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    低強(qiáng)度脈沖超聲對(duì)磷酸三鈣磨損顆粒誘導(dǎo)的假體周圍骨細(xì)胞損傷的影響

    2017-10-22 11:46:10胡露琦蔡紅慧周湶錢朱莉陳啟程袁楠毛紅嬌張?jiān)?/span>
    關(guān)鍵詞:內(nèi)質(zhì)網(wǎng)顱骨骨細(xì)胞

    胡露琦 蔡紅慧 周湶錢 朱莉 陳啟程 袁楠 毛紅嬌 張?jiān)?/p>

    紹興文理學(xué)院醫(yī)學(xué)院(浙江紹興 312000)

    低強(qiáng)度脈沖超聲(low intensity pulsed ultrasound,LIPUS)是一種非侵襲性物理治療技術(shù),其穿透能力強(qiáng),可憑借其生物聲學(xué)效應(yīng)的機(jī)械波對(duì)組織、細(xì)胞施加生理剪切應(yīng)力,促進(jìn)骨重建和骨修復(fù)。Duarte等[1]于上世紀(jì)80年代發(fā)現(xiàn)LIPUS對(duì)兔骨折具有治療作用,其治愈率可高達(dá)70%,目前已被美國FDA批準(zhǔn)用于治療骨折愈合。目前有關(guān)LIPUS與骨修復(fù)之間的關(guān)系研究主要集中在骨折愈合、牽張成骨和牙槽骨修復(fù)等領(lǐng)域[2-4],而對(duì)于LIPUS對(duì)磨損顆粒誘導(dǎo)假體周圍骨溶解的影響研究在國內(nèi)外均處于起步階段。最近趙翔[5]和Hu[6]等研究表明LIPUS能抑制磨損顆粒誘導(dǎo)的假體周圍破骨細(xì)胞形成和骨溶解,延緩磨損顆粒誘導(dǎo)的假體周圍骨溶解進(jìn)程,可作為防治假體周圍骨溶解和關(guān)節(jié)松動(dòng)的一種新方法,但是其作用的靶細(xì)胞目前尚不明確。

    骨細(xì)胞均勻分布于礦化的骨基質(zhì)中,其數(shù)量占骨組織細(xì)胞90%~95%。骨細(xì)胞能通過其豐富的偽足彼此連接形成骨細(xì)胞網(wǎng)絡(luò),維持自身生理功能或合成和分泌牙本質(zhì)基質(zhì)蛋白(dentin matrix protein 1,DMP-1)及骨硬化蛋白(sclerosis protein,SOST)等分子調(diào)控骨表面的成骨細(xì)胞和破骨細(xì)胞活動(dòng)而影響骨重建[7-9],是維持成熟骨新陳代謝的主要細(xì)胞。最近我們研究顯示磷酸三鈣(tricalcium phosphate,TCP)磨損顆??烧T導(dǎo)假體周圍骨細(xì)胞凋亡,并釋放TNF-α、IL-1β、IL-6和RANKL等因子釋放,誘導(dǎo)破骨細(xì)胞活化,促進(jìn)破骨細(xì)胞生成而調(diào)控假體周圍骨溶解。由此推測(cè):骨細(xì)胞參與調(diào)控磨損顆粒誘導(dǎo)的假體周圍骨溶解,可能是LIPUS阻止假體周圍骨溶解的另一種新的靶細(xì)胞。

    本研究應(yīng)用TCP磨損顆粒誘導(dǎo)小鼠顱骨溶解模型,以假體周圍骨細(xì)胞為研究對(duì)象,觀察LIPUS對(duì)假體周圍骨細(xì)胞活性和功能的影響,探討LIPUS對(duì)假體周圍骨細(xì)胞損傷的保護(hù)作用及其機(jī)制;為研究和防治假體周圍骨溶解和關(guān)節(jié)松動(dòng)提供一種新的靶細(xì)胞、新方法和新的治療靶點(diǎn),并為L(zhǎng)IPUS的臨床應(yīng)用提供理論和實(shí)驗(yàn)依據(jù)。

    1 材料和方法

    1.1 實(shí)驗(yàn)動(dòng)物

    6~8周齡ICR雄性小鼠30只,體重 18~22 g,清潔級(jí),購自浙江省醫(yī)學(xué)科學(xué)院實(shí)驗(yàn)動(dòng)物中心。實(shí)驗(yàn)前將動(dòng)物置室內(nèi)適應(yīng)性飼養(yǎng)3 d,溫度22~28°C,相對(duì)濕度50%~70%。

    1.2 小鼠顱骨溶解模型的構(gòu)建[10]與實(shí)驗(yàn)分組

    30只ICR雄性小鼠,隨機(jī)分為正常組、模型組和LIPUS治療組,每組10只。模型組和LIPUS治療組小鼠分別于第1、3、5、7、9和第11周向顱頂注射TCP磨損顆粒0.5 mL(約1010個(gè)顆粒)建立小鼠顱骨溶解模型。治療組小鼠于TCP磨損顆粒注射1周后小鼠顱頂接受LIPUS干預(yù)治療3個(gè)月,正常組小鼠顱頂僅接受陰性超聲探頭按壓處理3個(gè)月。

    1.3 LIPUS參數(shù)設(shè)定與處理方法

    采用超聲骨折愈合儀(日本伊藤,Osteoteron-IV)進(jìn)行治療。LIPUS治療參數(shù)為強(qiáng)度30 mW/cm2,頻率1.5 MHz,頻寬 200 μs,重復(fù)頻率 1.0 kHz。治療時(shí)將超聲探頭涂抹無菌耦合膠緊貼于小鼠顱骨頂皮膚上,每天治療1次,每天治療時(shí)間 20 min,每周 6 d,持續(xù)3個(gè)月。實(shí)驗(yàn)結(jié)束后處死所有實(shí)驗(yàn)動(dòng)物取顱骨(以正中矢狀線為中心的方形區(qū)域)。

    1.4 測(cè)試指標(biāo)與方法

    1.4.1 Micro-CT分析與三位重建

    各組小鼠顱骨經(jīng)4%多聚甲醛固定48 h后,行Mi?cro-CT掃描(條件為電壓59 kV、電流167 μA、深度16 bit、曝光時(shí)間295 ms,分辨率為9.18 μm),選顱骨相同位置的感興趣區(qū)域(region of interest,ROI)進(jìn)行三維重建。應(yīng)用ABA專用骨骼分析軟件定量分析骨溶解面積變化。

    1.4.2 HE染色

    顱骨經(jīng)10%甲醛固定24 h和10%EDTA(pH7.4)脫鈣2周后進(jìn)行石蠟包埋。后經(jīng)切片機(jī)對(duì)顱骨矢狀面連續(xù)切片(5 μm),脫蠟后行HE染色觀察假體周圍骨細(xì)胞數(shù)量和活性,應(yīng)用Image Pro-Plus 6.0(美國Media Cy?bernetics公司)軟件分析骨細(xì)胞和死亡骨細(xì)胞數(shù)/mm2。

    1.4.3 骨細(xì)胞的獲取

    參照[10,11]方法分離骨細(xì)胞。顱骨去除軟組織和骨膜后,小鼠顱骨與0.2%IV型膠原酶溶液(用含70 mM NaCl,10 mM NaHCO3,60 mM sorbitol,30 mM KCl,3 mM K2HPO4,1 mM CaCl2,0.1%bovine serum albumin,0.5%glucose 和 25 mM HEPES)在37 °C培養(yǎng)箱中孵育20 min。去除上清液,顱骨碎片在37°C與含5 mM EDTA和0.1%BSA消化液中消化20 min,中間吹打1次。PBS沖洗后,重復(fù)以上消化步驟4次,收集最后2步消化后的上清液含有大量的骨細(xì)胞。

    1.4.4 流式細(xì)胞術(shù)檢測(cè)骨細(xì)胞凋亡

    各組骨細(xì)胞與5 μL Annexin V-FITC/10 μL碘化丙啶(PI)輕輕混勻后,避光室溫溫育15 min。然后加入200 μL PBS并混勻,上流式細(xì)胞儀檢測(cè)細(xì)胞凋亡情況。FITC的激發(fā)波長(zhǎng)為488 nm,檢測(cè)發(fā)射波長(zhǎng)575 nm(Ex:488nm,Em:575nm)。

    1.4.5 Western blotting ting檢測(cè)蛋白表達(dá)[12]

    各組骨細(xì)胞加入RIPA(100 μL)裂解液置于冰上裂解30 min。經(jīng)12000 r/min離心15 min收集上清液即為總蛋白,通過BCA?試劑盒檢測(cè)各組顱骨總蛋白濃度。各組顱骨蛋白提取液加入上樣緩沖液后煮沸10 min,冷卻后每孔上樣30 μg蛋白,行12%SDS-PAGE分離蛋白,電泳完成后將蛋白轉(zhuǎn)移到PVDF膜上,經(jīng)5%脫脂牛奶常溫封閉2 h后,分別加入兔源性一抗DMP-1(1︰500)、SOST(1︰500)、GRP78(1︰1000)、IRE1α(1︰1000)、XBP1s(1︰1000)、JNK(1︰1000)、p-JNK(1︰1000)和β-actin(1︰1000)置于4 °C孵育過夜。次日用TBST洗滌3次后加入HRP標(biāo)記的二抗室溫孵育2 h,TBST清洗3次加入ECL顯色液;通過凝膠成像系統(tǒng)掃描分析各蛋白變化。

    1.5 統(tǒng)計(jì)學(xué)處理

    用SPSS 16.0統(tǒng)計(jì)軟件進(jìn)行分析。數(shù)據(jù)均采用均數(shù)±標(biāo)準(zhǔn)差(±s)表示,多組間比較采用單因素方差分析(one way ANOVA),組間兩兩比較采用Bonferroni矯正的配對(duì)t檢驗(yàn)。以P<0.05為差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

    2 結(jié)果

    2.1 TCP磨損顆粒粒徑分析結(jié)果

    TCP磨損顆粒經(jīng)電鏡掃描顯示TCP磨損顆粒平均粒徑為1.997 μm(90%<3.2 μm),顆粒容易發(fā)生聚集(圖1)。

    圖1 TCP磨損顆粒掃描電鏡(A,×6000)和粒徑分布(B)

    2.2 各組小鼠顱骨溶解情況觀察

    我們前期已經(jīng)成功建立了小鼠顱骨溶解模型,并通過抗酒石酸酸性磷酸酶(TRAP)染色驗(yàn)證了該模型,表明該模型可用于研究假體周圍骨細(xì)胞損傷。本研究Micro-CT分析結(jié)果(圖2)也顯示:與正常組比較,模型組小鼠顱骨正中矢狀縫發(fā)生明顯骨溶解,而LIPUS干預(yù)組假體周圍骨溶解程度明顯減輕(P<0.05)。

    圖2 Micro-CT分析各組小鼠顱骨溶解情況(n=3)

    2.3 各組小鼠顱骨假體周圍骨細(xì)胞特征蛋白表達(dá)比較

    與正常組比較,模型組假體周圍骨細(xì)胞特征蛋白DMP-1明顯下調(diào)而SOST顯著上調(diào),造成DMP-1/SOST顯著減少,即TCP磨損顆粒誘導(dǎo)假體周圍骨細(xì)胞功能損傷;與正常組比較,差異具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.05);而LIPUS治療組假體周圍骨細(xì)胞功能損傷減弱,表現(xiàn)為假體周圍骨細(xì)胞DMP-1顯著上調(diào),SOST顯著下調(diào),DMP-1/SOST明顯增加,增加為模型組的3.13倍;與模型組比較,差異具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.05)。見圖3。

    圖3 免疫印跡技術(shù)檢測(cè)各組骨細(xì)胞特征蛋白SOST和DMP-1表達(dá)的變化(n=3)

    2.4 各組小鼠假體周圍骨細(xì)胞損傷結(jié)果

    與正常組比較,模型組假體周圍骨細(xì)胞損傷嚴(yán)重(圖4),表現(xiàn)為假體周圍骨細(xì)胞活性降低,死亡骨細(xì)胞增加;與正常組比較,差異具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.05);而LIPUS治療組假體周圍骨細(xì)胞活性明顯升高,死亡骨細(xì)胞數(shù)減少,與模型組比較,差異具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.05)。

    2.5 各組小鼠顱骨假體周圍骨細(xì)胞凋亡比較

    流式細(xì)胞術(shù)定量分析結(jié)果顯示,模型組凋亡的骨細(xì)胞數(shù)量較多,而正常組很少,提示TCP磨損顆粒能誘導(dǎo)假體周圍骨細(xì)胞凋亡(圖5);LIPUS干預(yù)可明顯抑制TCP磨損顆粒誘導(dǎo)的骨細(xì)胞凋亡,阻止其凋亡和壞死,使細(xì)胞凋亡率和壞死率分別減少為11.35%和2.78%;與模型組比較,差異具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(圖5、表1,P<0.05)。

    圖4 HE染色檢測(cè)各組假體周圍骨細(xì)胞損傷情況(n=3)

    圖5 流式細(xì)胞術(shù)定量分析TCP磨損顆粒誘導(dǎo)假體周圍骨細(xì)胞凋亡

    2.6 各組小鼠顱骨假體周圍骨細(xì)胞內(nèi)質(zhì)網(wǎng)應(yīng)激相關(guān)蛋白表達(dá)

    與正常組比較,模型組假體周圍骨細(xì)胞發(fā)生內(nèi)質(zhì)網(wǎng)應(yīng)激反應(yīng),并激活I(lǐng)RE1α-XBP1-JNK信號(hào)通路,表現(xiàn)為內(nèi)質(zhì)網(wǎng)應(yīng)激通路蛋白GRP78、IRE1α、XBP1s及p-JNK等表達(dá)均增加(圖6),與正常組比較,差異具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.05)。而LIPUS治療組假體周圍骨細(xì)胞內(nèi)質(zhì)網(wǎng)應(yīng)激關(guān)鍵蛋白GRP78和IRE1α-XBP1-JNK通路蛋白表達(dá)均明顯減少,與模型組比較,差異具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(圖6,P<0.05)。

    圖6 免疫印跡法檢測(cè)假體周圍骨細(xì)胞內(nèi)質(zhì)網(wǎng)應(yīng)激反應(yīng)(n=3)

    3 討論

    本研究首先通過Micro-CT分析證實(shí)了LIPUS可抑制TCP磨損顆粒誘導(dǎo)的假體周圍骨溶解,與以往報(bào)道結(jié)果基本一致[7,8],表明LIPUS可作為治療假體周圍骨溶解和關(guān)節(jié)松動(dòng)的一種新方法,但是其作用的靶細(xì)胞及其調(diào)控機(jī)制目前還未見報(bào)道。在此基礎(chǔ)上,本研究以假體周圍含量豐富的力學(xué)敏感細(xì)胞——骨細(xì)胞為研究對(duì)象,探討頻率為1.5 MHz、強(qiáng)度為30 mW/cm2的LI?PUS作用于假體周圍骨細(xì)胞后的應(yīng)答反應(yīng)。實(shí)驗(yàn)結(jié)果顯示LIPUS可明顯抑制TCP磨損顆粒誘導(dǎo)的假體周圍骨細(xì)胞活性降低、功能損傷及骨細(xì)胞凋亡,增加假體周圍骨細(xì)胞活性、數(shù)量并恢復(fù)其功能。2014年Fung等[15]也報(bào)道該頻率和強(qiáng)度的LIPUS能促進(jìn)體外培養(yǎng)的骨細(xì)胞MLO-Y4釋放力學(xué)信號(hào)分子PGE2和NO,促進(jìn)成骨細(xì)胞MC3T3-E1的分化和新骨形成。上述結(jié)果提示,LI?PUS能對(duì)假體周圍的骨細(xì)胞施加生理剪切應(yīng)力,促進(jìn)骨細(xì)胞釋放力學(xué)信號(hào)分子,從而促進(jìn)成骨細(xì)胞分化、抑制破骨細(xì)胞功能,最終阻止假體周圍骨溶解和關(guān)節(jié)松動(dòng),但是其作用機(jī)制目前還不清楚。

    LIPUS產(chǎn)生的剪切應(yīng)力在細(xì)胞內(nèi)部物理傳遞到內(nèi)質(zhì)網(wǎng)膜后會(huì)影響內(nèi)質(zhì)網(wǎng)功能[16,17],而內(nèi)質(zhì)網(wǎng)是細(xì)胞內(nèi)蛋白合成、翻譯后修飾、折疊組裝的場(chǎng)所。多種病理刺激可引起未折疊蛋白或錯(cuò)誤折疊蛋白在內(nèi)質(zhì)網(wǎng)腔內(nèi)大量堆積,引發(fā)內(nèi)質(zhì)網(wǎng)應(yīng)激。內(nèi)質(zhì)網(wǎng)應(yīng)激的調(diào)控包含PERK、1型內(nèi)質(zhì)網(wǎng)轉(zhuǎn)膜蛋白激酶1α(inositol-requiring enzyme,IRE1α)和活化轉(zhuǎn)錄因子6(activating transcrip?tion factor 6,ATF6)三條信號(hào)通路[18-21]。其中IRE1α是ER膜上I型跨膜蛋白,在內(nèi)質(zhì)網(wǎng)應(yīng)激狀態(tài)下可剪切細(xì)胞質(zhì)中 XBP1,形成剪切型 XBP1(XBP1s),后者進(jìn)入細(xì)胞核與內(nèi)質(zhì)網(wǎng)應(yīng)激元件及未折疊反應(yīng)元件結(jié)合,增強(qiáng)內(nèi)質(zhì)網(wǎng)應(yīng)激相關(guān)蛋白GRP78等的表達(dá)[22]。然而嚴(yán)重或長(zhǎng)期內(nèi)質(zhì)網(wǎng)應(yīng)激時(shí),IRE1α可結(jié)合腫瘤壞死因子受體相關(guān)因子(tumor necrosis factor associated factor 2,TRAF2),并與凋亡信號(hào)調(diào)節(jié)激酶(ASK1)形成TRAF2-ASK1-JNK復(fù)合體,激活JNK通路而調(diào)節(jié)凋亡相關(guān)基因Bcl-2和Bax,促進(jìn)細(xì)胞凋亡[23]。我們前期研究已經(jīng)證實(shí)內(nèi)質(zhì)網(wǎng)應(yīng)激參與調(diào)控TCP磨損顆粒誘導(dǎo)的假體周圍骨細(xì)胞損傷,表現(xiàn)為TCP磨損顆粒組小鼠假體周圍骨細(xì)胞活性較低、骨細(xì)胞凋亡顯著,內(nèi)質(zhì)網(wǎng)應(yīng)激通路相關(guān)蛋白GRP78、IRE1α、XBP1s和p-JNK等表達(dá)也明顯增加,且骨細(xì)胞損傷程度與上述內(nèi)質(zhì)網(wǎng)應(yīng)激通路蛋白表達(dá)呈正相關(guān)。但是內(nèi)質(zhì)網(wǎng)應(yīng)激在LIPUS阻止假體周圍骨細(xì)胞損傷中的作用目前還未見報(bào)道。

    本研究Western blotting結(jié)果顯示LIPUS可明顯減弱TCP磨損顆粒誘導(dǎo)的假體周圍骨細(xì)胞內(nèi)質(zhì)網(wǎng)應(yīng)激反應(yīng);LIPUS干預(yù)還能顯著減少假體周圍骨細(xì)胞中GRP78、IRE1α、XBP1s和 p-JNK 等蛋白表達(dá),抑制IRE1α-XBP1-JNK信號(hào)通路的活化。以上研究結(jié)果表明LIPUS可阻止TCP磨損顆粒誘導(dǎo)假體周圍骨細(xì)胞損傷,其作用機(jī)制可能與抑制IRE1α-XBP1-JNK通路的活化密切相關(guān)。

    綜上,LIPUS可通過緩解假體周圍骨細(xì)胞中IRE1α-XBP1-JNK通路介導(dǎo)的內(nèi)質(zhì)網(wǎng)應(yīng)激反應(yīng),阻止TCP磨損顆粒誘導(dǎo)的假體周圍骨細(xì)胞損傷,進(jìn)而減少假體周圍骨溶解。因此,骨細(xì)胞可能是LIPUS防治假體周圍骨溶解和關(guān)節(jié)松動(dòng)的一種新的靶細(xì)胞,而IRE1α-XBP1-JNK通路可能是LIPUS阻止假體周圍骨細(xì)胞損傷的一個(gè)新靶點(diǎn)。

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