猴B病毒抗體ELISA檢測(cè)試劑盒的制備及準(zhǔn)確性評(píng)價(jià)

葉華虎，陳建宇，2，周小軍，王進(jìn)，代艷艷，法云智，袁菊芳

1.軍事醫(yī)學(xué)科學(xué)院 實(shí)驗(yàn)動(dòng)物中心，北京 100071；2.內(nèi)蒙古大學(xué) 生命科學(xué)學(xué)院，內(nèi)蒙古 呼和浩特 010021

猴B病毒抗體ELISA檢測(cè)試劑盒的制備及準(zhǔn)確性評(píng)價(jià)

葉華虎1，陳建宇1，2，周小軍1，王進(jìn)1，代艷艷1，法云智1，袁菊芳1

1.軍事醫(yī)學(xué)科學(xué)院 實(shí)驗(yàn)動(dòng)物中心，北京 100071；2.內(nèi)蒙古大學(xué) 生命科學(xué)學(xué)院，內(nèi)蒙古 呼和浩特 010021

目的：以金標(biāo)準(zhǔn)試劑盒為參照，對(duì)新研制的猴B病毒抗體ELISA檢測(cè)試劑盒進(jìn)行準(zhǔn)確性評(píng)價(jià)，以期為我國(guó)實(shí)驗(yàn)靈長(zhǎng)類動(dòng)物產(chǎn)業(yè)提供優(yōu)質(zhì)廉價(jià)的檢測(cè)試劑。方法：利用3個(gè)批次共表達(dá)猴B病毒gD和gB蛋白的細(xì)胞上清分別制備ELISA檢測(cè)試劑盒，與金標(biāo)準(zhǔn)試劑盒（VRL的ELISA試劑盒）同時(shí)對(duì)667只食蟹猴血清進(jìn)行檢測(cè)，考察新研制劑盒的準(zhǔn)確性；然后，挑選強(qiáng)陽(yáng)性、弱陽(yáng)性、陰性樣品，用另外2個(gè)批次ELISA試劑盒檢測(cè)，考察不同批次試劑盒檢測(cè)結(jié)果的穩(wěn)定性。結(jié)果：金標(biāo)準(zhǔn)試劑盒對(duì)667只食蟹猴血清抗體檢測(cè)結(jié)果為陽(yáng)性280份、陰性387份，而新研制的ELISA試劑盒結(jié)果為陽(yáng)性282份、陰性385份；與金標(biāo)準(zhǔn)相比，陽(yáng)性樣品的符合率為98.93%（277/280），陰性樣品的符合率為98.97%（383/387），總體符合率為98.95%（660/667）。對(duì)100份強(qiáng)陽(yáng)性樣品、70份弱陽(yáng)性樣品、108份陰性樣品及7份差異樣品的重復(fù)檢測(cè)表明，除1份弱陽(yáng)性（金標(biāo)準(zhǔn)為陰性）檢測(cè)為陰性外，其余樣品與前期一致。結(jié)論：與金標(biāo)準(zhǔn)相比，新研制的試劑盒具有較高的準(zhǔn)確性，可用于猴B病毒抗體的檢測(cè)。

猴B病毒；ELISA抗體檢測(cè)試劑盒；準(zhǔn)確性

B病毒是以靈長(zhǎng)類動(dòng)物特別是猴為自然宿主的人獸共患病病原，在大部分靈長(zhǎng)類動(dòng)物（如恒河猴、食蟹猴等獼猴屬）中，通常不表現(xiàn)臨床癥狀，但人感染后，死亡率超過75%。因此，B病毒是實(shí)驗(yàn)靈長(zhǎng)類動(dòng)物質(zhì)量控制的主要病原，也是影響實(shí)驗(yàn)靈長(zhǎng)類動(dòng)物產(chǎn)業(yè)的關(guān)鍵因素[1-4]。

B病毒屬于皰疹病毒科α皰疹病毒屬，與該屬其他病毒（如單純性皰疹病毒，herpes simplex virus，HSV）一樣具有嗜神經(jīng)性。即動(dòng)物感染后，病毒可逆神經(jīng)上行，在神經(jīng)節(jié)特別是三叉神經(jīng)節(jié)中潛伏，只有活躍期才在外周組織有病毒顆粒存在?？梢?，依靠外周組織進(jìn)行病原學(xué)診斷存在較高的漏檢率。但B病毒感染后，其抗體在動(dòng)物體內(nèi)可維持?jǐn)?shù)年，抗體檢測(cè)因此成為B病毒防控的最佳手段[5-8]。

當(dāng)前，B病毒抗體檢測(cè)試劑首推美國(guó)亞特蘭大大學(xué)病毒研究實(shí)驗(yàn)室（Virus Research Laborato?ry，VRL）研制的一系列制劑（包括 DIA、ELISA、Western印跡等），被認(rèn)為是實(shí)驗(yàn)靈長(zhǎng)類動(dòng)物檢測(cè)的國(guó)際金標(biāo)準(zhǔn)。國(guó)內(nèi)實(shí)驗(yàn)動(dòng)物界雖然也有B病毒抗體檢測(cè)試劑研究，但抗原多為與B病毒高度同源的HSV，加之抗體檢測(cè)易受多種因素（如抗原敏感性不足、蛋白質(zhì)的非特異性結(jié)合等）影響，檢測(cè)結(jié)果與金標(biāo)準(zhǔn)有較大差異[9-10]。

我們前期研究發(fā)現(xiàn)，將B病毒gD和gB蛋白在CHO細(xì)胞中共表達(dá)，細(xì)胞上清不需要純化即可獲得良好的檢測(cè)結(jié)果[11]。為此，我們研制了以重組蛋白gD和gB為聯(lián)合抗原的ELISA檢測(cè)試劑盒。本實(shí)驗(yàn)對(duì)新研制的試劑盒進(jìn)行了準(zhǔn)確性評(píng)價(jià)，旨在為我國(guó)實(shí)驗(yàn)靈長(zhǎng)類動(dòng)物質(zhì)量控制提供優(yōu)質(zhì)廉價(jià)的B病毒抗體檢測(cè)制劑。

1 材料與方法

1.1 材料

猴血清667份，采自軍事醫(yī)學(xué)科學(xué)院實(shí)驗(yàn)動(dòng)物中心飼養(yǎng)的食蟹猴種群；CD FortiCHO和CHO CD EfficientFeed B無(wú)血清培養(yǎng)基、抗結(jié)團(tuán)劑購(gòu)于Gibco公司；200 mmol/L谷氨酰胺、青霉素、鏈霉素購(gòu)于Hyclone公司；HRP標(biāo)記的兔抗猴IgG二抗購(gòu)于Sigma公司；新生小牛血清購(gòu)于杭州四季青公司；TMB單組分顯色液購(gòu)于湖州英創(chuàng)生物科技公司；ELISA酶標(biāo)板購(gòu)于Conning公司；猴B病毒ELISA抗體檢測(cè)試劑盒購(gòu)于VRL中國(guó)蘇州西山生物技術(shù)公司。

1.2 重組B病毒gD和gB蛋白的制備

將前期構(gòu)建的共表達(dá)gD和gB蛋白的細(xì)胞復(fù)蘇，在培養(yǎng)瓶中加入無(wú)血清培養(yǎng)基（添加1%抗結(jié)團(tuán)劑、1%雙抗、終濃度為5 mmol/L的谷氨酰胺），待細(xì)胞長(zhǎng)到200萬(wàn)/mL左右時(shí)，轉(zhuǎn)入搖瓶并添加新鮮培養(yǎng)基，使細(xì)胞起始密度為（30萬(wàn)～50萬(wàn)）/mL。先以80～100 r/min的轉(zhuǎn)速培養(yǎng)，每2 d檢查細(xì)胞密度，當(dāng)細(xì)胞密度達(dá)（300萬(wàn)～400萬(wàn)）/mL時(shí)，每1～2 d按初始體積的5%加入CHO CD Efficient?Feed B濃縮培養(yǎng)基，同時(shí)搖床轉(zhuǎn)速逐漸提高到150 r/min，直到細(xì)胞活率降到75%左右，停止培養(yǎng)，離心收集細(xì)胞上清。重復(fù)細(xì)胞培養(yǎng)過程，收集3個(gè)批次的細(xì)胞培養(yǎng)上清。

1.3 ELISA檢測(cè)試劑盒的制備

將收集到的細(xì)胞上清用碳酸鹽緩沖液（pH9.6）進(jìn)行系列梯度稀釋，包被ELISA板，每孔100 μL，每個(gè)稀釋濃度設(shè)3個(gè)復(fù)孔，4℃過夜，同時(shí)以前期分裝的猴B病毒陽(yáng)性血清進(jìn)行ELISA檢測(cè)，根據(jù)稀釋孔的吸光度（D）值，確定各批次細(xì)胞上清的稀釋率。之后，利用細(xì)胞上清制備ELISA試劑盒。試劑盒組成見表1。

表1 猴B病毒ELISA抗體檢測(cè)試劑盒組成

1.4 金標(biāo)準(zhǔn)試劑盒檢測(cè)

參照試劑盒使用說明?；具^程如下：血清稀釋至1/50后加入酶標(biāo)板，每孔100 μL，37℃溫箱孵育30 min；用洗液洗滌3次，每次3 min；每孔加入1∶100稀釋的酶標(biāo)二抗100 μL，37℃溫箱孵育30 min；用洗液洗滌3次，每次3 min；每孔加入顯色液100 μL，室溫（20～25℃）避光放置30 min；加入終止液25 μL。用酶聯(lián)儀讀取D值，測(cè)試波長(zhǎng)為405 nm，參考波長(zhǎng)為490 nm；樣品D值≥0.3判定為陽(yáng)性，＜0.3判定為陰性。

1.5 新研試劑盒的ELISA檢測(cè)

參照試劑盒使用說明?；具^程如下：將試劑盒室溫放置30 min；向每孔中加入1∶9稀釋的血清100 μL，37℃溫箱孵育30 min；用1×洗液洗滌3次，每次3 min；在吸水紙上拍干，每孔加入酶標(biāo)二抗工作液100 μL，37℃溫箱放置30 min；用1×洗液洗滌3次，每次3 min；在吸水紙上拍干，每孔加入顯色液100 μL，37℃溫箱放置15 min；加入終止液50 μL。采用雙波長(zhǎng)測(cè)定樣品的D值，測(cè)量波長(zhǎng)為450 nm，參比波長(zhǎng)為620 nm。以D值0.2為閾值，≥0.2判定為陽(yáng)性，＜0.2判定為陰性。

1.6 不同批次ELISA試劑盒的重復(fù)性實(shí)驗(yàn)

從所測(cè)樣品中挑選強(qiáng)陽(yáng)性100份、弱陽(yáng)性70份、陰性樣品108份及差異樣品7份，分別用另外2個(gè)批次的ELISA試劑盒重復(fù)檢測(cè)，考察不同批次試劑盒的穩(wěn)定性和重復(fù)性。

2 結(jié)果

2.1 CHO工程細(xì)胞上清收集及ELISA試劑盒制備

分別取3支凍存的CHO工程細(xì)胞，復(fù)蘇后用無(wú)血清培養(yǎng)基飼養(yǎng)于方瓶中，待細(xì)胞密度為200萬(wàn)/mL左右時(shí)，將其放大接種于250 mL搖瓶，使起始密度為（30萬(wàn)～50萬(wàn)）/mL；當(dāng)細(xì)胞密度達(dá)到（200萬(wàn)～300萬(wàn)）/mL時(shí)，添加 CHO CD Efficient?Feed B濃縮培養(yǎng)基，繼續(xù)培養(yǎng)直到細(xì)胞活率約75%左右，停止培養(yǎng)，離心（10 000 r/min）收集細(xì)胞上清。3個(gè)批次的細(xì)胞生長(zhǎng)曲線如圖1。細(xì)胞接種搖瓶后，通常在第4 d進(jìn)入快速生長(zhǎng)期，10～12 d達(dá)到最高密度（密度約1300萬(wàn)/mL）；此后，細(xì)胞結(jié)團(tuán)現(xiàn)象出現(xiàn)，單細(xì)胞密度呈下降態(tài)勢(shì)，并出現(xiàn)較多的死細(xì)胞。因此，在接種后14～16 d收集細(xì)胞上清。

細(xì)胞培養(yǎng)上清用碳酸鹽緩沖液稀釋，制備ELISA試劑盒，編號(hào)分別為2016-4-01、2016-4-02和2016-5-01。

2.2 標(biāo)準(zhǔn)試劑盒的檢測(cè)結(jié)果

利用VRL的ELISA試劑盒，對(duì)本單位667只食蟹猴進(jìn)行檢測(cè)，按照試劑盒的判定標(biāo)準(zhǔn)，陽(yáng)性樣品280份，陽(yáng)性率為42.0%；陰性樣品387份，陰性率為58.0%。

2.3 新研ELISA試劑盒（2016-4-01）的檢測(cè)結(jié)果

圖1 3批工程細(xì)胞的生長(zhǎng)曲線

同樣，用新研試劑盒2016-4-01對(duì)667只食蟹猴進(jìn)行檢測(cè)，測(cè)得陽(yáng)性樣品282份，陰性樣品385份。對(duì)282個(gè)陽(yáng)性樣品進(jìn)行統(tǒng)計(jì)，D值為0.2～0.5、0.5～1.0、1.0～2.0 和＞2.0 的樣品數(shù)分別為 25、45、182和30；對(duì)385個(gè)陰性樣品進(jìn)行統(tǒng)計(jì)，D值為≤0.08、0.08～0.1和 0.1～0.2的樣品數(shù)分別為 342、29和14（圖2）。總體而言，新研試劑盒陰陽(yáng)性反差明顯，在閾值D為0.2左右的樣品數(shù)少。

但是，新研試劑盒與標(biāo)準(zhǔn)試劑盒有7份樣品的檢測(cè)結(jié)果存在差異。其中標(biāo)準(zhǔn)試劑盒檢測(cè)中的3份陽(yáng)性樣品在新研試劑盒檢測(cè)中為陰性；另外4份標(biāo)準(zhǔn)試劑盒檢測(cè)為陰性的樣品，新研試劑盒檢測(cè)為陽(yáng)性，盡管其D值相對(duì)較低（0.2≤D值≤0.3）。以金標(biāo)準(zhǔn)試劑盒檢測(cè)結(jié)果為參照，新研試劑盒檢測(cè)陽(yáng)性樣品的符合率為98.93%（277/280），檢測(cè)陰性樣品的符合率為98.97%（383/387），全部樣品的符合率為98.95%（660/667）（表2）。

圖2 陽(yáng)性樣品和陰性樣品的D值分布

表2 新研試劑盒與標(biāo)準(zhǔn)試劑盒的檢測(cè)結(jié)果比較

2.4 不同批次ELISA試劑盒的重復(fù)性實(shí)驗(yàn)結(jié)果

根據(jù)上述測(cè)試結(jié)果，挑選強(qiáng)陽(yáng)性樣品100份、弱陽(yáng)性樣品70份、陰性樣品108份、差異樣品7份，共285份，分別用2016-4-02和2016-5-01試劑盒進(jìn)行檢測(cè)。結(jié)果發(fā)現(xiàn)，除1份樣品（9-10號(hào)樣品在2016-4-02和2016-5-01中的D值均小于0.2而被判為陰性，且標(biāo)準(zhǔn)試劑盒檢測(cè)為陰性）由最初的陽(yáng)性轉(zhuǎn)為陰性外，其余樣品檢測(cè)結(jié)果與2016-4-01完全一致。表明新研ELISA試劑盒的穩(wěn)定性和重復(fù)性較好。而9-10號(hào)樣品由最初的陽(yáng)性轉(zhuǎn)為陰性結(jié)果，可能與血清存放時(shí)間有關(guān)。

為了進(jìn)一步明確新研試劑盒之間以及新研試劑盒與金標(biāo)準(zhǔn)之間的差異，同時(shí)對(duì)7份存在差異的血清樣品進(jìn)行測(cè)試，結(jié)果見表3。3批次新研試劑盒總體穩(wěn)定，所有樣品D值的變異系數(shù)不超過12%。此外，比較發(fā)現(xiàn)，VRL試劑盒測(cè)試的4-18、7-1和11-2號(hào)樣品均為陽(yáng)性，而新研試劑盒3個(gè)批次均為陰性；而1-2和3-43號(hào)樣品在VRL測(cè)試中均為陰性，但新研試劑盒全為陽(yáng)性。其原因尚不清，可能與ELISA的閾值設(shè)定有關(guān)，因?yàn)樵趦深愒噭┖兄校?個(gè)樣品的D值都接近于閾值。

表3 差異樣品在不同試劑盒中的檢測(cè)結(jié)果（D值）

3 討論

作為與人類親緣最近的物種，非人靈長(zhǎng)類動(dòng)物在生命科學(xué)研究中具有明顯的比較優(yōu)勢(shì)。隨著蛋白類藥物、疫苗等生物制品研發(fā)進(jìn)度的加快，以及腦科學(xué)在全球主要國(guó)家的相繼推出，非人靈長(zhǎng)類動(dòng)物已成為不可或缺的實(shí)驗(yàn)動(dòng)物[12-13]。然而，以非人靈長(zhǎng)類動(dòng)物（特別是猴）為自然宿主的B病毒，因在猴群中的高感染率（30%～80%）和對(duì)人的高致死率（超過75%），受到包括實(shí)驗(yàn)靈長(zhǎng)類動(dòng)物產(chǎn)業(yè)界和從事靈長(zhǎng)類動(dòng)物實(shí)驗(yàn)科研人員的廣泛關(guān)注。

由于B病毒的潛伏性（可終生潛伏于三叉神經(jīng)節(jié)）和不定期活化等特征，以及全球尚無(wú)疫苗等現(xiàn)實(shí)，抗體檢測(cè)成為實(shí)驗(yàn)靈長(zhǎng)類動(dòng)物質(zhì)量控制的主要甚至是惟一手段。而在抗體檢測(cè)的核心試劑——抗原的選擇上，既有以B病毒（或裂解蛋白）作為抗原的報(bào)道，也有以其他同源病毒如HSV、猴因子8（simian agent 8，SA8）為抗原的研究報(bào)道[9，14-15]，導(dǎo)致結(jié)果也存在較大差異。近年來，隨著重組技術(shù)的不斷進(jìn)步，篩選B病毒的重要免疫分子研制亞單位疫苗和/或抗體檢測(cè)制劑已悄然興起。Perelygina比較了B病毒gB、gC、gD、gG等分子的檢測(cè)效果，敏感性為gB＞gD＞gC＞gG，特異性正好相反[16]。而Fujima研究認(rèn)為，B病毒的gD分子不僅敏感性高，而且特異性好，甚至能有效鑒別皰疹病毒屬的其他成員[17]。盡管如此，獲得實(shí)驗(yàn)靈長(zhǎng)類動(dòng)物業(yè)界認(rèn)可且以重組蛋白為抗原的B病毒抗體檢測(cè)試劑尚未見報(bào)道。美國(guó)亞特蘭大大學(xué)VRL研制的以B病毒為抗原的檢測(cè)制劑仍然是目前公認(rèn)的國(guó)際金標(biāo)準(zhǔn)。但是，由于猴B病毒屬于生物安全4級(jí)病原，病毒操作不僅需要嚴(yán)格的防護(hù)條件，而且需要專業(yè)化培訓(xùn)，對(duì)于大多數(shù)研究者來說遙不可及。我們前期研究發(fā)現(xiàn)，利用細(xì)胞共表達(dá)B病毒的gD和gB蛋白，能有效提高B病毒抗體檢測(cè)的敏感性。為此，我們?cè)趯?duì)ELISA體系進(jìn)行優(yōu)化（篩選更有利的酶標(biāo)板封閉、酶標(biāo)二抗?jié)舛?、洗液等）的基礎(chǔ)上，研制了以重組蛋白gD和gB為抗原的猴B病毒ELISA抗體檢測(cè)試劑盒。

與金標(biāo)準(zhǔn)試劑盒相比，新研試劑盒測(cè)定在陽(yáng)性樣品中的符合率為98.9%（277/280），陰性樣品為99.0%（383/387），全部667份樣品的符合率為99.0%（660/667）。盡管二者非常一致，但必須看到，金標(biāo)準(zhǔn)試劑盒測(cè)得的4份陰性樣品在新研試劑盒檢測(cè)中為陽(yáng)性，而金標(biāo)準(zhǔn)試劑盒測(cè)得的3份陽(yáng)性樣品在新研試劑盒檢測(cè)中為陰性。我們認(rèn)為差異原因可能有以下三種：一是gB和gD并非病毒感染后刺激機(jī)體產(chǎn)生免疫應(yīng)答最早最強(qiáng)的分子，或者是二者的抗體在體內(nèi)代謝較快，導(dǎo)致新研試劑盒出現(xiàn)假陰性；二是金標(biāo)準(zhǔn)試劑盒以B病毒為抗原，而該病毒分子成分復(fù)雜，既可能導(dǎo)致ELISA板孔結(jié)合最強(qiáng)抗原（如gB和gD）的量相對(duì)較少，也可能與其他異源分子（相對(duì)于動(dòng)物機(jī)體）存在較高的同源性，致使敏感性和特異性稍顯不足；三是與判定標(biāo)準(zhǔn)有關(guān)，在間接ELISA判定標(biāo)準(zhǔn)上，既可以陰性樣品的平均值+2SD（置信區(qū)間為95%），也可以陰性樣品的平均值+3SD（置信區(qū)間為99%），而7個(gè)差異樣品的D值均接近于閾值，判定標(biāo)準(zhǔn)設(shè)置的嚴(yán)格程度也會(huì)對(duì)結(jié)果產(chǎn)生微妙影響。

值得注意的是，新研試劑盒由于在ELISA體系上進(jìn)行了整體優(yōu)化而表現(xiàn)出兩個(gè)特征：一是陰陽(yáng)性樣品的D值反差非常明顯，282份陽(yáng)性樣品中D值為0.2～0.5的只有25份（8.9%），而387份陰性樣品中D值為0.1～0.2的僅有14份（3.6%）；二是新研試劑盒批次之間重復(fù)性好，用3批培養(yǎng)的細(xì)胞上清分別制備試劑盒，結(jié)果幾乎完全一致，7份差異樣品批次之間的D值差異小于12%。

綜上，我們利用B病毒重組蛋白gD和gB制備的抗體ELISA檢測(cè)試劑盒與金標(biāo)準(zhǔn)的符合率約為99%。同時(shí)，由于直接利用細(xì)胞上清進(jìn)行包被而不需要蛋白純化，有效降低了試劑盒成本，可望為我國(guó)實(shí)驗(yàn)靈長(zhǎng)類動(dòng)物產(chǎn)業(yè)提供準(zhǔn)確廉價(jià)的B病毒抗體檢測(cè)試劑。

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Preparation an Accuracy Evaluation of ELISA Kitfor Monkey B Virus Antibody

YE Hua-Hu1,CHEN Jian-Yu1,2,ZHOU Xiao-Jun1,WANG Jin1,DAI Yan-Yan1,FA Yun-Zhi1,YUAN Ju-Fang1*
1.Laboratory Animal Center,Academy of Military Medical Sciences,Beijing 100071;2.College of Life Sciences,Inner Mongolia University,Hohhot 010021;China

Objective:In order to provide a kind of high quality and low-cost detection reagents for experimen?tal primates industry,the accuracy of the newly developed B virus antibody ELISA test kits was evaluated with the gold standard kit as the reference.Methods:Three batches of cell supernatants co-expressing monkey B virus gD and gB protein were used to prepare ELISA kits for B virus antibodies test.Then,667 cynomolgus monkeys sera were detected simultaneously by gold standard kits（VRL ELISA kits） and new kits to investigate its accura?cy.Finally,strong positive,weak positive and negative samples were selected and tested by the other two batches of ELISA kits to examine the stability in different kits.Results:In 667 cynomolgus monkey sera samples,positivesamples and negative samples were 280 and 385 respectively,detected in gold standard kits.The corresponding re?sults were 282 and 387 in new ELISA kits.In positive samples,negative samples and all the samples,the coinci?dence rate was 98.93%（277/280）,98.97%（383/387）and 98.95%（660/667）,respectively,compared with gold stan?dard kits.Then,100 strong positive samples,70 weakly positive samples,108 negative samples and 7 differential samples,according to the OD values,were screened and tested with the other two batches of ELISA kits.Except for one weakly positive sample（negative in gold standard kits） tuned into negative,other samples were consistent with the previously tested.Conclusion:Compared with the gold standard ELISA kits,the newly developed kits have high accuracy,could be used for the detection of monkey B virus antibody.

monkey B virus;ELISA antibody detection kit;accuracy

R392.1

A

1009-0002（2017）05-0651-06

10.3969/j.issn.1009-

*Corresponding author,E-mail:yjf1014@tom.com

2017-02-09

國(guó)家支撐計(jì)劃（2015BAI08B03）；國(guó)家自然科學(xué)基金（31272514，31501908）

葉華虎（1970- ），男，博士，（E-mail）huahuy512@126.com

袁菊芳，（E-mail）yjf1014@tom.com