利用丙型肝炎病毒復(fù)制子模型檢測重組人λ2干擾素的體外活性

張輝，李亞東，畢研偉 ，宮悅，李智華，丁晨 ，寸嫚

1.中國醫(yī)學(xué)科學(xué)院&北京協(xié)和醫(yī)學(xué)院 醫(yī)學(xué)生物學(xué)研究所，云南 昆明 650118；2.云南省重大傳染病疫苗研發(fā)重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室，云南 昆明 650118

利用丙型肝炎病毒復(fù)制子模型檢測重組人λ2干擾素的體外活性

張輝1，2，李亞東1，2，畢研偉1，2，宮悅1，2，李智華1，2，丁晨1，2，寸嫚1，2

1.中國醫(yī)學(xué)科學(xué)院&北京協(xié)和醫(yī)學(xué)院 醫(yī)學(xué)生物學(xué)研究所，云南 昆明 650118；2.云南省重大傳染病疫苗研發(fā)重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室，云南 昆明 650118

目的：利用丙型肝炎病毒（HCV）復(fù)制子細(xì)胞模型，體外研究重組人λ2干擾素（hIFNλ2）對HCV復(fù)制子的抑制作用。方法：構(gòu)建重組質(zhì)粒pcDNA3.1-hIFNλ2-HA，轉(zhuǎn)染293T細(xì)胞，表達(dá)帶有HA標(biāo)簽的hIFNλ2，表達(dá)后的上清通過Western印跡檢測，然后稀釋至不同濃度后作用于帶有HCV復(fù)制子的Huh7.5細(xì)胞系，每隔24 h取樣并更換培養(yǎng)液，通過報(bào)告基因檢測hIFNλ2對HCV復(fù)制子的抑制作用。結(jié)果：構(gòu)建了pcDNA3.1-hIFNλ2-HA真核表達(dá)重組體，并在293T細(xì)胞中表達(dá)出hIFNλ2，該蛋白能有效抑制HCV復(fù)制子的復(fù)制。結(jié)論：hIFNλ2對HCV復(fù)制子具有抑制作用。

重組人λ2干擾素；抑制；HCV復(fù)制子

丙型肝炎是一種主要經(jīng)血液傳播的疾病，是由丙型肝炎病毒（hepatitis C virus，HCV）感染引起的，已經(jīng)給全世界帶來了顯著的醫(yī)療負(fù)擔(dān)。由于HCV的自然清除率很低，大部分患者會(huì)發(fā)展為慢性感染，預(yù)計(jì)全世界有1.3～1.7億人患有慢性丙型肝炎[1]。長期感染可能導(dǎo)致晚期肝纖維化、肝硬化甚至肝癌。目前尚無有效的疫苗可以預(yù)防HCV的感染，對于HCV感染患者，臨床上采用的標(biāo)準(zhǔn)療法是聚乙二醇-α干擾素（PEG-IFNα）聯(lián)合病毒唑進(jìn)行抗病毒治療。自2011年起，新的治療方法是在標(biāo)準(zhǔn)療法的基礎(chǔ)上增加特異性的HCV蛋白酶抑制劑，即采用PEG-IFNα、病毒唑及蛋白酶抑制劑（telaprevir或 boceprevir）三聯(lián)療法[2]，最新的HCV藥物研究還包括DAAs（direct-acting an?tiviral drugs）[3]、HTAs（host-targeting agents）[4]等 ，但高昂的治療費(fèi)用、可預(yù)期的耐藥株，以及不能有效防治隨后可能誘導(dǎo)發(fā)生的肝臟疾病限制了這種療法的廣泛運(yùn)用。這就迫切需要我們進(jìn)行新的抗病毒分子的研制。

干擾素（interferon，IFN）為體內(nèi)主要的抗病毒細(xì)胞因子。自1957年Isaacs和Lindenmann[5]報(bào)道流感病毒感染的雞胚胎細(xì)胞能夠分泌一種可以抵抗流感病毒或其他病毒感染的蛋白質(zhì)以來，有關(guān)IFN的研究不斷深入。2003年，2個(gè)研究組[6-7]幾乎同時(shí)報(bào)道了一個(gè)全新的Ⅲ型干擾素家族——人 IFNλs（hIFNλs）[4]，包括 hIFNλ1、hIFNλ2、hIFNλ3（也可分別稱作IL-29、IL-28A和IL-28B）以及最近發(fā)現(xiàn)的hIFNλ4[6-8]。IFNλs與受體結(jié)合能夠激活細(xì)胞內(nèi)的JAK/STAT信號轉(zhuǎn)導(dǎo)通路，形成干擾素刺激調(diào)節(jié)因子3（IFN-stimulated regulatory factor 3，ISGF3），ISGF3進(jìn)入細(xì)胞核后啟動(dòng)相應(yīng)基因的表達(dá)。Ⅲ型干擾素的表達(dá)產(chǎn)物在體內(nèi)和體外均具有抗病毒和抗腫瘤活性。目前用于抗病毒治療的藥物主要是Ⅰ型干擾素，但副作用較明顯，所以Ⅲ型干擾素也許在干擾素替代性藥物方面具有潛在的應(yīng)用價(jià)值。

研究發(fā)現(xiàn)，IL28A（IFNλ2）具有抗病毒和抗腫瘤作用。另外，在IFNλ2轉(zhuǎn)基因的體內(nèi)實(shí)驗(yàn)中，IFNλ2可使小鼠脾細(xì)胞IFNγ增多，從而加強(qiáng)細(xì)胞毒性T細(xì)胞的活性和NK細(xì)胞的數(shù)量，促使IL-12誘導(dǎo)生成更多的IFNγ，抑制腫瘤生長。由此可見，IFN-λ2也可參與誘導(dǎo)抗腫瘤固有免疫和特異性免疫應(yīng)答[9]。IFNλs的受體主要分布于腸、肝臟等部位，其中，IFNλ2通過IFNλR1受體起作用，因此與Ⅰ型干擾素相比，能夠減少副作用。

我們將真核表達(dá)重組載體pcDNA3.1-hIFNλ 2-HA質(zhì)粒瞬時(shí)轉(zhuǎn)染293T細(xì)胞，表達(dá)hIFNλ2-HA，然后將表達(dá)的蛋白作用于帶有HCV復(fù)制子的Huh7.5細(xì)胞，通過報(bào)告基因檢測hIFNλ2對HCV復(fù)制子的抑制作用。

1 材料與方法

1.1 材料

帶有2a型HCV JFH1復(fù)制子的Huh7.5細(xì)胞系、大腸桿菌DH5α感受態(tài)細(xì)胞由本科室保存；DMEM培養(yǎng)基購于Hyclone公司；胎牛血清（FBS）購于Gibco公司；XbaⅠ、NheⅠ和BamHⅠ限制性內(nèi)切酶購于NEB公司；羊抗鼠-HRP二抗、化學(xué)發(fā)光底物試劑盒購于Thermo Fisher Scientific公司；HA單克隆抗體（HA-7）購于Sigma-Aldrich公司；質(zhì)粒小提試劑盒、DNA純化回收試劑盒購于天根生化科技（北京）有限公司；海腎螢光素酶報(bào)告基因檢測試劑盒購于Promega公司；LipofectAMINE 2000、瓊脂糖購于Invitrogen公司；6孔板和48孔板購于Costar公司；熒光化學(xué)發(fā)光分析儀（Fluoros?kan Ascent FL）購于Thermo Scientific公司。

1.2 重組表達(dá)質(zhì)粒的構(gòu)建

hIFNλ2基因由上海捷瑞生物工程有限公司合成，通過NheⅠ和BamHⅠ酶切位點(diǎn)將hIFNλ2基因插入表達(dá)載體pcDNA3.1-HA，轉(zhuǎn)化大腸桿菌DH5α感受態(tài)細(xì)胞，獲得重組表達(dá)質(zhì)粒pcDNA3.1-hIFNλ2-HA。

2a型JFH1復(fù)制子各序列原件依次為T7啟動(dòng)子-JFH1A全長-丁型肝炎病毒核酶-T7終止子，將缺失信號肽的Gaussia螢光素酶報(bào)告基因（trun?cated Gluc）與部分P7和Ns2基因融合后插入JFH1A[10]。1a型H77C復(fù)制子各序列原件依次為T7啟動(dòng)子-H77C全長-丁型肝炎病毒核酸-T7終止子，同樣將缺失信號肽的Gaussia螢光素酶報(bào)告基因與部分P7和Ns2基因融合后插入H77C。復(fù)制子中的螢光素酶報(bào)告基因（Gluc）用于檢測復(fù)制子的復(fù)制情況，抗稻瘟菌素（blasticidin)抗性基因用于篩選帶有復(fù)制子的細(xì)胞克隆。

1.3 帶有1a型H77C復(fù)制子的Huh7.5細(xì)胞系的構(gòu)建

將融合表達(dá)SEC14L2基因和EGFP報(bào)告基因、嘌呤霉素抗性基因的質(zhì)粒（pCW499）與慢病毒包裝質(zhì)粒共轉(zhuǎn)染293T細(xì)胞，48 h后收集含有慢病毒的培養(yǎng)基上清，20 000 r/min離心2 h對慢病毒進(jìn)行濃縮，將濃縮后的慢病毒感染Huh7.5細(xì)胞，通過嘌呤霉素篩選獲得能表達(dá)SEC14L2的Huh7.5穩(wěn)定轉(zhuǎn)染細(xì)胞系。

將帶有1a型H77C復(fù)制子的質(zhì)粒用XbaⅠ線性化，用T7 ribomax express large scale RNA pro?duction system試劑盒（Promega）體外轉(zhuǎn)錄為RNA，然后用TransMessenger Transfection Reagent試劑盒（Qiagen）將此RNA轉(zhuǎn)染表達(dá)SEC14L2的Huh7.5穩(wěn)定轉(zhuǎn)染細(xì)胞系，通過抗稻瘟菌素篩選獲得帶有1a型H77C復(fù)制子的細(xì)胞系。

1.4 hIFNλ2的表達(dá)

用DMEM完全培養(yǎng)基（含10%胎牛血清）培養(yǎng)293T細(xì)胞，以4×105/孔的密度將細(xì)胞傳至6孔板，37℃、5%CO2培養(yǎng)箱中培養(yǎng)約 16 h，采用 Lipo?fectAMINE 2000分別將pcDNA3.1-hIFNλ2-HA重組質(zhì)粒（實(shí)驗(yàn)組）和pcDNA3.1空質(zhì)粒（對照組）轉(zhuǎn)染293T細(xì)胞，48 h后收集上清，通過Western印跡檢測目的蛋白的表達(dá)，一抗為鼠單抗HA-tag（1∶1000），二抗為山羊抗鼠IgG-HRP（1∶5000）。

1.5 hIFNλ2對HCV復(fù)制子的抑制作用

JFH1復(fù)制子和1a型H77C型復(fù)制子均帶有螢光素酶報(bào)告基因。將帶有JFH1復(fù)制子和帶有1a型H77C型復(fù)制子的Huh7.5細(xì)胞以5×104/孔的密度傳至48孔板，12 h后將表達(dá)hIFNλ2的293T細(xì)胞的上清分別用DMEM培養(yǎng)基稀釋至1/10、1/100、1/1000后等量加入帶有2a型JFH1復(fù)制子和帶有1a型H77C型復(fù)制子的Huh7.5細(xì)胞中，分別在0、24、48、72、96 h換液，同時(shí)加入含有相同劑量干擾素的DMEM培養(yǎng)基，上清于-20°保存用于檢測螢光素酶活性。陰性對照組為不加干擾素的DMEM培養(yǎng)基，陽性對照組為含有活性單位為1000 U的α-干擾素的DMEM培養(yǎng)基，實(shí)驗(yàn)組的每個(gè)稀釋度以及對照組均做3個(gè)復(fù)孔，將在每個(gè)時(shí)間段收集的樣品的上清分別檢測螢光素酶活性，評價(jià)HCV復(fù)制子的復(fù)制水平。

2 結(jié)果

2.1 重組表達(dá)質(zhì)粒pcDNA3.1-hIFNλ2-HA的構(gòu)建

通過NheⅠ和BamHⅠ雙酶切獲取hIFNλ2目的基因片段，1%瓊脂糖凝膠電泳可見約681 bp的條帶，與預(yù)期大小一致（圖1A）。pcDNA3.1-HA載體同樣經(jīng)NheⅠ和BamHⅠ雙酶切，1%瓊脂糖凝膠電泳可見約5394 bp的目的條帶，與預(yù)期大小一致（圖1B）。對雙酶切后的片段分別純化回收，通過T4DNA連接酶連接，連接產(chǎn)物轉(zhuǎn)化大腸桿菌DH5α感受態(tài)細(xì)胞，挑取陽性克隆，振蕩培養(yǎng)后提取質(zhì)粒，XhoⅠ酶切鑒定，獲得約5863和288 bp的片段（圖1C），與預(yù)期大小相符。

2.2 構(gòu)建帶有1a型H77C復(fù)制子并能穩(wěn)定表達(dá)SEC14L2蛋白的Huh7.5的細(xì)胞系

SEC14L2蛋白能促進(jìn)HCV復(fù)制子的復(fù)制[11]，因此構(gòu)建能穩(wěn)定表達(dá)此蛋白的細(xì)胞系。為了檢測方便，構(gòu)建能融合表達(dá)SEC14L2和EGFP、嘌呤霉素抗性基因的質(zhì)粒pCW499（圖2A），與慢病毒包裝質(zhì)粒共轉(zhuǎn)染293T細(xì)胞，收集含有慢病毒的細(xì)胞上清并濃縮，將濃縮后的慢病毒感染Huh7.5細(xì)胞，48 h后通過嘌呤霉素篩選，72 h后用熒光顯微鏡觀察，可見細(xì)胞都有綠色熒光（圖2B），表明已構(gòu)建了能穩(wěn)定表達(dá)SEC14L2的Huh7.5細(xì)胞系。

圖1 重組表達(dá)質(zhì)粒pcDNA3.1-hIFNλ2-HA構(gòu)建的電泳圖

將帶有1a型H77C復(fù)制子的質(zhì)粒經(jīng)XbaⅠ線性化后，體外轉(zhuǎn)錄為RNA，轉(zhuǎn)染已構(gòu)建的能表達(dá)SEC14L2蛋白的Huh7.5穩(wěn)定轉(zhuǎn)染細(xì)胞系，經(jīng)5 μg/mL抗稻瘟菌素篩選，3周后獲得4個(gè)單克隆細(xì)胞，挑取單克隆擴(kuò)大培養(yǎng)，收集48 h的細(xì)胞培養(yǎng)上清檢測螢光素酶活性，結(jié)果顯示2號細(xì)胞克隆的復(fù)制效率較高，選擇2號單克隆細(xì)胞作為能穩(wěn)定表達(dá)SEC14L2蛋白并帶有1a型H77C復(fù)制子的細(xì)胞系（圖3）。

圖2 穩(wěn)定表達(dá)SEC14L2蛋白的Huh7.5細(xì)胞系的建立

圖3 挑取的4個(gè)單克隆細(xì)胞中復(fù)制子的復(fù)制效率

2.3 Western印跡檢測hIFN-λ2蛋白的表達(dá)

將重組質(zhì)粒pcDNA3.1-hIFNλ2轉(zhuǎn)染293T細(xì)胞，48 h后收取上清，通過Western印跡檢測hIFNλ2蛋白的表達(dá)，結(jié)果如圖4，實(shí)驗(yàn)組可見明顯目的條帶，對照組則無，說明hIFNλ2蛋白得到了較好的表達(dá)。

圖4 hIFNλ2蛋白表達(dá)的Western印跡

2.4 hIFNλ2蛋白對HCV復(fù)制子的抑制作用

由于2a型JFH1復(fù)制子和1a型H77C型復(fù)制子均帶有螢光素酶報(bào)告基因，因此可通過檢測螢光素酶活性來判斷其復(fù)制水平。將表達(dá)hIFNλ2蛋白的293T細(xì)胞上清稀釋至1/10、1/100、1/1000后，分別作用于帶有2a型JFH1復(fù)制子和帶有1a型H77C型復(fù)制子的Huh7.5細(xì)胞，陰性對照組只加入DMEM培養(yǎng)基，陽性對照組為含有1000 U α-干擾素的DMEM培養(yǎng)基，每隔24 h換液，分別收取0、24、48、72、96 h的上清，檢測螢光素酶的活性（圖5），可知hIFNλ2在48 h時(shí)已明顯抑制了復(fù)制子的復(fù)制效率，即使稀釋至1/1000仍有明顯的抑制效果，且對2a型JFH1復(fù)制子和1a型H77C型復(fù)制子均有明顯的抑制效果。

3 討論

HCV目前仍在威脅著人類的健康，在相關(guān)疫苗研發(fā)出來之前，抗病毒藥物對于HCV的治療在現(xiàn)階段仍是有效手段。干擾素是發(fā)現(xiàn)最早、研究最多、第一個(gè)克隆化和用于臨床治療的細(xì)胞因子，目前主要用于某些腫瘤和病毒性疾病的治療，但對不同的腫瘤和病毒性疾病的療效差異很大，且常出現(xiàn)一些不良反應(yīng)。新發(fā)現(xiàn)的IFNλs的功能與Ⅰ型IFN有所相似，而且能選擇性地作用于不同類型的靶細(xì)胞，它們可作為Ⅰ型（IFNα、IFNβ）或Ⅱ型（IFNγ）IFN的替代品或輔助品用于某些疾病的治療，在腫瘤、器官移植、自身免疫性疾病及變態(tài)反應(yīng)性疾病等防治方面具有潛在的應(yīng)用價(jià)值。

干擾素一直以來都是抗病毒藥物的首選，Ⅰ型干擾素是研究較多，應(yīng)用也較廣泛的抗病毒藥物，但其副作用明顯，病人用藥后會(huì)出現(xiàn)體重、血清蛋白水平及白細(xì)胞、紅細(xì)胞水平下降等癥狀，從而限制了Ⅰ型干擾素的應(yīng)用范圍。目前有關(guān)hIFNλs與病毒的作用機(jī)制正在深入研究中，已有報(bào)道顯示，IFNλ2引導(dǎo)CD4+T淋巴細(xì)胞產(chǎn)生Th1細(xì)胞因子[12]。另外，IFNλ2特定的反硫代磷酸化核苷酸抑制ConA處理的小鼠肝臟的病理變化，IFNλ2是T細(xì)胞介導(dǎo)的肝細(xì)胞損傷的關(guān)鍵致病功能的調(diào)節(jié)因子，這一結(jié)果表明，IFNλ2可能成為治療Th1介導(dǎo)的炎癥疾病的新方法[13]。

圖5 不同劑量的hIFNλ2對HCV 1a型H77C復(fù)制子（B）和2a型JFH1復(fù)制子（D）的抑制作用結(jié)果

我們通過構(gòu)建帶有HCV復(fù)制子的細(xì)胞模型，體外研究hIFNλ2蛋白對HCV復(fù)制子的抑制作用。從實(shí)驗(yàn)結(jié)果可以看出，hIFNλ2蛋白對HCV的2a型JFH1復(fù)制子和1a型H77C復(fù)制子的復(fù)制均有明顯的抑制作用，且具有一定的劑量相關(guān)性，作用24 h幾乎沒有抑制作用，作用48 h開始有明顯的抑制作用，但作用96 h后復(fù)制子仍沒有完全被清除，可能是由于作用時(shí)間不夠長（96 h）或劑量不夠高，也有可能是在hIFNλ2蛋白的作用下，HCV復(fù)制子產(chǎn)生了適應(yīng)性的突變，留下了耐hIFNλ2蛋白的HCV復(fù)制子持續(xù)存在。目前尚未見有關(guān)hIFNλ2蛋白對HCV復(fù)制子抑制作用的研究報(bào)道。本研究將有助于進(jìn)一步了解hIFNλ2蛋白的功能，為新藥研發(fā)提供新思路。

[1]Lavanchy D.The global burden of hepatitis C[J].Liv?er Int,2009,29(Suppl 1):74-81.

[2]Ozaras R,Yemisen M,Balkan I I.Current and future therapies for hepatitis C virus infection[J].N Engl J Med,2013,369(7):679-680.

[3]Kiser J J,Flexner C.Direct-acting antiviral agents for hepatitisC virusinfection.[J].Annu RevPharmacol Toxicol,2013,53:427-449.

[4]Zeisel M B,Lupberger J,Fofana I,et al.Host-target?ing agents for prevention and treatment of chronic hep?atitis C-perspectives and challenges[J]. J Hepatol,2013,58(2):375-384.

[5]Isaacs A,Lindenmann J,Valentine R C.Pillars arti?cle:Virus interference.II.Some properties of interfer?on.Proc R Soc Lond B Biol Sci.1957.147:268-273[J].J Immunol,2015,195(5):1921-1926.

[6]Kotenko S V,Gallagher G,Baurin V V,et al.IFN-lambdas mediate antiviral protection through a distinct class II cytokine receptor complex[J].Nat Immunol,2003,4(1):69-77.

[7]Sheppard P,Kindsvogel W,Xu W,et al.IL-28,IL-29 and their class II cytokine receptor IL-28R[J].Nat Immunoly,2003,4(1):63-68.

[8]Prokunina-Olsson L,Muchmore B,Tang W,et al.A variant upstream of IFNL3(IL28B)creating a new inter?feron gene IFNL4 is associated with impaired clear?ance of hepatitis C virus[J].Nat Genet,2013,45(2):164-171.

[9]Numasaki M,Tagawa M,Iwata F,et al.IL-28 elicits antitumor responses against murine fibrosarcoma.[J].J Immunol,2007,178(8):5086-5098.

[10]徐婧雯,張雪梅,王曉輝,等.病毒基因組耦聯(lián)報(bào)告基因用于篩選適宜丙型肝炎病毒培養(yǎng)的亞細(xì)胞克隆株[J].中華微生物學(xué)和免疫學(xué)雜志,2013,33(3):161-167.

[11]Saeed M,Andreo U,Chung H Y,et al.SEC14L2 en?ables pan-genotype HCV replication in cell culture[J].Nature,2015,524(7566):471-475.

[12]Siebler J,Wirtz S,Weigmann B,et al.IL-28A is a key regulator of T-cell-mediated liver injury via the T-box transcription factorT-bet[J].Gastroenterology,2007,132(132):358-371.

[13]李競,齊義新,房桂英,等.IFN-λ真核表達(dá)載體的建立及其表達(dá)產(chǎn)物的生物學(xué)功能評估[J].軍事醫(yī)學(xué),2015,39(11):816-820.

Detection of Interferon λ2 ActivityIn Vitroby HCV Repli?con Model

ZHANG Hui1,2,LI Ya-Dong1,2,BI Yan-Wei1,2,GONG Yue1,2,LI Zhi-Hua1,2,DING Chen1,2,CUN Wei1,2*
1.Institute of Medical Biology,Chinese Academy of Medical Sciences&Peking Union Medical College,Kunming 650118;2.Yunnan Key Laboratory of Vaccine Research and Development of Severe Infectious Disease,Kunming 650118;China

Objective:To study the inhibitory effect of recombinant human interferon λ2（hIFNλ2） on HCV repli?conin vitroby using cell culture system of HCV replicon.Methods:This study constructed recombinant plasmid pcDNA3.1-hIFNλ2-HA,and expressed the hIFNλ2 with HA tag in 293T cells,then detected the supernatant of the cell by Western blot,and then used supernatant diluted with different ratio to effect on Huh7.5 cell culture system with HCV replicon,samples were collected every 24 hours and replaced the medium,finally using the re?port gene to detect the inhibitory effect of the hIFNλ2 in HCV virus replicon.Results:The eukaryotic expression recombinant plasmid pcDNA3.1-hIFNλ2 was successfully contructed,and hIFNλ2 was expressed in 293T cells,and confirmed that the hIFNλ2 could inhibit the replication of HCV.Conclusion:The results proved that hIFNλ2 has a direct inhibitory effect on HCV replicon.

recombinant human interferon λ2;inhibition;HCV replicon

Q78;R392.1

A

1009-0002（2017）05-0595-05

10.3969/j.issn.1009-

*Corresponding author,E-mail:cunwei@foxmail.com

2017-03-06

云南省重點(diǎn)新產(chǎn)品開發(fā)計(jì)劃（2015BC010）

張輝（1988- ），女，碩士研究生，（E-mail）1075941427@qq.com

寸韡，（E-mail）cunwei@foxmail.com