不同時間一次有氧運動對小鼠骨骼肌Nrf2與Keap1結合作用的影響

姬衛(wèi)秀 毛雅蕓 王林佳 羅琳 張纓

北京體育大學（北京 100084）

NF-E2相關因子（NF-E2-related factor 2，Nrf2）是細胞氧化應激反應中的關鍵轉錄因子，可調節(jié)靶基因Ⅱ相解毒酶和抗氧化酶基因的表達[1，2]。在生理狀態(tài)下，Nrf2與Kelch樣環(huán)氧氯丙烷相關蛋白-1（Kelchlike ECH-associated protein-1，Keapl）耦聯(lián)，被錨定于胞漿中，并通過泛素化介導Nrf2蛋白降解[3]。運動產(chǎn)生的活性氧（ROS）可激活Nrf2，使Nrf2與Keapl發(fā)生解偶聯(lián)，并使其從細胞漿轉位至細胞核與Maf蛋白形成雜化二聚體[4]，而后與下游抗氧化靶基因DNA上的抗氧化元件（ARE）結合，啟動其靶基因的轉錄[5，6]。

研究發(fā)現(xiàn)小鼠在急性運動后骨骼肌和心肌中的Nrf2-ARE結合活性增加[7，8]。年輕男性在急性運動后骨骼肌中Nrf2 mRNA水平也出現(xiàn)升高[9]。Horie等使用電脈沖刺激C2C12細胞模擬急性運動，發(fā)現(xiàn)Nrf2的表達增加，且與刺激的強度和持續(xù)時間密切相關[10]。我們在前期研究中發(fā)現(xiàn)，小鼠一次有氧運動1小時后，骨骼肌Nrf2-ARE結合活性和細胞核內Nrf2蛋白表達量無變化，而一次有氧運動6小時后兩者均增加[11]。可見急性有氧運動增強小鼠骨骼肌Nrf2抗氧化信號也依賴于運動的持續(xù)時間，但其變化機制并不十分清楚。

因此，本研究在前期研究的基礎上，以Nrf2與Ke?ap1的結合作用為切入點，進一步探討不同時間一次有氧運動對小鼠骨骼肌Nrf2/Keap1結合量、Nrf2和Keap1總蛋白表達量、Nrf2核蛋白表達量以及ROS水平的影響，為運動介導Nrf2影響骨骼肌抗氧化作用的分子機制提供理論依據(jù)。

1 材料與方法

1.1 研究對象

健康8周齡C57BL/6J雄性小鼠（購于維通利華公司實驗動物技術有限公司，動物合格證號：SCX-K（京）2009-0004，30只，體重18.37 ± 2.26 g，每籠3～4只，飼養(yǎng)于北京體育大學動物房，動物房溫度保持在20～25°C，相對濕度保持在50%～70%，每天光照12 h（7:00～19:00），實驗動物均自由進食和飲水。按體重隨機分為3組，分別是安靜對照組（0 h組）和一次有氧運動3小時組（3 h組）、一次有氧運動6小時組（6 h組），每組10只。

安靜對照組正常飼養(yǎng)不做任何處理，運動組小鼠進行跑臺運動，跑速為15 m/min（70%VO2max強度），坡度為0。運動時間分別為3小時、6小時。正式運動前進行2天的適應性運動。

1.2 取材

在運動組小鼠運動結束后即刻，所有組小鼠脫頸處死，迅速取兩側腿部骨骼?。ㄓ捎谛∈篌w型小，取腿部所有肌肉），用錫紙包裹標記，投于液氮，后轉移至－80°C冰箱備后續(xù)之用。

1.3 指標測定

1.3.1 ROS測定

小鼠骨骼肌ROS的測定使用GENMED試劑盒（中國上海杰美基因醫(yī)藥科技有限公司，GMS10016.3），采用高質熒光進行測定。取100 mg組織進行實驗，具體操作嚴格按照試劑盒的說明書進行。

1.3.2 提取蛋白

提取總蛋白，取100 mg組織，加入800 μl含蛋白酶抑制劑的RIPA蛋白裂解液，超聲勻漿，冰上靜置30 min，后12000 rpm，4°C離心30 min，取上清溶液即為總蛋白。

提取核蛋白，取100 mg組織，加入800 μl含蛋白酶抑制劑的蛋白裂解液A，超聲勻漿，冰上靜置10 min，振蕩器震蕩5 s，再于冰上靜置10 min，震蕩5 s，然后16000 rpm，4°C離心10 min，棄上清。加入含蛋白酶抑制劑的蛋白裂解液B，振蕩器震蕩振蕩15 s，冰上靜置10 min，交替進行，共振蕩4次，靜置40 min，然后16000 rpm，4°C離心10 min，取上清溶液即為核蛋白。

1.3.3 免疫共沉淀

采用免疫共沉淀法測組織總蛋白中Nrf2/Keap1的結合量。將1 ml蛋白濃度為1 μg/μl總蛋白加入到含20 μl Protein A/G Mix Magnetic Beads（美國 Millipore公司，LSKMAGAG02）的離心管中，4°C搖床2 h，將離心管放到磁力架（美國Millipore公司）上，轉移上清；向上清中加入5 μl Keap1抗體（sc-33569，santacruz）（In?put中加入Nomal rabbit IgG），4°C搖床過夜；次日加入30 μl Protein A/G Mix Magnetic Beads，室溫搖床 2 h，棄上清，PBS清洗3次，加35 μl上樣緩沖液洗脫，70°C水浴10 min，轉移上清液，重復洗脫第二遍，共吸出上清液70 μl。用Bolt 4%～12%Bis-Tris Plus凝膠（美國life technologies公司）上樣30 μl進行電泳。之后采用美國Invitrogen公司的iBlot 2將蛋白從電泳凝膠轉移至NC膜上。目的條帶標記后用5%的脫脂牛奶或BSA封閉1小時后，加入一抗稀釋液Nrf2（ab62352，1:200）于4°C搖床孵育過夜。次日洗脫一抗后加入相應二抗稀釋液室溫搖床孵育1小時。最后洗脫二抗后加發(fā)光液用BIO-RAD凝膠顯影儀器進行顯影。

1.3.4Western Blot

對提取的組織蛋白（總蛋白和核蛋白）進行BCA蛋白濃度測定（BCA Protein Assay Reagent，美國 Ther?mo Scientific公司），根據(jù)濃度計算配樣，上樣量為20μg。采用Bolt 4%～12%Bis-Tris Plus凝膠（美國life technologies公司）和NuPAGE MES SDS電泳緩沖液（美國life technologies公司）進行電泳。之后采用美國Invitrogen公司的iBlot 2將蛋白從電泳凝膠轉移至NC膜上。目的條帶標記后用5%的脫脂牛奶或BSA封閉1小時后，進行一抗孵育：Nrf2（ab62352，1︰200）、Keap1（sc-33569，1︰500）、總蛋白內參β-actin（sc-47778，1︰1000）、核蛋白內參H1（sc-1999，1︰1500），于4℃搖床孵育過夜。次日洗脫一抗后進行二抗孵育1小時：Nrf2（羊抗兔，中杉金橋，ZB-2301，1︰2000）、Ke?ap1（羊抗兔，中杉金橋，ZB-2301，1︰5000）、β-actin（羊抗鼠，中科晨宇，164017，1︰5000）、H1（羊抗鼠，中科晨宇，164017，1︰3000）。最后洗脫二抗后加發(fā)光液用BIO-RAD凝膠顯影儀器進行顯影，用其配套軟件進行條帶檢測與分析。讀取灰度值，計算結果，公式如下：

1.4 統(tǒng)計學分析

各實驗結果用平均數(shù)±標準差表示，采用SPSS17.0軟件對實驗數(shù)據(jù)進行統(tǒng)計處理，數(shù)據(jù)分析方法為單因素方差分析，用P＜0.05和P＜0.01分別表示具有顯著性和非常顯著性差異。

2 結果

2.1 不同時間一次有氧運動對小鼠骨骼肌活性氧（ROS）水平的影響

由圖1可知，與0 h組相比，3 h組小鼠骨骼肌ROS水平略有升高，但無統(tǒng)計學意義；6 h組小鼠骨骼肌ROS水平顯著性升高（P＜0.05）。3 h組和6 h組之間無顯著差異。

圖1 各組小鼠骨骼肌ROS水平的變化

2.2 不同時間一次有氧運動對小鼠骨骼肌Nrf2/Keap/1結合量的影響

由圖2可知，一次有氧運動3 h、6 h后小鼠骨骼肌Nrf2/Keap1結合量與0 h組比均顯著降低（P＜0.05），一次有氧運動兩組之間沒有顯著性變化。

圖2 各組小鼠骨骼肌Nrf2/Keap1結合量的變化

2.3 不同時間一次有氧運動對小鼠骨骼肌Nrf2總蛋白、核蛋白表達的影響

由圖3可知，與0 h組相比，3 h組和6 h組小鼠骨骼肌Nrf2總蛋白表達出現(xiàn)顯著性增加（P＜0.05），而3 h組和6 h組之間無顯著差異。6 h組小鼠骨骼肌Nrf2核蛋白表達與0 h、3 h組比均顯著增加（P＜0.05）。

圖3 各組小鼠骨骼肌Nrf2總蛋白、核蛋白表達量的變化

2.4 不同時間一次有氧運動對小鼠骨骼肌Keap 1總蛋白表達的影響

由圖4可知，不同時間一次有氧運動后小鼠骨骼肌Keap1總蛋白表達基本無變化。

圖4 各組小鼠骨骼肌Keap1總蛋白表達量的變化

3 討論

3.1 不同時間一次有氧運動對小鼠骨骼肌ROS、Nrf2/Keap1結合作用和Nrf2總蛋白表達的影響

運動引起的氧化應激，可使骨骼肌產(chǎn)生過多的活性分子ROS。當生成的ROS超出骨骼肌的清除能力時，會造成氧化與抗氧化系統(tǒng)失衡，從而導致細胞損傷[12]。另一方面，ROS作為信號物質，它的濃度升高可激活Nrf2，促進其誘導的抗氧化酶的表達[13-15]。有研究報道，運動除了引起ROS水平升高外，還可引起活性氮（RNS）[16]、一氧化氮（NO）[17]、促炎性物質[18-20]等濃度的升高，同時研究發(fā)現(xiàn)這些物質也可激活Nrf2[17，21-23]，進而參與抗氧化反應。在我們研究中發(fā)現(xiàn)，一次有氧運動3小時后小鼠骨骼肌ROS水平略有升高，但無統(tǒng)計學意義，這可能與我們選擇的一次有氧運動的運動強度不高有關。但在該強度下運動6小時后小鼠骨骼肌ROS水平出現(xiàn)顯著升高，說明運動持續(xù)時間的延長，增加了骨骼肌ROS的產(chǎn)生。

運動產(chǎn)生的ROS可促進原安靜狀態(tài)下細胞漿中的Nrf2/Keapl復合物產(chǎn)生解偶聯(lián)作用，生成游離的Nrf2和Keap1[4，13]。已有動物實驗表明，持續(xù)1小時以下的跑臺運動，對Nrf2 mRNA和蛋白表達無顯著影響[11，24，25]。我們前期的研究也發(fā)現(xiàn)1小時跑臺跑運動后Nrf2-ARE結合活性和Nrf2蛋白表達未出現(xiàn)顯著性變化[11]。因此，在本研究未對小鼠實施1小時一次有氧運動的觀察。在我們的實驗中一次有氧運動3小時和6小時后發(fā)現(xiàn)，與安靜對照組（0 h）相比，小鼠骨骼肌的Nrf2/Ke?ap1結合量均出現(xiàn)顯著降低，游離Nrf2總蛋白表達顯著增加。說明運動應激促進Nrf2/Keapl的解綁作用，除了ROS的激活作用外，可能還有其他物質如RNS等的參與[10，16]，但這仍需要進一步研究證實。

3.2 不同時間一次有氧運動對小鼠骨骼肌Keap 1總蛋白表達的影響

在細胞漿中Nrf2與Keapl發(fā)生解偶聯(lián)作用，使游離Nrf2蛋白表達增多的同時，游離Keapl的量也會發(fā)生變化[11，26-28]。但在我們研究中卻發(fā)現(xiàn)，3小時和6小時的不同時間一次有氧運動后小鼠骨骼肌的游離Keap1蛋白表達并無顯著性變化。推測這可能與Baird提出的Ke?ap1與Nrf2的相互作用遵循“開放”和“閉合”不同構象的循環(huán)方式有關[29]?！伴_放”構象即為一個Nrf2分子結合一個Keap1分子，而“閉合”構象則為一個Nrf2分子與一個Keap1二聚體結合（兩個Keap1分子）。當機體受到氧化應激刺激時，處于安靜“開放”構象狀態(tài)的分子可被誘導呈現(xiàn)為“閉合”狀態(tài)，從“開放”構象解綁釋放出的Keap1分子又可重新結合到“閉合”構象，而游離Keap1的分子數(shù)量基本沒有發(fā)生變化[29]。另外，在我們之前的研究中也發(fā)現(xiàn)，四周間歇低氧和低氧訓練可改變骨骼肌游離Nrf2的總蛋白表達量，但同時對游離Keap1蛋白表達無影響[30]。

3.3 不同時間一次有氧運動對小鼠骨骼肌Nrf 2轉位入核的影響

通常，轉錄因子激活后，需從細胞漿中轉移進入細胞核，識別與結合靶基因啟動子上的順式作用元件（一段DNA序列），進而啟動和調控下游基因的mRNA表達。因此，Nrf2作為轉錄因子，也需進入細胞核與其靶基因上的ARE結合，從而發(fā)揮Nrf2的抗氧化轉錄活性[4]。在我們的研究中發(fā)現(xiàn)，小鼠一次有氧運動3小時和6小時后，雖然骨骼肌Nrf2總蛋白表達均顯著增加，但其骨骼肌Nrf2核蛋白表達僅在6小時后顯著升高，而3h組無顯著變化。這說明Nrf2從細胞漿轉移入核可能需要一定時間，會有一個延遲效應。但這仍需要進一步的實驗驗證。

4 結論

3小時和6小時的一次有氧運動可降低小鼠骨骼肌Nrf2與Keap1的結合作用，增加游離Nrf2總蛋白表達，且6小時的有氧運動促進Nrf2的轉位入核。說明一次有氧運動對小鼠骨骼肌Nrf2與Keap1解綁和Nrf2轉位入核的影響與運動時間的長短有關。