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    氣質(zhì)聯(lián)用法測定市售醬油中氨基甲酸乙酯的含量

    2017-11-16 16:19呂昱王立雄嚴(yán)敏田仁奎
    科技創(chuàng)新與應(yīng)用 2017年33期
    關(guān)鍵詞:質(zhì)譜聯(lián)用氣相色譜

    呂昱+王立雄+嚴(yán)敏+田仁奎

    摘 要:采用固相萃取(SPE)結(jié)合氣相色譜-質(zhì)譜聯(lián)用法建立測定醬油中氨基甲酸乙酯含量的方法,醬油試樣經(jīng)過C18萃取柱凈化提純后,用丙酮-二氯甲烷溶液進(jìn)行洗脫后進(jìn)行氣相色譜-質(zhì)譜聯(lián)用儀(GC/MS)檢測,利用選擇離子掃描模式以及外標(biāo)法進(jìn)行定性定量分析。氨基甲酸乙酯在1-10μg/mL濃度范圍之間線性關(guān)系良好,r2=0.9938,檢測限為0.014μg/mL,定量限為0.048μg/mL,加標(biāo)回收率為97.78%(n=6),用這種方法對(duì)貴州地區(qū)市售醬油中氨基甲酸乙酯的含量檢測,結(jié)果在340-440μg/mL之間。

    關(guān)鍵詞:氣相色譜-質(zhì)譜聯(lián)用;氨基甲酸乙酯;市售醬油;外標(biāo)法

    中圖分類號(hào):O658.2 文獻(xiàn)標(biāo)志碼:A 文章編號(hào):2095-2945(2017)33-0067-03

    1 概述

    氨基甲酸乙酯(Ethyl carbamate,EC)是一種具有基因致癌的多位點(diǎn)致癌物質(zhì),在2007年2月被國際癌研究機(jī)構(gòu)將其從2B類(“可能令人類患癌的物質(zhì)”)升級(jí)為2A類(“能令人類患癌的物質(zhì)”)致癌物質(zhì)[1],[2],但是在它被定義為可能致癌物質(zhì)以前,它曾經(jīng)在醫(yī)學(xué)上作為抗腫瘤藥物和麻醉劑使用過[3]。它是發(fā)酵食品(如醬油、腐乳、奶酪)和酒精飲品在發(fā)酵過程中的中間產(chǎn)物[4]。

    醬油是我國各大菜系中一種傳統(tǒng)的調(diào)味品,它是用豆、麥或者麩皮釀造的液體調(diào)味品,因?yàn)檫@種釀造技術(shù)屬于發(fā)酵工程,在發(fā)酵過程中容易發(fā)生各種復(fù)雜的化學(xué)反應(yīng),生成如氨基甲酸乙酯、氯丙醇、酚醛類等物質(zhì)。其中氨基甲酸乙酯這一物質(zhì)作為一種2A類致癌物質(zhì),它具有生物遺傳毒性,在進(jìn)入人體后會(huì)對(duì)免疫系統(tǒng)造成不可逆的損傷,它在人體內(nèi)被細(xì)胞色素P450氧化后,氧化產(chǎn)物能夠誘導(dǎo)Cμ2+調(diào)控的DNA發(fā)生損傷,從而導(dǎo)致癌變[5]。所以越來越多的國家認(rèn)識(shí)到這種物質(zhì)的危害性,國際上現(xiàn)行的氨基甲酸乙酯的檢測方法是氣質(zhì)聯(lián)用檢測法[6],我國目前對(duì)醬油中氨基甲酸乙酯的含量限定及檢測方法尚無標(biāo)準(zhǔn),本研究以固相萃取結(jié)合GC/MS建立一種使用外標(biāo)法來測定市售醬油中氨基甲酸乙酯的含量的方法,為貴州地區(qū)市售醬油中氨基甲酸乙酯的含量限定作一定參考。

    2 試驗(yàn)材料、試劑及儀器

    正己烷使用液:(色譜純)天津市化學(xué)試劑廠

    二氯甲烷使用液:(分析純)成都金山化學(xué)試劑有限公司

    甲醇使用液;(分析純)純度≥99.5%,天津市富宇精細(xì)化工有限公司。

    丙酮使用液;(分析純)天津市康科德科技有限公司

    氨基甲酸乙酯標(biāo)準(zhǔn)品;

    1號(hào)醬油;味莼園牌黃豆醬油,貴陽味莼園食品有限公司

    2號(hào)醬油;味莼園牌特鮮醬油,貴陽味莼園食品有限公司

    3號(hào)醬油;味莼園牌衛(wèi)生醬油,貴陽味莼園食品有限公司

    4號(hào)醬油;味莼園牌鮮醬油,貴陽味莼園食品有限公司

    5號(hào)醬油;黃豆醬油,貴陽市白云區(qū)醬菜廠

    氣相色譜-質(zhì)譜聯(lián)用儀;安捷倫公司7890A/5975C型GC/MS

    實(shí)驗(yàn)室專用超純水機(jī);四川沃特爾科技發(fā)展有限公司

    固相萃取儀;12位方缸固相萃取裝置,月旭材料科技(上海)有限公司

    3 實(shí)驗(yàn)條件

    3.1 儀器條件

    進(jìn)樣口溫度230℃,初始柱溫100℃保持3min,階升20℃至180℃,后運(yùn)行230℃保持2min,分流模式,分流比1:10,溶劑延遲2min,全掃描模式。

    3.2 固相萃取條件

    醬油中成分復(fù)雜,基質(zhì)種類繁多,極容易對(duì)檢測結(jié)果造成干擾,所以在進(jìn)行儀器分析方法檢測含量之前對(duì)醬油進(jìn)行預(yù)處理,盡可能的進(jìn)行分離純化,將其中所含的EC提取出來[7]。由于氨基甲酸乙酯屬于極性易溶于水的物質(zhì)[7],為保證醬油中樣品檢測的回收率,經(jīng)過實(shí)驗(yàn)證明EC需停留在萃取柱中的萃取時(shí)間在30min,選擇添加丙酮-二氯甲烷(V/V)洗滌液來進(jìn)行洗脫,而且體積比為1:9的丙酮-二氯甲烷洗脫液過C18萃取小柱時(shí),回收效果最好。

    3.3 氨基甲酸乙酯氣質(zhì)聯(lián)用的定性離子的確定

    建立一個(gè)氨基甲酸乙酯檢測方法,進(jìn)樣口溫度230℃,選擇分流模式,分流比1:10;柱溫:初始100℃,保持3min,后20℃/min上升至180℃,后運(yùn)行230℃,保持2min,輔助加熱器230℃;MS條件:溶劑延遲2min,全掃描模式,全掃描參數(shù)開始 30結(jié)束450。

    以濃度為10μg/mL的EC標(biāo)準(zhǔn)溶夜進(jìn)樣一次,檢測得到一個(gè)峰型較好的峰圖,對(duì)質(zhì)譜圖進(jìn)行Nist譜庫檢索,譜庫檢索為氨基甲酸乙酯這一物質(zhì),并確定保留時(shí)間為5.75min,確定氨基甲酸乙酯的定性離子為44、62、89,總離子流圖如圖1。

    4 試驗(yàn)過程

    4.1 標(biāo)準(zhǔn)曲線的繪制

    4.1.1 EC標(biāo)準(zhǔn)溶液的配置

    用分析天平精密稱定100mg在120℃干燥至恒重的EC標(biāo)準(zhǔn)樣品,用甲醇定容至100ml得到濃度為1mg/mL的母液(冰箱里3℃存放);準(zhǔn)確吸取1000μL母液于100mL的容量瓶中用甲醇定容至刻度,所得溶液即濃度為10μg/mL的標(biāo)準(zhǔn)溶液。

    4.1.2 梯度濃度的EC標(biāo)液的配置

    準(zhǔn)確量取100μL、1000μL、2000μL、5000μL、10000μL濃度為10μg/mL的EC標(biāo)準(zhǔn)溶液置于10mL的容量瓶中用甲醇定容至刻度,即為0.1μg/mL、1.0μg/mL、2.0μg/mL、5.0μg/mL、10.0μg/mL的EC標(biāo)準(zhǔn)溶液。

    4.1.3 標(biāo)準(zhǔn)曲線的制作:按照3.3的方法分別進(jìn)樣5個(gè)不同濃度的EC標(biāo)液,然后以濃度為橫坐標(biāo)、峰面積為縱坐標(biāo)建立標(biāo)準(zhǔn)曲線。

    4.2 樣品處理

    稱取1號(hào)市售醬油5mL于干燥潔凈的燒杯中,對(duì)固相萃取柱作如下處理,將固相萃取柱裝上樣,依次用2mL甲醇和正己烷活化萃取小柱,接著再用4mL純化水平衡萃取小柱。將燒杯中的醬油倒入萃取小柱中抽真空,讓醬油停留在萃取小柱中保持30min,然后將萃取小柱上的醬油緩慢抽到廢液管中,再用正己烷淋洗以洗去雜質(zhì),最后用1:9丙酮-二氯甲烷洗脫液以自然流速洗脫,洗脫液置于45℃恒溫水浴鍋中濃縮至0.3mL左右,轉(zhuǎn)移至進(jìn)樣瓶中并用甲醇加至1mL,對(duì)2到5號(hào)醬油同操作。endprint

    4.3 醬油中氨基甲酸乙酯含量的測定

    將4.4中的1至6號(hào)醬油處理液用標(biāo)簽紙做好相應(yīng)標(biāo)記,按順序放入GC/MS自動(dòng)進(jìn)樣器的旋轉(zhuǎn)盤上。調(diào)用方法,并且改變MS掃描模式為離子掃描模式,離子掃描參數(shù)44、62、89。分別進(jìn)樣1至5號(hào)進(jìn)樣瓶,檢測五個(gè)樣品中的氨基甲酸乙酯含量,每個(gè)樣品瓶分別進(jìn)樣6次。

    4.4 加標(biāo)回收率試驗(yàn)

    取2號(hào)醬油樣品(含量約0.43μg/mL)1mL,分別添加0.5μg/mL和0.75μg/mL和1.0μg/mL的EC標(biāo)準(zhǔn)溶液各1mL,每個(gè)濃度的標(biāo)準(zhǔn)溶液都添加三份,共九份,按照3.3項(xiàng)下的檢測方法進(jìn)行檢測,檢測出加標(biāo)后的測定值。

    加標(biāo)回收率公式:加標(biāo)回收率=(加標(biāo)試樣測定值-試樣測定值)/加標(biāo)量×100%。

    4.5 精密度實(shí)驗(yàn)

    取5號(hào)醬油處理液,連續(xù)六次測定數(shù)據(jù),計(jì)算相對(duì)標(biāo)準(zhǔn)偏差。

    4.6 線性范圍

    取濃度為10μg/mL的EC標(biāo)準(zhǔn)溶夜,GC/MS進(jìn)樣1μL,選擇離子掃描模式檢測,以62離子作為定量離子峰,以氨基甲酸乙酯濃度為橫坐標(biāo),62離子強(qiáng)度為縱坐標(biāo)做標(biāo)準(zhǔn)曲線[8],在安捷倫工作站里建立曲線校正方法,得出它的線性條件和線性范圍。

    4.7 檢測限的測定

    取濃度為2μg/mL的氨基甲酸乙酯標(biāo)準(zhǔn)液,GC/MS進(jìn)樣1μL,對(duì)其進(jìn)行性能報(bào)告分析,然后根據(jù)信噪比公式D=3S/N,由此推算出學(xué)院GC/MS儀器用這種方法檢測氨基甲酸乙酯的檢測限。

    5 結(jié)果分析

    由實(shí)驗(yàn)結(jié)果可知氨基甲酸乙酯標(biāo)準(zhǔn)溶液在1-10μg/mL濃度范圍之間線性關(guān)系良好,實(shí)驗(yàn)所得線性方程為Y=2.906X-7.925(r2=0.9938)。

    由性能報(bào)告峰譜圖89,所以其檢測限應(yīng)該為0.014μg/mL,按照信噪比S/N為10得出定量限為0.048μg/mL。

    回收率實(shí)驗(yàn)的結(jié)果分析

    平均回收率為97.78%,RSD為2.59%,表明該方法準(zhǔn)確度較高,可以準(zhǔn)確地檢測出醬油中的氨基甲酸乙酯的含量。

    精密度實(shí)驗(yàn)結(jié)果分析

    5號(hào)醬油的相對(duì)標(biāo)準(zhǔn)偏差RSD(n=6)為6.5%,表明該儀器精密度良好。

    市售醬油中的氨基甲酸乙酯含量確定

    貴州地區(qū)5種市售醬油結(jié)果見表1,表明1至4號(hào)醬油中氨基甲酸乙酯濃度較5號(hào)醬油中的多。

    6 結(jié)束語

    經(jīng)過固相萃取和液液萃取的結(jié)果分析,該方法用到固相萃取對(duì)醬油進(jìn)行凈化和提純是因?yàn)镋C這一物質(zhì)在C18萃取柱中溶解度比在液體中的溶解度高,固相萃取法能有效分離提取醬油中EC。經(jīng)過GC/MS儀器檢測后,利用系統(tǒng)自帶的質(zhì)譜可以輕易的發(fā)現(xiàn)EC這一物質(zhì),雖然學(xué)院的氣質(zhì)聯(lián)用儀在這個(gè)實(shí)驗(yàn)中檢驗(yàn)的質(zhì)譜和標(biāo)準(zhǔn)譜庫中的EC質(zhì)樸圖并不完全一樣,但是這是由于EC的物質(zhì)結(jié)構(gòu)和我們所用的質(zhì)譜檢測器的檢測原理不同而造成的[9],這并不影響實(shí)驗(yàn)結(jié)果。

    GC/MS檢測法的相對(duì)標(biāo)準(zhǔn)偏差為6.5%(n=6),這種方法的檢測限為0.014μg/mL,線性范圍為1-100μg/mL,加標(biāo)回收率可達(dá)到97.78%,加標(biāo)回收率的RSD可達(dá)2.59%,這種方法具有靈敏度高、緊密度良好、線性范圍較廣等特點(diǎn),貴州地區(qū)市售醬油中氨基甲酸乙酯含量在0.34-0.44μg/mL(既是340-440μg/Ml)之間,超過20μg/L。結(jié)果表明采用SFE結(jié)合GC/MS法對(duì)貴州地區(qū)市售醬油中氨基甲酸乙酯的檢測進(jìn)行定性、定量分析能達(dá)到檢測目的。

    參考文獻(xiàn):

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    [6]高年發(fā),寶菊花.氨基甲酸乙酯的研究進(jìn)展[J].中國釀造,2006,162(9):1-4.

    [7]豐帆.醬油中氨基甲酸乙酯檢測方法的研究[D].天津科技大學(xué),

    2010:4-5.

    [8]鐘其頂,姚亮,熊正河.采用GC/MS和HPLC-FLD2種方法測定黃酒中EC含量[J].食品與發(fā)酵工業(yè),2007,33(3):115-119.

    [9]周萍萍,趙云峰,張珙,等.穩(wěn)定性同位素稀釋技術(shù)結(jié)合氣相色譜-離子阱質(zhì)譜法檢測葡萄酒中的氨基甲酸乙酯[J].中國食品衛(wèi)生雜志,2007,06:492-495.endprint

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