一測多評法用于香加皮提取物中7種C21甾體皂苷成分的含量測定

李瑞雪　吳飛　張繼全

[摘要] 目的 以一測多評法建立香加皮提取物中7種C21甾體皂苷成分的高效液相色譜分析方法。 方法 采用Capcell Pak C18色譜柱，流動相乙腈-0.2%甲酸水溶液梯度洗脫，檢測波長263 nm，以杠柳苷A（PSA）為內(nèi)參物，建立其與杠柳苷K（PSK）、杠柳苷R（WJ53）、杠柳苷E（WJ521）、杠柳苷D（PSD）、杠柳苷Q（WJ33）和杠柳苷O（WJ32）的相對校正因子，并進行含量計算，實現(xiàn)一測多評，并將一測多評法測定結(jié)果與外標(biāo)法測定結(jié)果對比，驗證一測多評法的準(zhǔn)確性。 結(jié)果 PSA與PSK、WJ53、WJ521、PSD、WJ33和WJ32的相對校正因子分別為0.867、0.867、0.847、0.994、0.922和1.029。采用校正因子計算的含量值與外標(biāo)法實測值之間沒有顯著性差異。 結(jié)論 該方法準(zhǔn)確可靠，簡便可行，可作為香加皮提取物中間體多指標(biāo)成分測定的質(zhì)量控制方法。

[關(guān)鍵詞] 香加皮提取物；C21甾體皂苷；一測多評法；相對校正因子；杠柳苷A；高效液相色譜法；外標(biāo)法

[中圖分類號] R284.1 [文獻標(biāo)識碼] A [文章編號] 1673-7210（2017）09（c）-0021-04

[Abstract] Objective To establish a high performance liquid chromatography method for quantitative analysis of seven C21 steroidal saponins in Cortex periplocae extract by quantitative analysis of multi-components by single-marker. Methods The high performance liquid chromatography analysis was performed on a Capcell Pak C18 column with the detection wavelength at 263 nm. The mobile phase was water containing 0.2% formic acid and acetonitrile in the gradient mode. Periploside C （PSA） was used as the internal marker to establish relative correction factors between PSA and periploside K （PSK）， periploside R （WJ53）， periploside E （WJ521）， periploside D （PSD）， periploside Q （WJ33）， periploside O （WJ32）， and the relative correction factors would be used in the calculation of their contents. The result of quantitative analysis of multi-components by single-marker was compared with external standard method， so as to verify the accuracy of quantitative analysis of multi-components by single-marker. Results The relative correction factors between PSA and PSK， WJ53， WJ521， PSD， WJ33， WJ32 was 0.867， 0.867， 0.847， 0.994， 0.922 and 1.029， respectively. The content values calculated by correction factors and measured values of external standard method did not show significant differences. Conclusion The established quantitative analysis of multi-components by single-marker method is feasible， accurate， simple and can be used as a method for the determination of multi-component indexes in the extract of Cortex periplocae.

[Key words] Cortex periplocae extract； C21 steroidal saponins； Quantitative analysis on multi-components by single-marker； Relative correction factor； Periploside C； High performance liquid chromatography； External standard method

自2006年首次提出以來，一測多評法（quantitative analysis of multi-components by single marker，QAMS）迅速成為中藥復(fù)雜體系多指標(biāo)同時定量測定的重要手段，該法可有效節(jié)約成本，提高檢測效率，也日漸成為中藥質(zhì)量評價的新模式[1-6]。香加皮中C21甾體皂苷的藥理活性被廣泛研究[7-13]，主要有抗炎、抗癌、免疫調(diào)節(jié)、細(xì)胞分化誘導(dǎo)作用以及升白細(xì)胞作用。而C21甾體苷類成分中的杠柳苷A（PSA）是活性最明確且在香加皮提取物中含量最高的成分，因此本研究將PSA作為內(nèi)參物，建立與其他6個已知結(jié)構(gòu)成分的相對校正因子（RCF），用于7個C21甾體皂苷類成分的同時測定，并用于香加皮甾體皂苷類活性部位的質(zhì)量研究，進一步將香加皮提取物入藥，可減少服從劑量，提高患者依從性。endprint

1 儀器與試劑

1.1 儀器

Agilent 1200型和1260型高效液相色譜儀（美國安捷倫科技有限公司）；Capcell pak C18色譜柱[4.6 mm×250 mm，5 μm，資生堂（中國）投資有限公司]；Promosil C18色譜柱（4.6 mm×250 mm，5 μm，博納艾杰爾科技有限公司）；Phenomenex Luna 5 μm C18色譜柱（4.6 mm×250 mm，5 μm，美國菲羅門公司）；Kromasil 100-5C18色譜柱（4.6 mm×250 mm，5 μm，瑞典AKZO NOBEL公司）；XP205型電子分析天平（0.01 mg，梅特勒-托利多儀器有限公司）；SK5200H超聲清洗儀（上?？茖?dǎo)超聲儀器有限公司），Milli-Q型超純水制備儀（密理博中國有限公司）。

1.2 材料與試劑

香加皮提取物5批（自制，制備方法：取香加皮藥材，10倍量水提除雜2次，70%乙醇醇提3次，合并提取液濃縮至無醇，20%醇沉取沉淀，35%醇沉取沉淀，將沉淀用70%乙醇溶解，環(huán)己烷萃取3次，過大孔樹脂柱，收集95%部分洗脫液，60%醇沉，沉淀過濾、干燥，即得。批號分別為20150706、2150713、20150831、20160314和20160317）； PSA、杠柳苷K（PSK）、杠柳苷R（WJ53）、杠柳苷E（WJ521）、杠柳苷D（PSD）、杠柳苷Q（WJ33）、杠柳苷O（WJ32）對照品（批號均為20160316，由中國科學(xué)院上海藥物研究所提供，純度分別為98.16%、98.49%、98.09%、99.04%、98.13%、98.77%和95.86%）；甲醇、乙醇、甲酸（均為分析純，購自國藥集團化學(xué)試劑有限公司）；乙腈（色譜純，上海星可高純?nèi)軇┯邢薰荆?，蒸餾水。

2 方法與結(jié)果

2.1 方法學(xué)考察

2.1.1 色譜條件 色譜柱：Capcell pak C18色譜柱（4.6 mm×250 mm，5 μm）；流動相為乙腈-0.2%甲酸水溶液；梯度洗脫0～18 min（80∶20～92∶8）；柱溫30℃；流速1.0 mL/min；檢測波長為263 nm。7個對照品和樣品HPLC圖譜見圖1。

2.1.2 對照品溶液的制備 分別精密稱取PSK、WJ53、WJ521、PSD、WJ33、WJ32和PSA對照品適量于25 mL量瓶中，加甲醇超聲溶解并定容。各取1 mL對照品溶液于10 mL容量瓶中，加甲醇定容，搖勻，得濃度分別為0.099 68、0.100 28、0.104 48、0.101 68、0.099 64、0.100 80、0.102 56 mg/mL的對照品混標(biāo)溶液。

2.1.3 供試品溶液的制備 精密稱取香加皮提取物（批號：20150706）20 mg于5 mL容量瓶，加無水乙醇超聲5 min溶解，定容，搖勻，過濾，取續(xù)濾液，即得。

2.1.4 線性關(guān)系考察 分別吸取“2.1.2”項下的混合對照品溶液1、2、5、10、20、30、50 μL，按色譜條件測定，以對照品峰面積（Y）對進樣質(zhì)量（X）進行線性回歸，得回歸方程和線性范圍見表1。結(jié)果表明在0.1～5.1 μg范圍內(nèi)，7個成分的峰面積與進樣質(zhì)量線性關(guān)系良好。

2.1.5 精密度試驗 取“2.1.2”項下的混合對照品溶液10 μL，按上述色譜條件進行分析，連續(xù)進樣6次，記錄各成分的色譜峰，PSK、WJ53、WJ521、PSD、WJ33、WJ32和PSA峰面積的RSD分別為1.33%、0.16%、0.32%、0.21%、0.27%、0.34%和0.27%，表明測定精密度良好。

2.1.6 重復(fù)性試驗 取香加皮提取物（批號：20150706）20 mg，精密稱定，平行6份，按“2.1.3”項下制備供試品溶液，按上述色譜條件進行測定，測得PSK、WJ53、WJ521、PSD、WJ33、WJ32和PSA的平均含量分別為8.49、8.54、22.92、41.82、32.56、48.65、485.91 mg/g，RSD分別為2.40%、1.76%、1.66%、1.21%、1.22%、1.67%和1.73%，表明測定方法重復(fù)性良好。

2.1.7 穩(wěn)定性試驗 取香加皮提取物（批號：20150706）20 mg，精密稱定，按“2.1.3”項下制備供試品溶液，分別于0、2、4、8、12 h進樣，記錄峰面積，7個成分峰面積的RSD分別為3.43%、1.39%、1.84%、1.27%、1.14%、0.99%和0.48%，表明室溫放置條件下12 h內(nèi)供試品溶液穩(wěn)定性良好。

2.1.8 加樣回收率試驗 取香加皮提取物（批號：20150706）9份，各約10 mg，精密稱定，分別按已知含量的50%、100%、150% 3個水平加入“2.1.2”項下的單一對照品溶液，按“2.1.3”項下處理樣品，在上述色譜條件下進行測定，計算加樣回收率。PSK、WJ53、WJ521、PSD、WJ33、WJ32和PSA的平均加樣回收率分別為102.08%、102.37%、98.21%、104.61%、102.90%、103.52%和104.82%，RSD分別為3.96%、3.67%、3.07%、3.86%、3.73%、2.52%和2.82%。結(jié)果表明測定方法的回收率均符合要求。

2.2 校正因子計算

取“2.1.2”項下的混合對照品溶液1、2、5、10、20、30、50 μL，按色譜條件測定，以PSA為內(nèi)參物，按公式f1/2=f1/f2=A1/C1×C2/A2計算PSK、WJ53、WJ521、PSD、WJ33和WJ32的RCF。見表2。

2.3 系統(tǒng)適用性考察

考察了Agilent 1200型HPLC（a）和Agilent 1260型HPLC（b）液相色譜系統(tǒng)，以及4根不同的色譜柱：①Capcell Pak C18（4.6 mm×250 mm，5 μm）、②Promosil C18（4.6 mm×250 mm，5 μm）、③Phenomenex Luna 5 μm C18（4.6 mm×250 mm，5 μm）、④Kromasil 100-5C18（4.6 mm×250 mm，5 μm）。取“2.1.2”項下混標(biāo)溶液，進樣10 μL，按上述液相條件進行測定，以PSA為內(nèi)參物，計算PSK、WJ53、WJ521、PSD、WJ33和WJ32的RCF，結(jié)果內(nèi)參物與各成分的RCF的RSD值在3%以內(nèi)，表明不同色譜柱和不同液相系統(tǒng)時，方法的重復(fù)性良好。見表3。endprint

2.4 待測組分色譜峰的定位

計算各待測組分與內(nèi)參物PSA的相對保留值（r）作為色譜峰定位標(biāo)準(zhǔn)。各成分相對保留值見表4。

2.5 一測多評法與外標(biāo)法測定結(jié)果的比較

取5批香加皮提取物粉末（批號分別為20150706、 2150713、20150831、20160314和20160317）約20 mg，精密稱定，按“2.1.3”項下制備供試品溶液，按上述色譜條件進樣測定。以PSA為內(nèi)參物，采用一測多評法計算PSK、WJ53、WJ521、PSD、WJ33和WJ32的含量，同時采用外標(biāo)法進行計算含量。兩種方法測得的PSK、WJ53、WJ521、PSD、WJ33和WJ32的含量沒有顯著性差異。見表5。

3 討論

以PSA為內(nèi)參物，建立了PSK、WJ53、WJ521、PSD、WJ33、WJ32與PSA的RCF，分別為0.867、0.867、0.847、 0.994、0.922和1.029，經(jīng)過方法學(xué)和系統(tǒng)適用性驗證符合要求。采用此方法測定5批香加皮中7種成分皂苷，相對誤差小，結(jié)果與外標(biāo)法無顯著性差別。本研究所建立的香加皮中C21甾體皂苷類成分的一測多評法與外標(biāo)法[14-15]同時檢測多種成分相比較，具有操作簡單、快捷高效的特點，適合應(yīng)用于中藥多成分同時檢測的質(zhì)量控制，已經(jīng)用于準(zhǔn)確評價制劑中間體的質(zhì)量，將為后續(xù)制劑工藝研究和制劑質(zhì)量標(biāo)準(zhǔn)等相關(guān)研究奠定重要基礎(chǔ)。

[參考文獻]

[1] 王欣，覃瑤，王德江，等.一測多評法在中藥質(zhì)量控制中的應(yīng)用進展[J].中成藥，2016，38（2）：395-402.

[2] 徐文芬，楊雯，何順志，等.一測多評法測定淫羊藿中淫羊藿苷和朝藿定A，B，C[J].中草藥，2016，47（1）：130-137.

[3] 楊艷，劉云華，黃志芳，等.一測多評法測定川芎，當(dāng)歸中洋川芎內(nèi)酯A和藁本內(nèi)酯的含量[J].中國實驗方劑學(xué)雜志，2015，21（3）：58-62.

[4] 梅國榮，劉飛，王福，等.一測多評法測定決明子中橙黃決明素，大黃素，大黃酚和大黃素甲醚[J].中草藥，2016（8）：1392-1396.

[5] 黃山君，楊琪偉，石燕紅，等.一測多評法測定白芍中芍藥苷與芍藥內(nèi)酯苷的含量[J].中國中藥雜志，2011，36（6）：780-783.

[6] 崔雨晴，張繼全，吳飛，等.一測多評法測定假馬齒莧中間體中的5種三萜皂苷類成分含量[J].上海中醫(yī)藥雜志，2016，50（7）：88-93.

[7] 李瑞雪，張繼全，吳飛，等.香加皮有效成分提取工藝和檢測方法的研究進展[J].中國醫(yī)藥導(dǎo)報，2016，13（18）：37-41.

[8] Zhu YN，Zhao WM，Yang YF，et al. Periplocoside E，an effective compound from Periploca sepium Bge，inhibited T cell activation in vitro and in vivo [J]. J Pharmacol Exp Ther，2006，316（2）：662-669.

[9] Wan J，Zhu YN，F(xiàn)eng JQ，et al. Periplocoside A，a pregnane glycoside from Periploca sepium Bge，prevents concanav？鄄alin A-induced mice hepatitis through inhibiting NKT-derived inflammatory cytokine productions [J]. Int Immunopharma？鄄col，2008，8（9）：1248-1256.

[10] Zhang J，Ni J，Chen ZH，et al. Periplocoside A prevents experimental autoimmune encephalomyelitis by suppre？鄄ssing IL-17 production and inhibits differentiation of Th17 cells [J]. Acta Pharmacologica Sinica，2009，30（8）：1144-1152.

[11] Wang LY，Chen ZH，Zhou Y，et al. Structural revision of periplocosides and periperoxides，natural immunosuppre？鄄ssive agents from the genus Periploca [J]. Phytochemistry，2011，72（17）：2230-2236.

[12] Yu B，Sun J，Yang X. Assembly of naturally occurring glycosides，evolved tactics，and glycosylation methods [J]. Acc Chem Res，2012，45（8）：1227-1236.

[13] Zhang X，Zhou Y，Zuo J，et al. Total synthesis of periploside A，a unique pregnane hexasaccharide with potent immuno？鄄suppressive effects [J]. Nat Commun，2015，6：5879.

[14] 趙祎武，仲艷，徐振秋，等.高效液相色譜法測定中藥香加皮中7種孕甾烷糖苷類成分的含量[J].世界科學(xué)技術(shù)中醫(yī)藥現(xiàn)代化，2015，17（1）：138-141.

[15] 佟玲，譚曉杰，林景瑞，等.RP-HPLC法測定香加皮中異香草醛、杠柳毒苷和4甲氧基水楊醛的含量[J].藥物分析雜質(zhì)，2009，29（6）：961-963.

（收稿日期：2017-06-14 本文編輯：張瑜杰）endprint