CD19蛋白截短體慢病毒表達(dá)載體的構(gòu)建及其在K562細(xì)胞中的表達(dá)

張崢嶸，王嫚娜，梁劍青，李世崇，黃紅艷，閆敏，陳昭烈，劉真真，孫強(qiáng)

1.鄭州大學(xué) 附屬腫瘤醫(yī)院乳腺科，河南 鄭州 450008；2.軍事醫(yī)學(xué)科學(xué)院 生物工程研究所，北京 100071；3.首都醫(yī)科大學(xué) 附屬北京世紀(jì)壇醫(yī)院腫瘤內(nèi)科，腫瘤治療性疫苗北京市重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室，北京 100038

CD19蛋白截短體慢病毒表達(dá)載體的構(gòu)建及其在K562細(xì)胞中的表達(dá)

張崢嶸1，2，王嫚娜2，梁劍青2，李世崇2，黃紅艷3，閆敏1，陳昭烈2，劉真真1，孫強(qiáng)2

1.鄭州大學(xué) 附屬腫瘤醫(yī)院乳腺科，河南 鄭州 450008；2.軍事醫(yī)學(xué)科學(xué)院 生物工程研究所，北京 100071；3.首都醫(yī)科大學(xué) 附屬北京世紀(jì)壇醫(yī)院腫瘤內(nèi)科，腫瘤治療性疫苗北京市重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室，北京 100038

目的：構(gòu)建胞內(nèi)段缺失的CD19蛋白截短體（CD19t）慢病毒表達(dá)載體pLVX-EF1α-CD19t-IRES-Puro，并建立穩(wěn)定表達(dá)CD19t的人紅白血病細(xì)胞系K562/CD19t。方法：合成CD19t基因全長，酶切產(chǎn)物插入慢病毒載體pLVXEF1α-IRES-Puro，將重組質(zhì)粒轉(zhuǎn)染293FT細(xì)胞包裝病毒后感染人紅白血病細(xì)胞系K562，采用Western印跡和免疫熒光技術(shù)檢測CD19t在K562細(xì)胞中的表達(dá)，并通過ELISA檢測K562/CD19t與CD19 CAR-Jurkat共培養(yǎng)上清中的IL-2濃度。結(jié)果：酶切鑒定與測序結(jié)果表明成功構(gòu)建慢病毒表達(dá)載體pLVX-EF1α-CD19t-IRES-Puro；Western印跡和免疫熒光檢測到K562/CD19t細(xì)胞中CD19t的表達(dá)；ELISA結(jié)果顯示表達(dá)的CD19t能夠刺激識(shí)別CD19的CAR-Jurkat細(xì)胞分泌IL-2。結(jié)論：構(gòu)建了CD19蛋白截短體慢病毒表達(dá)載體，并在K562細(xì)胞中表達(dá),有助于進(jìn)一步構(gòu)建B細(xì)胞白血病動(dòng)物模型和驗(yàn)證CAR-T效能。

CD19；基因克??；B細(xì)胞；CAR-T免疫療法

CD19分子，又名Leu-12或B4，最早于1983年被Naderl等發(fā)現(xiàn)[1]。CD19基因位于第16條染色體短臂16p11.2，由15個(gè)外顯子組成，編碼556個(gè)氨基酸殘基[2]。CD19表達(dá)于正常成熟B細(xì)胞、惡性B細(xì)胞和B前體細(xì)胞，在成熟B細(xì)胞中的表達(dá)量約是未成熟B細(xì)胞中的3倍[3-4]。CD19分子屬于Ⅰ型跨膜糖蛋白，只有一個(gè)跨膜區(qū)，胞內(nèi)段是C端，胞外段是N端[5]。胞外區(qū)包括2個(gè)C2型免疫球蛋白樣的結(jié)構(gòu)域和1個(gè)N端糖基化位點(diǎn)，C2球蛋白結(jié)構(gòu)域間由硫鍵相連。多個(gè)實(shí)驗(yàn)證明，其胞內(nèi)區(qū)域是高度保守的，并且包含3個(gè)具有重要功能的酪氨酸殘基Y391、Y482和Y513[4,6]。

CD19參與了B細(xì)胞的活化、發(fā)育過程，其結(jié)構(gòu)基礎(chǔ)是CD21-CD19-CD81復(fù)合物，該復(fù)合物降低了B細(xì)胞固有或受體依賴的信號(hào)閾值，同時(shí)還能不依賴B細(xì)胞受體的存在，與C3d結(jié)合影響B(tài)細(xì)胞受體信號(hào)途徑[7-9]。近年來，CD19分子作為B細(xì)胞的標(biāo)記分子的作用越來越受到重視：一方面，CD19可以作為白血病免疫細(xì)胞分型依據(jù)[10]；另一方面，在B細(xì)胞惡性腫瘤治療領(lǐng)域，CD19能夠作為一個(gè)重要的治療靶點(diǎn)，尤其是靶向CD19分子的嵌合抗原受體（chimeric antigen receptor，CAR）T細(xì)胞療法在近年的臨床實(shí)驗(yàn)中獲得了很大的成功[11]。

考慮到CD19全長會(huì)降低慢病毒對(duì)淋巴細(xì)胞的感染效率，我們擬構(gòu)建截短的CD19蛋白（CD19t）慢病毒表達(dá)載體并感染K562細(xì)胞，通過ELISA確定其對(duì)識(shí)別CD19的CAR-Jurkat的刺激作用，為進(jìn)一步研究CD19分子在B細(xì)胞惡性腫瘤中的作用和驗(yàn)證CAR-T的效能奠定基礎(chǔ)。

1 材料和方法

1.1 材料

Jurkat細(xì)胞購自北京協(xié)和細(xì)胞資源中心（采用Hyclones公司的RPMI1640培養(yǎng)基培養(yǎng)）；293FT細(xì)胞、K562細(xì)胞為本實(shí)驗(yàn)室保存（293FT細(xì)胞采用Omacgene公司的DMEM培養(yǎng)基培養(yǎng)，K562細(xì)胞采用Hyclones公司的RPMI1640培養(yǎng)基培養(yǎng)）；大腸桿菌Trans10購自北京全式金生物技術(shù)有限公司；質(zhì)粒pLVX-EF1α-IRES-Puro購自優(yōu)寶生物公司；CD19截短體對(duì)應(yīng)的核苷酸序列由金斯瑞公司合成，以pUC57的質(zhì)粒形式提供；瓊脂糖凝膠回收試劑盒、質(zhì)粒提取試劑盒購自天根公司；限制性內(nèi)切酶EcoRⅠ、BamHⅠ、XhoⅠ購自NEB公司；LipofectAMINE LTX&Plus Reagent、嘌呤霉素、抗CD19-N端抗體、抗GAPDH抗體和二抗均購自Invitrogen 公司；Human IL-2 ELISA kitⅡ購自 BD公司。

1.2 CD19截短體慢病毒表達(dá)載體的構(gòu)建

設(shè)計(jì)的CD19t不包含胞內(nèi)段編碼基因，全長1029 bp。前后分別是EcoRⅠ、BamHⅠ酶切位點(diǎn)，中間由66 bp的信號(hào)肽序列、27 bp的HA標(biāo)簽、915 bp的胞外段與跨膜區(qū)對(duì)應(yīng)序列和終止密碼子組成（圖1）。由金斯瑞公司合成，以pUC57質(zhì)粒形式提供。用EcoRⅠ/BamHⅠ酶切得到目的片段，膠回收后連入pLVX-EF1α-IRES-Puro載體的EcoRⅠ/BamHⅠ位點(diǎn)，構(gòu)建得到pLVX-EF1α-CD19t-IRES-Puro表達(dá)載體（圖2）。

圖1 CD19蛋白截短體CD19t序列設(shè)計(jì)示意圖

1.3 病毒包裝、感染

293FT細(xì)胞按1×106/孔接種于 6孔板，37℃、5%CO2條件下培養(yǎng)，次日將目的慢病毒載體與包裝質(zhì)粒D8.9、VSVG-L用脂質(zhì)體LipofectAMINE LTX&Plus Reagent共轉(zhuǎn)染293FT細(xì)胞，6 h后換液，于24、48、72 h收取上清，用4.5 μm濾器過濾，將K562細(xì)胞按1×104/孔接種于24孔板，每孔加入1 mL RPMI1640培養(yǎng)基、1 mL病毒上清和1.5 μL聚凝胺，3 d后用嘌呤霉素（0.5 μg/mL）篩選4～5 d，獲得目的細(xì)胞株K562/CD19t。

圖2 pLVX-EF1α-CD19t-IRES-Puro表達(dá)載體構(gòu)建示意圖

1.4 Western印跡檢測細(xì)胞CD19t蛋白的表達(dá)

取1×105K562/CD19t細(xì)胞，1000 r/min離心3 min，PBS洗2次，棄去PBS，于冰上加RIPA，冰上孵育振蕩，30 min后12 000 r/min離心20 min，棄沉淀，上清分裝備用。取上清2.5 μL，蛋白定量得其濃度。配膠，加樣，電泳（電泳分離膠濃度為15%，濃縮膠和分離膠分別用100 V/20 min、160 V/1 h）；轉(zhuǎn)膜時(shí)設(shè)定100 V，1 h，并用5%的牛血清白蛋白（BSA）封閉；孵育蛋白一抗，4℃翻轉(zhuǎn)過夜，TBST洗3次；孵育蛋白二抗，1 h，TBST洗3次；與發(fā)光液和穩(wěn)定劑避光孵育2 min，于暗室中顯影、定影。

1.5 免疫熒光檢測細(xì)胞CD19t蛋白的表達(dá)

取5×104目的細(xì)胞，400 r/min離心 5 min，甩片后用4%多聚甲醛固定10 min，PBS洗3次，10 min/次；5%BSA室溫封閉1 h，棄去封閉液，加入抗CD19-N端抗體（1∶50稀釋），4℃過夜；PBS洗3次，10 min/次，加入熒光標(biāo)記二抗（1∶200稀釋），室溫孵育 40 min，PBS洗 3次，10 min/次；用含DAPI的封片劑封片保存，熒光顯微鏡觀察。

1.6 檢測K562/CD19t與嵌合抗原受體Jurkat細(xì)胞共培養(yǎng)上清中IL-2的表達(dá)

取2×104K562/CD19t細(xì)胞和 1×104識(shí)別 CD19的CAR-Jurkat細(xì)胞，于48孔板中共培養(yǎng)過夜，12 h后取上清，1500 r/min離心3 min，棄沉淀，上清分裝備用。用BD公司的Human IL-2 ELISA KitⅡ試劑盒檢測上清中IL-2的濃度。

2 結(jié)果

2.1 pLVX-EF1α-CD19t-IRES-Puro表達(dá)載體的構(gòu)建

將含有CD19t基因的質(zhì)粒pUC57-CD19t用EcoRⅠ/BamHⅠ酶切，目的片段連入經(jīng)相同酶切的pLVX-EF1α-IRES-Puro載體，隨機(jī)選取2個(gè)克隆，分別用EcoRⅠ/BamHⅠ和XhoⅠ/BamHⅠ雙酶切鑒定，DNA電泳片段和模式與預(yù)期相符（圖3），序列測定顯示插入序列正確無誤（結(jié)果未示），證明pLVX-EF1α-CD19t-IRES-Puro表達(dá)載體構(gòu)建成功。

圖3 質(zhì)粒pLVX-EF1α-CD19t-IRES-Puro的雙酶切產(chǎn)物電泳圖譜

2.2 Western印跡檢測轉(zhuǎn)染后K562細(xì)胞中CD19t的表達(dá)

以轉(zhuǎn)染空載體的K562為對(duì)照組，轉(zhuǎn)染pLVXEF1α-CD19t-IRES-Puro載體的 K562/CD19t為實(shí)驗(yàn)組，并以GAPDH為內(nèi)參。結(jié)果顯示，實(shí)驗(yàn)組表達(dá)CD19t而對(duì)照組，差異明顯（圖4）。

2.3 免疫熒光檢測轉(zhuǎn)染后K562細(xì)胞中CD19t的表達(dá)

CD19t具有跨膜區(qū)，理論上會(huì)表達(dá)于細(xì)胞膜表面。因此，我們檢測了CD19t在目的細(xì)胞K562/CD19t中的表達(dá)定位。如圖5所示，CD19t（綠色）高度表達(dá)于K562/CD19t的細(xì)胞膜處，而轉(zhuǎn)染空載體的K562/NC則不表達(dá)。

圖4 Western印跡檢測CD19t蛋白在K562細(xì)胞中的表達(dá)

圖5 CD19t蛋白表達(dá)于K562細(xì)胞膜上（熒光顯微鏡，×400）

2.4 ELISA檢測K562/CD19t和CAR-Jurkat共培養(yǎng)上清中IL-2的表達(dá)量

根據(jù)設(shè)計(jì)，截短體CD19t的胞外區(qū)會(huì)發(fā)揮與CD19胞外區(qū)類似的功能。將轉(zhuǎn)染CD19t和轉(zhuǎn)染空載體的K562細(xì)胞分別與識(shí)別CD19的CAR-Jur?kat共培養(yǎng)，取上清檢測IL-2濃度。如圖6所示，實(shí)驗(yàn)組與對(duì)照組的細(xì)胞因子IL-2濃度差異顯著，提示K562/CD19t表達(dá)的CD19t能夠被識(shí)別CD19的CAR-Jurkat有效識(shí)別，并能刺激CAR-Jurkat細(xì)胞分泌IL-2。

圖6 ELISA檢測K562/CD19t和CAR-Jurkat細(xì)胞共培養(yǎng)上清中IL-2的濃度

3 討論

CD19分子主要表達(dá)于B細(xì)胞表面，調(diào)節(jié)B細(xì)胞相關(guān)信號(hào)的轉(zhuǎn)導(dǎo)，在臨床診斷和治療方面也具有重要意義。幾乎所有B細(xì)胞來源的惡性腫瘤細(xì)胞均表達(dá)CD19，因此以CD19為靶標(biāo)的免疫治療方法具有相當(dāng)程度的治療效果。

這些免疫治療方法主要有兩類：一類是抗CD19分子的單克隆抗體的應(yīng)用，一類是嵌合抗原受體CART-CD19細(xì)胞療法。前者主要有非結(jié)合抗體、藥物共軛抗體和雙特異性抗體。其中，一種針對(duì)急性淋巴白血病的雙特異性抗體藥物Blinatumomab在36例患者的研究中，除2人外均達(dá)到了緩解。后者，CART-CD19細(xì)胞療法是迄今細(xì)胞治療腫瘤領(lǐng)域效果最顯著的方法，與“免疫檢測點(diǎn)抗體阻斷療法”一起被Science雜志評(píng)為“2013年十大科學(xué)突破之首”[12]。

我們所構(gòu)建的CD19截短體僅表達(dá)CD19分子的胞外區(qū)和跨膜區(qū)，為研究某些功能區(qū)域提供了如下便利：①CD19t基因的長度約為CD19全長的一半，能夠提高表達(dá)目的基因的慢病毒載體對(duì)淋巴細(xì)胞的感染效率；②截短體不表達(dá)CD19分子的胞內(nèi)區(qū)，可以與表達(dá)CD19分子全長或CD19胞內(nèi)區(qū)截短體的細(xì)胞系相互比較驗(yàn)證，研究其胞外區(qū)對(duì)細(xì)胞功能的影響；③將來用截短體K562/CD19t細(xì)胞系所構(gòu)建的小鼠移植瘤模型，既具有CD19抗原性，又避免了CD19分子本身對(duì)K562細(xì)胞的影響，并且可以為驗(yàn)證新型結(jié)構(gòu)CART-CD19或靶向CD19的抗體藥物的效能做好準(zhǔn)備。

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Construction of Lentiviral Expression Vector for CD19 Truncated Protein and its Expression in K562 Cells

ZHANG Zheng-Rong1,2,WANG Man-Na2,LIANG Jian-Qing2,LI Shi-Chong2,HUANG Hong-Yan3,YAN Min1,CHEN Zhao-Lie2,LIU Zhen-Zhen1*,SUN Qiang2*
1.Department of Breast,Cancer Hospital,Zhengzhou University,Zhengzhou 450008;2.Beijing Institute of Bioengi?neering,Beijing 100071;3.Beijing Key Laboratory of Oncology and Oncology Vaccine,Beijing Shijitan Hospital,Capital University of Medical Sciences,Beijing 100038;China

Objective:To construct the lentiviral expression vector pLVX-EF1α-CD19t-IRES-Puro for truncated CD19（CD19t） in cytoplasmic region,and examine its expression in K562 cells.Methods:CD19tgene was synthe?sized and cloned into pLVX-EF1α-IRES-Puro vector followed by virus packaging in 293FT cells.Human erythro?leukemia K562 cells were infected with recombinant lentivirus containing CD19t to construct K562/CD19t cells.The expression of CD19t was examined by Western blot and immunofluorescence staining.ELISA was used to ana?lyze the secreted IL-2 in co-culture supernatant of K562/CD19t with CAR-Jurkat.Results:Lentiviral expressionvector pLVX-EF1α-CD19t-IRES-Puro was confirmed by double enzymatic digestion and sequencing.The expres?sion of CD19t in K562 cells was detected by Western blot and immunofluorescence staining.ELISA showed that CAR-Jurkat secreted IL-2,which was stimulated by CD19t expression.Conclusion:The lentiviral vector for CD19t expression has been constructed and CD19t expression can be detected in K562/CD19t cells,which would be helpful to make animal model for B cell leukemia and test CAR-T performance.

CD19;gene cloning;B cells;CAR-T immunotherapy

Q78

A

1009-0002（2017）05-0634-05

10.3969/j.issn.1009-

*Co-corresponding authors,LIU Zhen-Zhen,E-mail:Liuzhenzhen73@163.com;SUN Qiang,E-mail:sunq@bmi.ac.cn

2017-03-01

國家自然科學(xué)基金（81572799，31671432）；國家重點(diǎn)研發(fā)計(jì)劃（2016YFC1303303）；北京市自然科學(xué)基金（7162091）

張崢嶸（1991- ），男，碩士研究生，（E-mail）18703605958@163.com；王嫚娜（1991- ），女，博士研究生；同為第一作者

劉真真，（E-mail）Liuzhenzhen73@163.com；孫強(qiáng)，（E-mail）sunq@bmi.ac.cn