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    RRAGD-EGFP融合蛋白在MDA-MB-436細(xì)胞中的表達(dá)定位

    2017-10-24 00:34:48張崢嶸鄭幽阮班展王嫚娜梁劍青李世崇黃紅艷閆敏陳昭烈劉真真孫強(qiáng)
    生物技術(shù)通訊 2017年5期
    關(guān)鍵詞:液泡胞漿逆轉(zhuǎn)錄

    張崢嶸,鄭幽,阮班展,王嫚娜,梁劍青,李世崇,黃紅艷,閆敏,陳昭烈,劉真真,孫強(qiáng)

    1.鄭州大學(xué)附屬腫瘤醫(yī)院 乳腺科,河南 鄭州 450008;2.軍事醫(yī)學(xué)科學(xué)院 生物工程研究所,北京 100071;3.首都醫(yī)科大學(xué)附屬北京世紀(jì)壇醫(yī)院 腫瘤內(nèi)科,腫瘤治療性疫苗北京市重點(diǎn)實驗室,北京 100038

    RRAGD-EGFP融合蛋白在MDA-MB-436細(xì)胞中的表達(dá)定位

    張崢嶸1,2,鄭幽2,阮班展2,王嫚娜2,梁劍青2,李世崇2,黃紅艷3,閆敏1,陳昭烈2,劉真真1,孫強(qiáng)2

    1.鄭州大學(xué)附屬腫瘤醫(yī)院 乳腺科,河南 鄭州 450008;2.軍事醫(yī)學(xué)科學(xué)院 生物工程研究所,北京 100071;3.首都醫(yī)科大學(xué)附屬北京世紀(jì)壇醫(yī)院 腫瘤內(nèi)科,腫瘤治療性疫苗北京市重點(diǎn)實驗室,北京 100038

    目的:構(gòu)建RRAGD-EGFP融合基因表達(dá)載體pQCXIP-RRAGD-EGFP,并檢測RRAGD-EGFP融合蛋白在MDA-MB-436細(xì)胞中的表達(dá)定位。方法:提取HEK293細(xì)胞總RNA,逆轉(zhuǎn)錄得到cDNA并擴(kuò)增RRAGD基因,克隆入逆轉(zhuǎn)錄載體pQCXIP-EGFP-N1,病毒包裝后感染人乳腺癌細(xì)胞系MDA-MB-436,活細(xì)胞觀察其在細(xì)胞內(nèi)的表達(dá)定位。結(jié)果:構(gòu)建獲得逆轉(zhuǎn)錄病毒載體pQCXIP-RRAGD-EGFP,融合蛋白RRAGD-EGFP定位于胞漿囊泡和細(xì)胞核。結(jié)論:RRAGD-EGFP融合蛋白在MDA-MB-436細(xì)胞中表達(dá)定位于胞漿囊泡,與其參與溶酶體調(diào)節(jié)功能一致,為后續(xù)分析RRAGD在cell-in-cell中的作用奠定了基礎(chǔ)。

    Ras相關(guān)GTP結(jié)合蛋白D(RRAGD);基因克?。籧ell-in-cell

    Ras相關(guān)GTP結(jié)合蛋白D(Ras-related GTP binding protein D,RRAGD)由400個氨基酸殘基組成,相對分子質(zhì)量為45 588。RRAGD基因位于染色體6q15,編碼區(qū)長1200 bp[1]。

    RRAGD是GTR/RAG GTP結(jié)合蛋白家族的一員,哺乳動物體內(nèi)的該家族成員還包括RRAGA、RRAGB、RRAGC[2-3]。這4種蛋白在結(jié)構(gòu)上均有能與GTP/GDP結(jié)合的Loop環(huán)和異二聚化結(jié)構(gòu)域,從而決定了其在功能上具有小G蛋白活性和異二聚化的能力。因此,它們作為一個分子開關(guān)參與生物過程[4]。另外,它們兩兩結(jié)合,形成了RRAG A/B-C/D異二聚體(其中RRAGA和RRAGB、RRAGC與RRAGD是同源類似物),又稱Rag復(fù)合體(Rag complex)[3,5-8]。該復(fù)合體可與溶酶體上的Ragulator結(jié)合并被氨基酸激活,促進(jìn)mTORC1(mTOR complex 1)從胞漿轉(zhuǎn)移到溶酶體膜表面,并被溶酶體膜上重要的小G蛋白Rheb(Ras ho?molog enriched in brain)激活[9-11]。

    為了在活細(xì)胞中研究RRAGD的定位分布,我們擬構(gòu)建RRAGD與綠色熒光蛋白的融合表達(dá)載體。為此,我們提取了HEK293細(xì)胞中的RNA,逆轉(zhuǎn)錄得到cDNA后擴(kuò)增RRAGD基因,連入逆轉(zhuǎn)錄表達(dá)載體pQCXIP-EGFP-N1得到pQCXIPRRAGD-EGFP,進(jìn)一步在MDA-MB-436細(xì)胞中檢查了融合蛋白的亞細(xì)胞定位。

    1 材料和方法

    1.1 材料

    MDA-MB-436細(xì)胞系來自美國ATCC細(xì)胞庫,293FT細(xì)胞和HEK293細(xì)胞為本實驗室保存(均采用Macgene公司的DMEM培養(yǎng)基培養(yǎng));大腸桿菌Trans10和反轉(zhuǎn)錄試劑盒購自北京全式金生物技術(shù)有限公司;載體pQCXIP-EGFP-N1由本實驗保存;瓊脂糖凝膠回收試劑盒、質(zhì)??焖偬崛≡噭┖泻唾|(zhì)粒無內(nèi)毒素提取試劑盒均購自天根公司;TRIzol購自Ambion公司;T載體購自Pro?mega公司;Q5高保真DNA聚合酶,限制性內(nèi)切酶BglⅡ、AgeⅠ、XhoⅠ,T4DNA 連接酶購自NEB 公司;LipofectAMINE 2000、嘌呤霉素均購自Invitro?gen公司;玻璃底30 mm培養(yǎng)皿購自NEST公司。

    1.2 HEK293總RNA的提取和反轉(zhuǎn)錄PCR

    收獲2×107HEK293細(xì)胞,加入1 mL TRIzol,吹打數(shù)次后吸入離心管,室溫靜止5 min使其充分裂解;加入0.2 mL氯仿,振蕩混勻后室溫靜置10 min,4℃、12 000 r/min離心15 min;取上清至另一離心管中,加入等量的異丙醇,將管中液體輕輕混勻,室溫靜置10 min,4℃、12 000 r/min離心10 min,棄上清;加入1 mL 75%乙醇,輕輕懸浮沉淀,4℃、7500 r/min離心 5 min,棄上清;晾干,加入 20 μL DEPC 水溶解(65℃,促溶 10~15 min);定量RNA。取1 μg總RNA進(jìn)行反轉(zhuǎn)錄(反轉(zhuǎn)錄體系:1 μg RNA,1 μL Primer,10 μL Re?action Mix,1 μL Enzyme Mix,1 μL Remover,DHPC水補(bǔ)齊至20 μL),將上述體系混勻,42℃、30 min反轉(zhuǎn)錄,85℃、5 min使反轉(zhuǎn)錄酶失活。

    1.3 RRAGD基因擴(kuò)增和RRAGD-EGFP融合基因表達(dá)載體構(gòu)建

    以得到的cDNA為模板擴(kuò)增RRAGD基因,引物 為 F1(5'-CGCTCGAGATGAGCCAGGTGCTGGG GAAGC-3')和 R1(5'-CGACCGGTCGCAGCAGCA CTCTAGGGGTCCCAT-3')。PCR 擴(kuò) 增 條 件 :95℃10 s,62℃ 15 s,72℃ 45 s,30個循環(huán)。PCR使用Q5高保真聚合酶。膠回收擴(kuò)增產(chǎn)物,用Taq酶加A后連入pGEM-T載體,經(jīng)XhoⅠ/AgeⅠ酶切鑒定正確后測序,測序正確后回收目的片段,連入pQCXIP-EGFP-N1載體的XhoⅠ/AgeⅠ位點(diǎn),得到逆轉(zhuǎn)錄表達(dá)載體pQCXIP-RRAGD-EGFP(圖1)。

    1.4 病毒包裝、感染

    293FT細(xì)胞按 1×106/孔接種于6孔板,37℃、5%CO2條件下培養(yǎng)過夜。將目的逆轉(zhuǎn)錄病毒載體與包裝質(zhì)粒Gag/Pol、VSVG-R用脂質(zhì)體Lipo?fectAMINE 2000共轉(zhuǎn)染293FT細(xì)胞,6 h后換液,于24、48、72 h收取上清,用4.5 μm濾器過濾。將MDA-MB-436細(xì)胞按2×105/孔的密度接種于6孔板,每孔加入1 mL DMEM培養(yǎng)基、1 mL病毒上清和1.5 μL Polybrene,48 h后用嘌呤霉素(1 μg/mL)篩選4~5 d,獲得穩(wěn)定目的細(xì)胞株。

    圖1 pQCXIP-RRAGD-EGFP表達(dá)載體的構(gòu)建示意圖

    1.5 活細(xì)胞觀察RRAGD-EGFP融合蛋白在MDAMB-436細(xì)胞中的分布

    分別取目的細(xì)胞與未轉(zhuǎn)染的普通MDA-MB-436細(xì)胞2×105個,種于30 mm玻璃底培養(yǎng)皿中,37℃、5%CO2條件下培養(yǎng)過夜,12 h后在寬場活細(xì)胞熒光顯微鏡下,在FITC和明場下對RRAGDEGFP陽性細(xì)胞拍攝照片。

    2 結(jié)果

    2.1 pQCXIP-RRAGD-EGFP表達(dá)載體的構(gòu)建

    用引物F1和R1擴(kuò)增所得產(chǎn)物約為1200 bp,與預(yù)期大小相符,提示擴(kuò)增成功(圖2A)。將擴(kuò)增所得片段連入T載體,用XhoⅠ/AgeⅠ酶切鑒定,電泳顯示片段大小正常(圖2B),同時測序顯示序列無突變(序列未示)。膠回收目的片段,連入逆轉(zhuǎn)錄病毒載體pQCXIP-EGFP-N1,轉(zhuǎn)化后挑2個克隆(C1、C2),分別用XhoⅠ/AgeⅠ、BglⅡ/AgeⅠ雙酶切鑒定,DNA電泳片段和模式與預(yù)期相符(圖2C),測序顯示插入序列正確無誤(序列未示),證明pQCXIP-RRAGD-EGFP表達(dá)載體構(gòu)建成功。

    圖2 RRAGD基因的PCR擴(kuò)增和表達(dá)載體酶切鑒定

    2.2 RRAGD-EGFP融合基因的表達(dá)定位分析

    已知RRAGD蛋白主要分布于細(xì)胞的胞漿、胞核和溶酶體,可能依賴于與其相關(guān)的核苷酸結(jié)合狀態(tài)而進(jìn)出胞核。與此一致,我們發(fā)現(xiàn)MDAMB-436細(xì)胞中的RRAGD-EGFP蛋白表達(dá)分布在胞漿和胞核中,同時在胞漿囊泡中有特異性分布(圖3)。研究表明,在entosis(細(xì)胞侵入性死亡)的后期,mTORC1所調(diào)節(jié)的液泡分裂參與內(nèi)部死亡細(xì)胞的代謝[12],而RRAGD作為募集mTORC1的關(guān)鍵分子,其在cell-in-cell結(jié)構(gòu)中的表達(dá)分布仍未見報道,因此我們利用活細(xì)胞工作站觀察RRAGD-EGFP在cell-in-cell結(jié)構(gòu)中的表達(dá)分布變化。結(jié)果顯示當(dāng)內(nèi)部細(xì)胞進(jìn)入死亡狀態(tài)時,外部細(xì)胞的RRAGD-EGFP會聚集在內(nèi)部細(xì)胞周圍,有明顯的聚集效應(yīng);而內(nèi)部細(xì)胞處于活的狀態(tài)時,無此聚集效應(yīng)(圖3)。提示RRAGD可能參與了cell-in-cell結(jié)構(gòu)中內(nèi)部細(xì)胞的死亡及代謝過程。

    圖3 Cell-in-cell結(jié)構(gòu)中外部細(xì)胞的RRAGD-EGFP融合蛋白定位

    3 討論

    通過建立表達(dá)RRAGD-EGFP融合蛋白的細(xì)胞系,為我們在活細(xì)胞水平研究RRAGD的表達(dá)及功能提供了便利:一方面,EGFP是無毒的,對細(xì)胞的生存狀態(tài)沒有影響,因此便于在熒光顯微鏡下長時間進(jìn)行活細(xì)胞觀察,明確其表達(dá)分布的變化;另一方面,可以省去復(fù)雜的免疫熒光染色,同時簡化Western印跡實驗的抗體選擇。

    RRAGD在多種組織,如皮膚、心臟、脊髓、睪丸和視網(wǎng)膜等中均有表達(dá)。RRAGD可以參與多種信號通路,尤其是其異二聚體復(fù)合物調(diào)節(jié)mTORC1活性的功能,具有很重要的生理意義[7]。我們前期研究發(fā)現(xiàn)RRADG在乳腺癌細(xì)胞系的不同單克隆細(xì)胞株中表達(dá)差異很大,同時與乳腺癌細(xì)胞的cell-in-cell形成率具有一定的相關(guān)性,因此,通過構(gòu)建表達(dá)RRAGD-EGFP融合蛋白的細(xì)胞系,為探討RRAGD對cell-in-cell形成能力的作用及機(jī)制研究提供了合適的研究模型。

    此外,在cell-in-cell結(jié)構(gòu)中,內(nèi)部細(xì)胞是被外部細(xì)胞所形成的液泡包裹的,部分液泡的命運(yùn)與吞噬小體類似——液泡在外部細(xì)胞內(nèi)經(jīng)歷一定的事件后達(dá)到成熟,其成熟末期的標(biāo)志即液泡的分解,液泡分裂后其內(nèi)部營養(yǎng)和遺傳物質(zhì)進(jìn)入外部細(xì)胞并被利用[12]。在我們的實驗中發(fā)現(xiàn),內(nèi)部細(xì)胞處于死亡狀態(tài)時,外部細(xì)胞的RRAGD-EGFP有明顯的聚集效應(yīng),這一過程是否是通過募集mTORC1參與調(diào)節(jié)液泡的成熟,進(jìn)而促進(jìn)內(nèi)部細(xì)胞的死亡還有待研究。同時,RRAGD及其形成的異二聚體復(fù)合物的活化是否能決定cell-in-cell結(jié)構(gòu)中內(nèi)部細(xì)胞的命運(yùn),也值得深入探索。

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    [3]Sancak Y,Peterson T R,Shaul Y D,et al.The Rag GTPases bind raptor and mediate amino acid signal?ing to mTORC1[J].Science,2008,320(5882):1496-1501.

    [4]Sekiguchi T,Todaka Y,Wang Y,et al.A novel hu?man nucleolar protein,Nop132,binds to the G pro?teins,RRAG A/C/D[J].JBiolChem,2004,279(9):8343-8350.

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    Expression and Subcellular Localization of RRAGD-EGFP Fusion Protein in MDA-MB-436 Cells

    ZHANG Zheng-Rong1,2,ZHENG You2,RUAN Ban-Zhan2,WANG Man-Na2,LIANG Jian-Qing2,LI Shi-Chong2,HUANG Hong-Yan3,YAN Min1,CHEN Zhao-Lie2,LIU Zhen-Zhen1*,SUN Qiang2*
    1.Department of Breast,Cancer Hospital,Zhengzhou University,Zhengzhou 450008;2.Beijing Institute of Biotech?nology,Beijing 100071;3.Beijing Key Laboratory of Oncology and Oncology Vaccine,Beijing Shijitan Hospital,Capital University of Medical Sciences,Beijing 100038;China

    Objective:To construct the retroviral expression vector for RRAGD-EGFP fusion protein,and exam?ine its subcellular localization in MDA-MB-436 cells.Methods:Total RNA was extracted from HEK293 cells and reverse transcribed into cDNA.RRAGD(Ras-related GTP binding protein D)gene was amplified by PCR and cloned into the retroviral expression vector pQCXIP-EGFP-N1 to construct pQCXIP-RRAGD-EGFP,followed by retrovirus was made and infected MDA-MB-436,a cell line of breast cancer.Afterwards,time lapse imaging was performed.Results:The retroviral expression vector for RRAGD-EGFP fusion protein was successfully constructed.RRAGD-EGFP fusion protein was found in cytoplasmic vesicles and nucleus.Conclusion:Localization of RRAGDEGFP fusion protein in cytoplasmic vesicles is consistent with its role in lysosomal biogenesis,which has laid foun?dation for the further study on the role of RRAGD in cell-in-cell.

    Ras-related GTP binding protein D(RRAGD);gene cloning;cell-in-cell

    Q78

    A

    1009-0002(2017)05-0639-04

    10.3969/j.issn.1009-

    *Co-corresponding authors,LIU Zhen-Zhen,E-mail:Liuzhenzhen73@163.com;SUN Qiang,E-mail:sunq@bmi.ac.cn

    2017-04-05

    國家自然科學(xué)基金(81572799,31671432);國家重點(diǎn)研發(fā)計劃(2016YFC1303303);北京市自然科學(xué)基金(7162091)

    張崢嶸(1991- ),男,碩士研究生,(E-mail)18703605958@163.com;鄭幽(1989- ),女,助理研究員;二者為共同第一作者

    劉真真,(E-mail)Liuzhenzhen73@163.com;孫強(qiáng),(E-mail)sunq@bmi.ac.cn

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