重組人透明質(zhì)酸酶促皮下注射擴(kuò)散研究

姜廷，楊偉，張金龍，呂鵬，侯利華，陳薇

軍事醫(yī)學(xué)科學(xué)院 生物工程研究所，北京 100071

重組人透明質(zhì)酸酶促皮下注射擴(kuò)散研究

姜廷，楊偉，張金龍，呂鵬，侯利華，陳薇

軍事醫(yī)學(xué)科學(xué)院 生物工程研究所，北京 100071

目的：探究重組人透明質(zhì)酸酶（rHuPH20）促皮下注射藥物的擴(kuò)散能力，解決皮下快速給藥和大體量給藥難題。方法：以臺(tái)盼藍(lán)模擬聯(lián)用藥物作為可視化示蹤劑，研究rHuPH20對(duì)皮下注射藥物擴(kuò)散速率的影響；用生理鹽水造新西蘭兔水腫模型，研究rHuPH20對(duì)皮下注射輸液量的影響。結(jié)果：rHuPH20可極大地增加皮下注射藥物的擴(kuò)散速率和輸液量。結(jié)論：rHuPH20作為擴(kuò)散劑使用，可彌補(bǔ)傳統(tǒng)皮下注射微小輸液量的缺陷，滿(mǎn)足皮下注射不同輸液量的需求，在替代藥物靜脈輸液方面具有潛在應(yīng)用價(jià)值。

透明質(zhì)酸；透明質(zhì)酸酶；皮下輸液；擴(kuò)散作用

皮下注射是經(jīng)典的微量體積注射方式，注射液必須經(jīng)由皮膚間質(zhì)進(jìn)入作用靶點(diǎn)，而這種由膠原蛋白、彈性蛋白、纖維連接蛋白和透明質(zhì)酸（hy?aluronic acid，HA）等結(jié)構(gòu)性大分子組成的皮膚間質(zhì)，具有復(fù)雜的三維立體結(jié)構(gòu)，限制了皮下注射的擴(kuò)散速率和輸液量[1]。其中HA是皮膚間質(zhì)復(fù)雜立體結(jié)構(gòu)的“基架”，同時(shí)HA的親水性促使水分子嵌入網(wǎng)狀結(jié)構(gòu)內(nèi)部，構(gòu)成網(wǎng)狀實(shí)體彈性結(jié)構(gòu)，阻礙了注射液的擴(kuò)散吸收[2]。我們利用重組人透明質(zhì)酸酶rHuPH20對(duì)皮下HA的酶解作用[3]，破壞皮膚間質(zhì)立體結(jié)構(gòu)，降低其結(jié)構(gòu)致密性和黏彈性，進(jìn)而增加了皮下注射藥物的擴(kuò)散速率和輸液量。rHuPH20作為擴(kuò)散劑輔助皮下注射是一種新的皮下給藥方式，相比于傳統(tǒng)皮下注射具有快速擴(kuò)散吸收、大體量輸液和高生物利用度等優(yōu)勢(shì)，滿(mǎn)足了大體量皮下注射和快速給藥的需求。

1 材料與方法

1.1 材料

新西蘭兔（雄性，3 kg）購(gòu)自中國(guó)食品藥品檢定研究院；BALB/c裸鼠（雄性，7周齡）購(gòu)自北京維通利華實(shí)驗(yàn)動(dòng)物技術(shù)有限公司；rHuPH20（1.1×105U/mg）由軍事醫(yī)學(xué)科學(xué)院生物工程研究所抗體與疫苗研究室制備和提供；移液器為Gilson公司產(chǎn)品；臺(tái)式離心機(jī)為Hitachi公司產(chǎn)品；鹽酸氯胺酮購(gòu)自福建古田藥業(yè)有限公司；臺(tái)盼藍(lán)購(gòu)自Sigma公司；注射用生理鹽水購(gòu)自國(guó)藥集團(tuán)化學(xué)試劑有限公司；其他試劑為國(guó)產(chǎn)分析純產(chǎn)品。

1.2 rHuPH20促皮下注射擴(kuò)散效果觀(guān)察

以BALB/c裸鼠為研究對(duì)象，以臺(tái)盼藍(lán)模擬聯(lián)用藥物作為可視化示蹤劑，通過(guò)監(jiān)測(cè)臺(tái)盼藍(lán)的擴(kuò)散速率，評(píng)價(jià)rHuPH20的促擴(kuò)散作用。將BALB/c裸鼠隨機(jī)分成5組，每組8只（表1），稱(chēng)重后，腹腔注射鹽酸氯胺酮（150 mg/kg）麻醉，標(biāo)記背部正中左側(cè)1 cm處為給藥位點(diǎn)，各組給藥位點(diǎn)處皮下注射示蹤染料2%臺(tái)盼藍(lán)20 μL，1 min后皮下注射rHuPH20，注射結(jié)束立刻用卡尺測(cè)量臺(tái)盼藍(lán)染色面積，并以此為初始時(shí)間節(jié)點(diǎn)，觀(guān)察并記錄2、5、10、20、30 min時(shí)染色擴(kuò)散橫向直徑D1和縱向直徑D2，根據(jù)面積計(jì)算公式（Area=D1×D2×π/4）計(jì)算各時(shí)間節(jié)點(diǎn)的臺(tái)盼藍(lán)擴(kuò)散面積。

表1 rHuPH20促皮下注射擴(kuò)散實(shí)驗(yàn)

1.3 rHuPH20增加皮下注射輸液量和治療皮下水腫藥效評(píng)價(jià)

以新西蘭兔為研究對(duì)象，皮下注射大體量生理鹽水制造水腫模型。造模前預(yù)注射rHuPH20，評(píng)價(jià)rHuPH20對(duì)皮下注射輸液量的影響；造模后注射rHuPH20，以水腫體積為指標(biāo)，評(píng)價(jià)rHuPH20治療水腫的藥效。耳緣靜脈注射鹽酸氯胺酮（150 mg/kg）麻醉新西蘭兔，徹底麻醉后用剃毛器剃除背部及左側(cè)絨毛，裸露表皮，背部正中左側(cè)2 cm處標(biāo)記注射位點(diǎn)，進(jìn)行皮下注射，記錄水腫體積。實(shí)驗(yàn)分為3組：第1組皮下注射生理鹽水125 mL（對(duì)照）；第2組皮下注射生理鹽水125 mL，水腫模型完成后，注射 100 μL rHuPH20（1000 IU/mL）（考察rHuPH20治療皮下水腫效果）；第3組預(yù)先注射100 μL rHuPH20（1000 IU/mL），2 min后皮下注射生理鹽水125 mL（考察rHuPH20對(duì)皮下注射輸液量的影響）。

2 結(jié)果

2.1 rHuPH20促皮下注射擴(kuò)散作用

如圖1，時(shí)間節(jié)點(diǎn)為10 min時(shí)，注射rHuPH20各組示蹤染料擴(kuò)散面積顯著大于對(duì)照組，且高劑量rHuPH20組示蹤染料擴(kuò)散面積高于低劑量組，證明rHuPH20促進(jìn)皮下注射藥物擴(kuò)散，且具有一定的劑量依賴(lài)性。

圖1 rHuPH20促皮下注射藥物擴(kuò)散實(shí)驗(yàn)

采用二維測(cè)量法測(cè)定不同時(shí)間皮下注射示蹤染料的擴(kuò)散面積（表2）。0 min時(shí)，各組之間的臺(tái)盼藍(lán)擴(kuò)散面積差異無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＞0.05），即初始擴(kuò)散面積無(wú)顯著性差異；測(cè)量擴(kuò)散終點(diǎn)（30 min）時(shí)，各rHuPH20注射組與對(duì)照組示蹤染料擴(kuò)散面積差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＜0.05），其中10 U、50 U和100 U rHuPH20組分別為對(duì)照組擴(kuò)散面積的157%、173%和173%。表明rHuPH20具有良好的促擴(kuò)散作用。

表2 不同劑量rHuPH20對(duì)臺(tái)盼藍(lán)擴(kuò)散的影響

為進(jìn)一步研究rHuPH20酶活濃度與擴(kuò)散速率的關(guān)系，對(duì)各組數(shù)據(jù)進(jìn)行了深度分析。統(tǒng)計(jì)不同酶解時(shí)間臺(tái)盼藍(lán)擴(kuò)散面積增加量與初始面積的百分比，獲得各組在不同時(shí)間節(jié)點(diǎn)內(nèi)臺(tái)盼藍(lán)的擴(kuò)散速率，并繪制擴(kuò)散速率曲線(xiàn)圖（圖2）。不同酶解時(shí)間示蹤染料擴(kuò)散速率數(shù)據(jù)類(lèi)型為一個(gè)重復(fù)測(cè)量因素的兩因素設(shè)計(jì)一元定量資料，統(tǒng)計(jì)方法為混合效應(yīng)模型法（mixed effects model），以P＜0.05為差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義，統(tǒng)計(jì)軟件為SAS 9.2（表3）。各酶解時(shí)間節(jié)點(diǎn)組間兩兩比較結(jié)果表明，2 min時(shí)，各組之間的臺(tái)盼藍(lán)擴(kuò)散速率有顯著性差異（P＜0.05），表明擴(kuò)散速率與rHuPH20酶活濃度具有劑量關(guān)系，經(jīng)100 U rHuPH20處理后臺(tái)盼藍(lán)擴(kuò)散速率為對(duì)照組的748%；10、20和30 min時(shí)，50 U和100 U rHuPH20組促臺(tái)盼藍(lán)擴(kuò)散速率無(wú)顯著差異（P＞0.05）；30 min時(shí)，10 U 和 50 U rHuPH20組、50 U和100 U rHuPH20組擴(kuò)散作用無(wú)顯著性差異（P＞0.05），表明rHuPH20促擴(kuò)散作用隨時(shí)間推移逐漸降低。

圖2 不同時(shí)間節(jié)點(diǎn)擴(kuò)散面積增加量與初始面積的百分比

表3 組間兩兩比較統(tǒng)計(jì)結(jié)果

2.2 rHuPH20治療皮下水腫和增加皮下注射輸液量

圖3 新西蘭兔脊背左側(cè)大體量注射生理鹽水制造水腫模型，造模前注射和造模后注射rHuPH20對(duì)水腫體積的影響

如圖3A所示，皮下注射生理鹽水125 mL造成局部皮下水腫，水腫體積為60.2 cm3（約10 h后水腫消失，解剖發(fā)現(xiàn)皮下有塊狀白色凝膠）；而造模前預(yù)注射 100 μL rHuPH20（1000 IU/mL）2 min后，皮下注射生理鹽水125 mL未發(fā)生組織形變和腫脹（圖3B），表明在不引起組織損傷的條件下，rHuPH20可顯著提高皮下注射輸液量。皮下注射生理鹽水125 mL后，造成局部皮下水腫，水腫體積為70.2 cm3（圖3C）；而造模后注射100 μL rHuPH20（1000 IU/mL），局部皮下水腫逐漸減小，20 min后水腫消失（圖3D），證明rHuPH20可以有效治療局部皮下水腫。

3 討論

自1940年始，從動(dòng)物組織提取的透明質(zhì)酸酶已應(yīng)用于臨床實(shí)驗(yàn)性治療，但低純度引起的高免疫原性和毒性作用限制了其在臨床上的推廣。21世紀(jì)初，美國(guó)Halozym公司利用基因重組技術(shù)在CHO細(xì)胞中表達(dá)了rHuPH20，并于2005年經(jīng)美國(guó)FDA批準(zhǔn)成為第一個(gè)上市的rHuPH20藥物，隨后rHuPH20注射劑和PEG-rHuPH20相繼于2010和2016年上市，但國(guó)內(nèi)在rHuPH20制劑上還存在空白。本實(shí)驗(yàn)室建立了高純度rHuPH20制備方法，擬利用rHuPH20解決皮下注射快速給藥和大體量輸液難題。我們用rHuPH20酶解皮膚間質(zhì)中的HA，破壞了皮膚間質(zhì)結(jié)構(gòu)致密性和黏彈性，顯著提高了皮下注射藥物的擴(kuò)散速率和輸液量。在本實(shí)驗(yàn)條件下，100 U rHuPH20預(yù)處理后皮下注射示蹤染料初始擴(kuò)散速率可提高6.48倍，經(jīng)條件優(yōu)化后可得到10倍甚至幾十倍初始擴(kuò)散速率，在急性病癥治療和三防（防生、防化、防核）解毒中具有潛在應(yīng)用價(jià)值。同時(shí)，rHuPH20在體內(nèi)半衰期較短[4]，意味著rHuPH20可能帶來(lái)的皮膚組織損傷和炎癥反應(yīng)極小。

rHuPH20作為輔助擴(kuò)散劑用于皮下注射是一種新型的“大體量皮下給藥方式”，相比于靜脈注射，具有技術(shù)要求低、操作簡(jiǎn)單、成本低廉和輸液效率高等優(yōu)勢(shì)，可替代靜脈注射而成為慢性疾病患者自助型注射類(lèi)藥物給藥方式，如糖尿病患者注射胰島素[5]；替代不便于靜脈注射環(huán)境和條件的大體量注射方式，如皮膚燒傷患者的輸液[6]；為因溶解度、生物利用度和穩(wěn)定性等因素限制而不能進(jìn)行靜脈注射的藥物提供新的給藥途徑。這種大體量注射方式可彌補(bǔ)傳統(tǒng)皮下注射微小輸液量的缺陷，滿(mǎn)足皮下注射不同輸液量的需求。

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Study of rHuPH20 Pharmacological Property on Facilitat?ing Diffusion of Subcutaneous Injection

JIANG Ting,YANG Wei,ZHANG Jin-Long,LYU Peng,HOU Li-Hua*,CHEN Wei*
Beijing Institute of Biotechnology,Beijing 100071,China

Objective:To study the recombinant human hyaluronidase rHuPH20 property of improving the diffu?sion of subcutaneous injection so as to realize quick subcutaneous injection and high-dose subcutaneous injection.Methods:Trypan blue was used as a visualized tracer to simulate combined medicine to study influence of rH?uPH20 on diffusion rate of subcutaneous injection.The New Zealand rabbit model of subcutaneous oedema was made by subcutaneous injection of saline to study influence of rHuPH20 on doses of subcutaneous injection.Re?sults:Subcutaneous co-administration of rHuPH20 greatly improves diffusion rate and doses of subcutaneous infu?sion.Conclusion:rHuPH20 can be co-administraed as diffusion agent to makes up the defects of traditional sub?cutaneous injection and meet the needs of various doses of subcutaneous injection,which has potential to replace the intravenous infusion.

hyaluronic acid;hyaluronidase;subcutaneous delivery;diffusion

R91;Q75

A

1009-0002（2017）05-0647-04

10.3969/j.issn.1009-

*Co-corresponding authors,HOU Li-Hua,E-mail:houlihua@sina.com;CHEN Wei,E-mail:cw0226@foxmail.com

2017-04-17

姜廷（1986- ），女，碩士研究生，（E-mail）18518920805@163.com

侯利華，（E-mail）houlihua@sina.com；陳薇，（E-mail）cw0226@foxmail.com