實(shí)時(shí)定量檢測(cè)NF-κB p65亞基核易位方法的建立

賈俐莉，王小利，楊怡姝，沈思嗣，曾毅

北京工業(yè)大學(xué) 生命科學(xué)與生物工程學(xué)院，北京 100124

實(shí)時(shí)定量檢測(cè)NF-κB p65亞基核易位方法的建立

賈俐莉，王小利，楊怡姝，沈思嗣，曾毅

北京工業(yè)大學(xué) 生命科學(xué)與生物工程學(xué)院，北京 100124

目的：建立可直觀檢測(cè)NF-κB p65亞基核易位的方法。方法：構(gòu)建NF-κB p65的真核表達(dá)重組質(zhì)粒pEG?FP-p65，轉(zhuǎn)染HeLa細(xì)胞，加入腫瘤壞死因子α（TNF-α）后采用活細(xì)胞成像技術(shù)觀察綠色熒光蛋白在HeLa細(xì)胞內(nèi)的變化。結(jié)果：TNF-α處理后0～2 h，EGFP-p65融合蛋白主要聚集在胞漿處；TNF-α處理后4～12 h，隨處理時(shí)間的延長(zhǎng)，細(xì)胞核處的綠色熒光蛋白逐漸增強(qiáng)，但細(xì)胞內(nèi)總熒光值基本保持穩(wěn)定。結(jié)論：TNF-α可以促進(jìn)EGFP-p65入核。活細(xì)胞成像技術(shù)具有操作簡(jiǎn)單、實(shí)時(shí)動(dòng)態(tài)、直觀、定量等優(yōu)點(diǎn)，可用于探討人類免疫缺陷病毒（HIV）潛伏感染再激活劑的作用機(jī)制。

NF-κB；腫瘤壞死因子α；活細(xì)胞成像；核易位

人類免疫缺陷病毒（human immunodeficiency virus，HIV）在體內(nèi)的潛伏感染是無(wú)法治愈艾滋病的重要原因[1-2]。HIV-1原病毒的整合位置、表觀調(diào)控、RNA聚合酶起始復(fù)合體的形成、反式激活因子的作用等環(huán)節(jié)參與了HIV-1潛伏感染的建立與再激活過(guò)程。采用蛋白激酶C（protein ki?nase C，PKC）激活劑活化 NF-κB通路再激活HIV-1潛伏感染，是當(dāng)前“激活再殺傷（shock and kill）”治療策略的一個(gè)研究方向[2-4]。

NF-κB是細(xì)胞核內(nèi)重要的轉(zhuǎn)錄因子，HIV-1長(zhǎng)末端重復(fù)序列（long terminal repeat，LTR）中存在2個(gè)NF-κB結(jié)合位點(diǎn)。各種刺激因子誘導(dǎo)NF-κB易位至細(xì)胞核，可有效激活HIV-1[5]。TNF-α可以活化NF-κB[6]，本課題組前期研究顯示，2.5 ng/mL TNF-α對(duì)HIV潛伏感染模型J-Lat 11.1有明顯的再激活作用，再激活率達(dá)51.78%。在此，我們擬采用活細(xì)胞成像技術(shù)觀察TNF-α對(duì)NF-κB p65的核易位作用，并探討該方法在HIV-1潛伏感染再激活劑作用機(jī)制研究中的應(yīng)用價(jià)值。

1 材料與方法

1.1 材料

J-Lat 11.1細(xì)胞由美國(guó)加州大學(xué)醫(yī)學(xué)系Eric Verdin教授饋贈(zèng)；人宮頸癌細(xì)胞株（HeLa）、質(zhì)粒pEGFP-C3為本實(shí)驗(yàn)室保存；胎牛血清（FBS）、DMEM培養(yǎng)基、RPMI1640培養(yǎng)基購(gòu)自Gibco公司；大腸桿菌DH5α感受態(tài)細(xì)胞、限制性內(nèi)切酶、ExTaq酶、T4DNA連接酶、DNA marker、DNA瓊脂糖凝膠回收試劑盒和RNA反轉(zhuǎn)錄試劑盒購(gòu)自寶生物工程（大連）有限公司；質(zhì)粒小提試劑盒購(gòu)自天根生化科技（北京）有限公司；玻璃底細(xì)胞培養(yǎng)皿（直徑20 mm）購(gòu)自NEST公司；FuGENE6轉(zhuǎn)染試劑購(gòu)自Promega公司；引物合成及測(cè)序由上海生工生物工程有限公司完成。

1.2 真核表達(dá)質(zhì)粒pEGFP-p65的構(gòu)建

TRIzol法提取J-Lat 11.1細(xì)胞總RNA，逆轉(zhuǎn)錄成cDNA作為模板。根據(jù)人NF-κB p65基因序列（GenBank登錄號(hào)：223468675）的CDS區(qū)設(shè)計(jì)上游引物（5'-CTCGAGATGGACGAACTGTTCCC-3'，下劃線序列為XhoⅠ酶切位點(diǎn)）和下游引物（5'-GG ATCCTTAGGAGCTGATCTGAC-3'，下劃線序列為BamHⅠ酶切位點(diǎn)），擴(kuò)增片段長(zhǎng)約1660 bp。擴(kuò)增產(chǎn)物及質(zhì)粒pEGFP-C3分別經(jīng)XhoⅠ和BamHⅠ雙酶切，回收相應(yīng)目的片段，用T4DNA連接酶連接，連接產(chǎn)物轉(zhuǎn)化大腸桿菌DH5α感受態(tài)細(xì)胞，篩選陽(yáng)性克隆，提取質(zhì)粒進(jìn)行雙酶切及測(cè)序鑒定。

1.3 細(xì)胞培養(yǎng)

HeLa細(xì)胞用含10%FBS的DMEM培養(yǎng)基于37℃、5%CO2培養(yǎng)箱內(nèi)培養(yǎng)，細(xì)胞成層后用0.25%胰蛋白酶消化傳代。J-Lat 11.1細(xì)胞為懸浮細(xì)胞，用含10%FBS的RPMI1640培養(yǎng)。

1.4 質(zhì)粒轉(zhuǎn)染及重組融合蛋白觀察

將HeLa細(xì)胞以3×105/孔接種至六孔板，培養(yǎng)24 h后，參照轉(zhuǎn)染試劑說(shuō)明書(shū)將重組質(zhì)粒和Fu?GENE6按1∶10（m/v）的比例進(jìn)行轉(zhuǎn)染，轉(zhuǎn)染24 h后棄上清，加入2 mL 4%甲醛固定，輕搖混勻后室溫放置15 min，PBS洗滌3次，加入1 mL DAPI染液，室溫染色5 min，吸棄DAPI染液，PBS洗滌3次，加入2 mL PBS，在蔡司倒置熒光顯微鏡下觀察綠色熒光蛋白的表達(dá)情況。

1.5 活細(xì)胞成像觀察EGFP-p65融合蛋白的移位

將HeLa細(xì)胞以上述方法接種并轉(zhuǎn)染至玻璃底細(xì)胞培養(yǎng)皿中，培養(yǎng)24 h后更換新鮮培養(yǎng)基2 mL，加入 TNF-α，使其終濃度為 0或 10 ng/mL。將培養(yǎng)皿放置到活細(xì)胞成像的細(xì)胞培養(yǎng)室，打開(kāi)Axio Vision Rel4.8軟件，選取適宜視野，點(diǎn)擊“Multidimensional Acquisition”菜單后出現(xiàn)實(shí)驗(yàn)參數(shù)設(shè)置對(duì)話框：在熒光檢測(cè)通道“C”菜單中，選擇“GFP”通道采集綠色熒光信號(hào)，并設(shè)置曝光時(shí)間為400 ms；在縱向檢測(cè)距離“Z”菜單中，設(shè)置檢測(cè)層數(shù)為15層，并設(shè)置Z軸上的起止焦平面位置；在檢測(cè)持續(xù)時(shí)間“T”菜單中，設(shè)置信號(hào)采集間隔時(shí)間為5 min，連續(xù)檢測(cè)24 h；之后點(diǎn)擊“Start”按鈕，開(kāi)始動(dòng)態(tài)檢測(cè)綠色熒光信號(hào)。觀察結(jié)束后，點(diǎn)擊“Resample”按鈕選擇第0、1、……、24 h時(shí)間點(diǎn)的圖像，輸出該系列圖像；點(diǎn)擊“CutView”菜單，使各層熒光信號(hào)疊加，點(diǎn)擊“Create TL image”輸出每小時(shí)的正交顯示圖像；通過(guò)“Outline”工具選中細(xì)胞核區(qū)域或整個(gè)細(xì)胞的區(qū)域，單擊鼠標(biāo)右鍵選擇“Properties”，在“Measurement”菜單中選中“AllT”，輸出選中區(qū)域灰度值表，導(dǎo)出數(shù)據(jù)用Prism軟件分析。

2 結(jié)果

2.1 pEGFP-p65重組質(zhì)粒的鑒定

圖1顯示RT-PCR產(chǎn)物經(jīng)1%瓊脂糖凝膠電泳后，擴(kuò)增條帶位于1500～2000 bp；pEGFP-p65重組質(zhì)粒經(jīng)XhoⅠ和BamHⅠ雙酶切得到2個(gè)片段，大片段位于 3000～5000 bp，小片段位于 1500～2000 bp，與預(yù)期結(jié)果相符。將重組質(zhì)粒送上海生工生物工程有限公司測(cè)序后與GenBank數(shù)據(jù)庫(kù)中的NF-κB p65序列比對(duì)，結(jié)果一致（序列略）。

圖1 pEGFP-p65重組質(zhì)粒的鑒定

2.2 EGFP-p65融合蛋白的表達(dá)

將pEGFP-C3空載體、pEGFP-p65重組質(zhì)粒分別轉(zhuǎn)染HeLa細(xì)胞24 h后，采用DAPI對(duì)細(xì)胞核進(jìn)行染色。由圖2可見(jiàn)EGFP彌散分布在HeLa細(xì)胞的胞漿和胞核中，而EGFP-p65融合蛋白則主要分布在胞漿內(nèi)。

圖2 EGFP和EGFP-p65融合蛋白在HeLa細(xì)胞中的表達(dá)（×20）

2.3 TNF-α對(duì)NF-κB p65亞基核易位的影響

pEGFP-p65重組質(zhì)粒轉(zhuǎn)染HeLa細(xì)胞24 h后，未經(jīng)TNF-α處理組連續(xù)觀察24 h，綠色熒光始終分布在胞漿中（圖3），且細(xì)胞內(nèi)的總熒光值和細(xì)胞核內(nèi)熒光值均基本保持穩(wěn)定（圖4），提示EGFP-p65融合蛋白亞細(xì)胞定位未發(fā)生明顯變化。

圖3 對(duì)照組EGFP-p65融合蛋白的動(dòng)態(tài)表達(dá)過(guò)程（×40）

圖4 對(duì)照組EGFP-p65融合蛋白熒光值動(dòng)態(tài)變化情況

經(jīng)TNF-α處理0～2 h，綠色熒光主要聚集在胞漿處；隨著處理時(shí)間的延長(zhǎng)，細(xì)胞核處的綠色熒光逐漸增強(qiáng)（圖5）。12～16 h時(shí)細(xì)胞#1的綠色熒光消失，16～20 h時(shí)細(xì)胞#3的綠色熒光消失，20～24 h時(shí)細(xì)胞#2的綠色熒光消失。圖6顯示TNF-α處理后0～12 h細(xì)胞內(nèi)的總熒光值無(wú)明顯變化，基本維持在一個(gè)較高且穩(wěn)定的水平；但細(xì)胞核內(nèi)的熒光值不斷升高，由0 h的13 035.96逐漸升高至12 h的54 298.44，升高了3.17倍，提示TNF-α促進(jìn)EGFP-p65由胞漿處易位至胞核。自13 h后細(xì)胞內(nèi)EGFP-p65融合蛋白總熒光值和細(xì)胞核內(nèi)的熒光值均逐漸下降，該數(shù)據(jù)與圖5中發(fā)出綠色熒光細(xì)胞的消失現(xiàn)象相呼應(yīng)。推測(cè)出現(xiàn)這種現(xiàn)象的原因是NF-κB p65過(guò)表達(dá)且大量易位至細(xì)胞核，激活了細(xì)胞中多種依賴NF-κB通路基因的表達(dá)，對(duì)細(xì)胞造成了破壞，導(dǎo)致細(xì)胞死亡。

圖5 TNF-α處理組EGFP-p65融合蛋白的動(dòng)態(tài)表達(dá)過(guò)程（×40）

圖6 TNF-α處理組EGFP-p65融合蛋白熒光值動(dòng)態(tài)變化情況

3 討論

由于HIV-1潛伏病毒庫(kù)的存在，使得現(xiàn)行有效的高效抗逆轉(zhuǎn)錄療法（highly active anti-retrovi?ral therapy，HAART）亦不能徹底清除 HIV-1感染，因此近年來(lái)艾滋病的治療目標(biāo)逐步轉(zhuǎn)為“功能性治愈”，即經(jīng)過(guò)治療后，不必采用聯(lián)合抗病毒治療仍可長(zhǎng)期抑制HIV-1的復(fù)制[1]。為實(shí)現(xiàn)這一目標(biāo)，如何減少潛伏感染的細(xì)胞儲(chǔ)存庫(kù)是亟須解決的一個(gè)問(wèn)題。目前HIV-1的潛伏感染再激活的研究主要集中在使用組蛋白乙?；敢种苿?、DNA甲基化抑制劑、PKC激活劑等來(lái)激活潛伏感染的HIV-1，聯(lián)合使用HAART抑制子代病毒的產(chǎn)生，或調(diào)動(dòng)機(jī)體免疫系統(tǒng)清除活化的感染細(xì)胞。本課題組前期篩選到一些可以顯著再激活JLat11.1的天然植物提取物，采用PKC抑制劑或NF-κB抑制劑可阻斷其再激活作用。為進(jìn)一步明確這些天然植物提取物是否可以引起NF-κB核易位，進(jìn)而活化病毒LTR，本研究以TNF-α為例，建立了NF-κB核易位的直觀檢測(cè)體系。

目前關(guān)于NF-κB核易位的研究方法主要是分別在不同時(shí)間點(diǎn)提取核蛋白或總蛋白，采用Western印跡技術(shù)檢測(cè)細(xì)胞核內(nèi)NF-κB p65水平的變化[7-9]。該方法操作復(fù)雜、步驟繁瑣，影響因素較多，不易質(zhì)控且不易定量，從而導(dǎo)致實(shí)驗(yàn)結(jié)果不理想。本研究建立的活細(xì)胞成像方法具有下列優(yōu)點(diǎn)：①活細(xì)胞成像技術(shù)操作簡(jiǎn)單，選定待觀察視野后，只須在軟件中設(shè)置檢測(cè)參數(shù)，無(wú)須對(duì)樣本進(jìn)行多種處理；②該方法可以實(shí)現(xiàn)實(shí)時(shí)動(dòng)態(tài)觀察，本研究設(shè)定每隔5 min采集信號(hào)，24 h內(nèi)共采集了289個(gè)信號(hào)，這是Western印跡無(wú)法比擬的；③熒光成像圖像可以直觀地顯示融合蛋白的所在位置，并且可以通過(guò)熒光信號(hào)值定量分析核內(nèi)與細(xì)胞內(nèi)的總熒光值的變化趨勢(shì)；④確定觀察視野后，既可分析視野里全部目標(biāo)細(xì)胞的熒光蛋白變化情況，又可分析單個(gè)細(xì)胞的熒光蛋白變化情況，可對(duì)目標(biāo)細(xì)胞進(jìn)行縱向的動(dòng)態(tài)追蹤；⑤活細(xì)胞成像技術(shù)不必經(jīng)過(guò)蛋白抽提、蛋白電泳、抗體孵育等環(huán)節(jié)，引入的操作誤差小，易于質(zhì)控。但是，該技術(shù)也存在儀器成本高、觀察視野有限、待觀察蛋白需要有熒光標(biāo)記等不足。

綜上，本研究采用活細(xì)胞成像技術(shù)直觀地觀察到TNF-α促進(jìn)EGFP-p65融合蛋白的核易位過(guò)程，該技術(shù)可用于評(píng)價(jià)HIV-1潛伏感染再激活劑是否通過(guò)NF-κB通路發(fā)揮作用，亦可應(yīng)用于其他蛋白亞細(xì)胞定位變化的研究中。

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Establishment of Real-Time Quantitative Method Detecting the Nuclear Translocation of NF-κB p65

JIA Li-Li,WANG Xiao-Li,YANG Yi-Shu*,SHEN Si-Si,ZENG Yi
College of Life Science and Bio-Engineering,Beijing University of Technology,Beijing 100124,China

Objective:To establish a feasible method that visualized EGFP-p65 fusion protein nuclear transloca?tion.Methods:Recombinant pEGFP-p65 was constructed,then transfected into HeLa cells.Live cell imaging was adopted to observe the subcellular localization of green fluorescent protein.Results:EGFP-p65 fusion protein main?ly exists in the cytoplasm from 0～2 h after TNF-α treatment.The signals of green fluorescence in the nucleus gradually increased from 4～12 h,while the total fluorescent intensity in cells remained unchanged.Conclusion:TNF-α can promote the nuclear translocation of EGFP-p65 fusion protein.The technique of live cell imaging has many advantages over other methods such as simple operation,real-time dynamic,intuitive and quantitative,which can be applied to probe the mechanism of HIV latency reactivators.

NF-κB;TNF-α;live cell imaging;nuclear translocation

Q78;Q24

A

1009-0002（2017）05-0676-05

10.3969/j.issn.1009-

*Corresponding author,E-mail:yishu-y@bjut.edu.cn

2017-03-30

國(guó)家科技重大專項(xiàng)（2014ZX10005-002）；抗病毒藥物北京市國(guó)際科技合作基地項(xiàng)目

賈俐莉（1992- ），女，碩士研究生，（E-mail）jialili2017@qq.com

楊怡姝，（E-mail）yishu-y@bjut.edu.cn