷,精密加入乙醚10 mL,按上述方法“立即密塞并劇烈振搖3 min”起操作,得供試品溶液Ⅱ(總蒽醌苷元)。
2.1.3 線性關(guān)系考察
按擬訂色譜條件,取混合對(duì)照品溶液 2,4,6,8,10 μL 進(jìn)樣,以進(jìn)樣量(X,μL)為橫坐標(biāo)、峰面積(Y)為縱坐標(biāo)繪制標(biāo)準(zhǔn)曲線,得回歸方程。見表1。
2.1.4 樣品含量測(cè)定
在擬訂色譜條件下,分別進(jìn)樣供試品溶液Ⅰ和供試品溶液Ⅱ各4 μL,按標(biāo)準(zhǔn)曲線方程計(jì)算各樣品中總蒽醌與游離蒽醌的含量。結(jié)合型蒽醌總量=總蒽醌量-游離型蒽醌總量。結(jié)果見表2和圖1??梢?,大黃炮制前后結(jié)合型蒽醌的含量由0.384%降為0.056%,炮制后結(jié)合型蒽醌的含量顯著降低;游離型蒽醌的含量從0.608%增加至0.716% 。說(shuō)明炮制可促進(jìn)蒽醌的轉(zhuǎn)化,而總蒽醌的含量從0.992%降為0.772%。
蒙醫(yī)對(duì)大黃藥材的炮制有諸多方法,但利用緩和瀉下功能時(shí)常采用酒燜法。本研究中選擇酒燜法,以游離大黃素含量(同2.1項(xiàng)下方法測(cè)定,以大黃素為對(duì)照品)為評(píng)價(jià)指標(biāo),以大黃與酒質(zhì)量體積比(因素A)、燜潤(rùn)時(shí)間(因素B)和加熱燜制時(shí)間(因素C)為3個(gè)因素,每個(gè)因素選3個(gè)水平,選用 L9(34)正交表,完成正交試驗(yàn)[11]。結(jié)果見表3至表5。可見,影響因素次序?yàn)锽>C>A,最佳工藝條件為 B1C3A2,即大黃與酒之比為 1 ∶7.5(kg /L),燜潤(rùn)1 h,加熱燜制4 h為最佳工藝。其中燜潤(rùn)時(shí)間和加熱時(shí)間對(duì)大黃素含量有顯著性影響(P<0.05),而大黃
與酒的比例無(wú)顯著性影響(P>0.05)。
表1 對(duì)照品溶液線性關(guān)系考察結(jié)果(n=5)
表2 大黃與酒燜大黃的蒽醌含量測(cè)定結(jié)果
圖1 含量測(cè)定高效液相色譜圖
表3 炮制工藝優(yōu)化因素水平表
表4 炮制工藝優(yōu)化 L9(34)正交試驗(yàn)方案及結(jié)果
表5 大黃素含量方差分析結(jié)果
2.3.1 急性毒性試驗(yàn)[12]
因受試藥容量限制未測(cè)出半數(shù)致死量(LD50),僅測(cè)了最大給藥量。取昆明系小鼠40只,雌雄各半,隨機(jī)分為兩組,每組20只。禁食12 h后給藥組以1.2 g/mL質(zhì)量濃度的酒燜大黃煎劑每20 g體質(zhì)量0.8 mL,每24 h灌胃2次;對(duì)照組灌胃等量水。給藥當(dāng)天,與給藥組相比,對(duì)照組小鼠活動(dòng)減少、排便偏多,多呈稀便,其余未見顯著異常;給藥1~3 d小鼠體質(zhì)量?jī)山M間無(wú)差異(P>0.05),第4~8日給藥組小鼠體質(zhì)量增長(zhǎng)遲于對(duì)照組(P <0.05),第 8日后差異消失(P >0.05)。試驗(yàn)過(guò)程中無(wú)小鼠死亡,解剖觀察試驗(yàn)小鼠主要臟器無(wú)異常改變。24 h內(nèi)給予小鼠酒燜大黃煎劑2次,總量達(dá)96 g/kg,已超過(guò)蒙醫(yī)臨床常用劑量(0.06 g/kg)的 100 倍以上,說(shuō)明酒燜大黃的毒性非常小。
2.3.2 瀉下藥效試驗(yàn)
取小鼠60只(無(wú)自然腹瀉者),雌雄各半,隨即分成4組,分別為空白組(10%墨汁蒸餾水)、模型組(含10%墨汁番瀉葉粉混懸液)、大黃組(含10%墨汁大黃水煎液)、酒燜大黃組(含10%墨汁酒燜大黃水煎液),禁食12 h后,灌胃給藥,當(dāng)即將小鼠單個(gè)置鋪有濾紙的鐘罩內(nèi),觀察排便情況,記錄始排黑便時(shí)間、稀便級(jí)和稀便率等持續(xù)6 h。結(jié)果見表6??梢?,酒燜大黃的瀉下作用明顯緩和,始見黑便時(shí)間酒燜大黃組>生大黃組>模型組;酒燜大黃組排便次數(shù)最少,有顯著差異(P<0.01),其稀便級(jí)及稀便率明顯下降,除生大黃組外,其他組小鼠均未出現(xiàn)腹痛反應(yīng)。說(shuō)明炮制后改變了生大黃較強(qiáng)的瀉下作用,消除了不良反應(yīng)。
表6 酒燜大黃對(duì)小鼠瀉下作用的影響
大黃為蒙醫(yī)常用藥材,用于“希日”熱、便秘、食積不消、瘡瘍癤腫[6]。蒙藥阿木日-6散中大黃為君藥,主治腹脹便秘、消化性潰瘍、腸梗阻、月經(jīng)不調(diào)等[13]。而在治療不需導(dǎo)瀉性的疾病時(shí)常采用炮制,改變其功能及功效趨勢(shì)。大黃有效成分中起到瀉下作用的主要是結(jié)合型蒽醌,其作用部位主要在大腸,作用機(jī)制為刺激大腸黏膜及腸壁肌層的神經(jīng)叢,顯著促進(jìn)橫結(jié)腸和降結(jié)腸蠕動(dòng)而致瀉[14]。游離型蒽醌在提取過(guò)程中損失率高達(dá)64%,口服后上消化道吸收較完全,所以無(wú)瀉下作用[15]。
本試驗(yàn)提示,經(jīng)酒燜炮制使較多量的結(jié)合型蒽醌轉(zhuǎn)化為游離型蒽醌(自 0.384%減至0.056%),游離型蒽醌反之增加(由0.608%增加至0.716%),保證了蒽醌總量損失甚少。藥效試驗(yàn)顯示,瀉下作用明顯緩和(P<0.01);始排黑便時(shí)間,酒燜大黃組長(zhǎng)于模型組和生大黃組;排便次數(shù)亦少,酒燜大黃組稀便級(jí)和稀便率明顯下降。毒理試驗(yàn)結(jié)果表明,酒燜大黃毒性很小,從而有效性發(fā)揮顯著,避免了疼痛等不良反應(yīng),證明了蒙醫(yī)炮制的有效性和科學(xué)性。本試驗(yàn)中只對(duì)藥用大黃進(jìn)行了系列研究,而對(duì)掌葉大黃和唐古特大黃的炮制,還尚未做相關(guān)性研究,應(yīng)當(dāng)對(duì)不同大黃品種炮制前后的藥效變化及相互差異作比較,還需在今后的研究中加以補(bǔ)充,探索藥物內(nèi)在化學(xué)成分在炮制過(guò)程中的變化規(guī)律。
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Processing Mechanism and Effectiveness of Rheum Palmatum with Wine-Steaming According to Mongolian Medicine
Subuda,Arun,Nashengsang
(Institute of Mongolian Medicine Research,Inner Mongolia Medical University,Hohhot,Inner Mongolia,China 010110)
Objective To investigate the processing mechanism of Rheum palmatum with wine-steaming according to Mongolian medicine,and to optimize the wine-steaming processing technology and make an initial about safety and efficiency of processed Rheum palmatum.Methods HPLC method was used to analyze the content of total anthraquinone and free anthraquinone in Rheum palmatum and wine-steaming processed Rheum palmatum,the Rheum palmatum was processed by wine-steaming,with the ratio of herbs and wine,stewing time and heating time as 3 factors,each factor was selected at 3 levels for orthogonal test,and the optimum technological conditions were optimized.The safety and efficacy ofRheum palmatum Decoction were evaluated through the laxative effect and acute toxicity test of wine-steaming processed Rheum palmatum on mice.Results The content of anthraquinone of wine-steaming processed Rheum palmatum was significantly lower than the crude one.Meanwhile,the laxative effect was moderate obviously.Initial defecation time of processed group was longer than those of the crude group and model one,grade and rate of loose stools of the processed group was less than the crude group and model group.Maximum tolerance dose was far more than 100 times compared with clinical dose(0.06 g /kg)in acute toxicity test and no death or poisoning occurred in the mice.Pathological changes were not found in main organs.The best wine- steaming processing technology was as follows:the ratio of crude Rheum palmatum and wine was 1 ∶7.5(kg/L),the stewing time was 1 h,the stewing and heating time was 4 h.Conclusion Reasonable processing ofRheum palmatum based on Mongolian medicine theory can significantly ease laxative effect,eliminate pain and other adverse reactions,reduce toxicity,thereby increase the curative effect of Rheum palmatum,and expand the scope of medicine.
Mongolian medicine;Rheum palmatum;wine-steaming processed Rheum palmatum;processing technology;pharmacology;toxicology
R283.3;R282.71
A
1006-4931(2017)19-0019-05
10.3969 /j.issn.1006 - 4931.2017.19.005
內(nèi)蒙古自治區(qū)自然科學(xué)基金項(xiàng)目[kj15sf22]。
蘇布達(dá)(1995-),女,蒙古族,在讀碩士研究生,研究方向?yàn)槊伤帉W(xué),(電子信箱)923028362@qq.com。
那生桑(1956-),男,蒙古族,博士研究生導(dǎo)師,教授,主要研究方向?yàn)槊伤幣谥埔?guī)范化及蒙藥現(xiàn)代化,(電話)0471-6653163(電子信箱)nasang56@ sina.com。
2017-02-08;
2017-07-06)