運(yùn)動(dòng)對成長期骨骼肌神經(jīng)源性誘導(dǎo)因子Agrin及其受體MuSK表達(dá)的影響

安楠

國家體育總局運(yùn)動(dòng)醫(yī)學(xué)研究所（北京 100061）

神經(jīng)肌肉連接（neuromuscular junction，NMJ）是完成神經(jīng)肌肉間信號傳遞、實(shí)現(xiàn)運(yùn)動(dòng)功能的關(guān)鍵結(jié)構(gòu)。研究發(fā)現(xiàn)，NMJ的發(fā)育從胚胎期開始，在出生后的一段時(shí)間內(nèi)完成結(jié)構(gòu)和功能的成熟。迄今為止，Agrin-MuSK信號通路是已知最清晰的誘導(dǎo)NMJ發(fā)育的信號途徑。Agrin即集聚蛋白，1990年McMahan提出位于NMJ間隙的神經(jīng)源性因子Agrin對誘導(dǎo)NMJ分化、促進(jìn)n型乙酰膽堿受體（n-AchR）聚集和穩(wěn)定起重要作用。Agrin在腦組織、運(yùn)動(dòng)神經(jīng)元、肌纖維和Schwann細(xì)胞中都有表達(dá)，但僅神經(jīng)元表達(dá)的異構(gòu)體具有高度特異的nAchR聚集活性[1]。Agrin經(jīng)運(yùn)動(dòng)神經(jīng)元軸突釋放后結(jié)合于肌細(xì)胞膜，在此與其受體結(jié)合，可以使n-AchR亞基酪氨酸發(fā)生磷酸化，這可能是誘導(dǎo)n-AchR聚集的關(guān)鍵[2]。肌特異性受體酪氨酸激酶（muscle sPecific ki?nase，MuSK）則是一種跨膜n-AchR耦聯(lián)酪氨酸激酶，選擇性地由發(fā)育中的骨骼肌細(xì)胞表達(dá)并聚集在突觸后膜上，1995年由Valenzuela等分離。MuSK能被Agrin快速磷酸化，研究已證實(shí)它是Agrin受體復(fù)合物的重要組成成分[3]。只有當(dāng)MuSK被Agrin激活后，才啟動(dòng)細(xì)胞內(nèi)信號級聯(lián)反應(yīng)，導(dǎo)致一系列蛋白磷酸化，促使 n-AchR發(fā)生聚集，這一過程受正反饋調(diào)節(jié)[4]。

Agrin和MuSK對NMJ的發(fā)育和運(yùn)動(dòng)功能成熟起重要作用。研究表明，上述過程是在運(yùn)動(dòng)因素的誘導(dǎo)下，由神經(jīng)元和肌細(xì)胞同時(shí)釋放因子，交互信號，共同誘導(dǎo)完成的[5]。已知運(yùn)動(dòng)可以促使NMJ形態(tài)增大、結(jié)構(gòu)成分增多、突觸傳遞功能增強(qiáng)，以適應(yīng)運(yùn)動(dòng)負(fù)荷增加的需要[6]；另一方面，肌肉廢用后 NMJ也出現(xiàn)形態(tài)、結(jié)構(gòu)和功能上的退化，機(jī)制尚不清楚[7]。關(guān)于NMJ發(fā)育和成熟的機(jī)制一直是國內(nèi)外神經(jīng)科學(xué)研究的熱點(diǎn)，研究大部分集中在有關(guān)信號轉(zhuǎn)導(dǎo)的分子機(jī)制方面[8]，而對NMJ在出生后早期的發(fā)育規(guī)律以及運(yùn)動(dòng)因素的調(diào)控作用關(guān)注不多。本研究從體育科學(xué)的角度出發(fā)，研究Agrin及MuSK在成長期的表達(dá)規(guī)律及其在運(yùn)動(dòng)干預(yù)下的變化，可以有助于解釋NMJ的發(fā)育過程及運(yùn)動(dòng)促進(jìn)NMJ發(fā)育的機(jī)制，對于早期發(fā)展運(yùn)動(dòng)能力有一定的理論和實(shí)踐指導(dǎo)意義。

1 對象和方法

1.1 研究對象

出生18天的Sprague-Dawley（SD）雄性大鼠130只，體重50.1±6.9 g，購自中國人民解放軍軍事醫(yī)學(xué)科學(xué)院實(shí)驗(yàn)動(dòng)物中心，動(dòng)物生產(chǎn)許可證號：SCXK（軍）2009-018，大鼠飼養(yǎng)和取材均在國家體育總局體育科學(xué)研究所SPF級動(dòng)物實(shí)驗(yàn)中心進(jìn)行，動(dòng)物使用許可證號：SYXK（京）2011-030。

實(shí)驗(yàn)大鼠隨機(jī)分為對照組、運(yùn)動(dòng)組和懸吊組，其中對照組50只，運(yùn)動(dòng)組和懸吊組各40只。對照組常規(guī)飼養(yǎng)，3周齡時(shí)取材10只。運(yùn)動(dòng)組進(jìn)行跑臺(tái)運(yùn)動(dòng)，運(yùn)動(dòng)負(fù)荷從8 m/min、20 min/d開始，運(yùn)動(dòng)強(qiáng)度和運(yùn)動(dòng)時(shí)間交替增加，至8周齡時(shí)達(dá)42 m/min、60 min/d，每天運(yùn)動(dòng)1次，每周運(yùn)動(dòng)6天。懸吊組采用尾部懸吊造成后肢懸空去負(fù)荷，設(shè)置懸吊組的目的是為了減少大鼠日常活動(dòng)對神經(jīng)肌肉系統(tǒng)的運(yùn)動(dòng)刺激。各組在飼養(yǎng)至4周齡、5周齡、6周齡、8周齡時(shí)分別取材10只，按0.3 ml/100 g體重劑量腹腔注射10%水合三氯乙醛溶液麻醉，迅速分離出腓腸肌于預(yù)冷的生理鹽水中漂洗，濾紙吸干，置液氮速凍待測。

1.2 研究方法

應(yīng)用熒光定量PCR法（RT-PCR）測定Agrin及其受體MuSK轉(zhuǎn)錄水平；酶聯(lián)免疫吸附法（ELISA）測定MuSK蛋白水平。

1.2.1 RT-PCRT

所有引物均先由GNEBANK查詢mRNA序列，用Primer軟件進(jìn)行引物設(shè)計(jì)，上海生工生物工程有限公司合成（見表1）。

表1 Agrin和MuSK引物序列

提取組織RNA：取腓腸肌組織0.1g，迅速加入液氮研磨至粉末狀；加入1 mlMylab通用型RNA快速提取試劑充分混合，室溫放置成溶液，加入50 μl無RNase水，溶解RNA。加氯仿0.25 ml，13000 rpm離心5 min，取上清750 μl，加等體積異丙醇－20℃沉淀核酸，離心取沉淀，75%乙醇洗滌，加DEPC水溶解。用DN?ase I消化樣品RNA中的DNA（見表2），電泳可見5S、18S、28S的清晰條帶。

表2 DNA消化步驟

反轉(zhuǎn)錄（25 μl反應(yīng)體系）：取RNA樣品3 μg，加Oligo Dt T18（50M）2.5 μl，加 DEPC 水至 25 μl，混勻。70℃ 5 min，立即冰浴，然后在反應(yīng)體系中依次加入 5×buffer 8 μl，dNTP（10 mM）4 μl，RNase Inhibitor（MBI）1 μl，混勻，37℃ 5 min；再加入M-MuLV（MBI）2 μl，于42℃ 60 min，70℃ 10 min。

PCR檢測：向PCR管中分別加入不含染料2′qP?CR TaqMix 12.5 μl，10 μM 各基因正反向引物混合物0.5 μl，對應(yīng)的cDNA各1 μl，其中一管不加模板用作陰性對照，各管補(bǔ)加水至25 μl?；靹颍糜赟LAN熒光定量PCR儀中。95℃ 5 min，55℃ 15 s，65℃ 35 s（熒光檢測），40循環(huán)，獲得擴(kuò)增曲線。將實(shí)驗(yàn)數(shù)據(jù)代入公式計(jì)算2-△△Ct值進(jìn)行相對定量計(jì)算。

1.2.2 酶聯(lián)免疫吸附法（ELISA）

稱取一定重量的腓腸肌組織，加入液氮研磨成粉末，加入對應(yīng)體積的0.1 MPBS制成10%組織勻漿，二次凍融破膜，混勻，5000 rpm離心5 min，取上清液。按產(chǎn)品說明6次倍比稀釋標(biāo)準(zhǔn)品，取標(biāo)準(zhǔn)品及待測樣品各100 μl，加入酶標(biāo)孔底部，混勻，覆膜，37℃ 120 min；棄去液體，每孔加檢測溶液 A100 μl，37℃ 60 min；棄去液體，洗板2 min×3次，每孔加檢測溶液B100 μl，37℃ 60 min；棄去液體，洗板2 min×5次；每孔加底物溶液90 μl，37℃避光30 min，每孔加入終止液50 μl，終止反應(yīng)；立即在酶標(biāo)儀上450 nm波長讀取各孔OD值。

1.3 主要儀器和試劑

Takara TP600型梯度PCR儀（日本）；SLAN雙通道熒光定量PCR儀（上海）；JY-SP-B型電泳槽（北京）；JY02S型凝膠紫外分析儀（北京）；Mylab通用型RNA快速提取試劑盒（美萊博醫(yī)學(xué)科技有限公司，中國）；MMuLV反轉(zhuǎn)錄酶：200μ/μl，F(xiàn)ermentas（MBI公司，美國）；RNase Inhibitor：40μ/μl，F(xiàn)ermentas（MBI公司，美國）。大鼠組織MuSK試劑盒（UCL.co美國）；酶標(biāo)儀（北京）。

1.4 數(shù)據(jù)處理

所得實(shí)驗(yàn)數(shù)據(jù)以均數(shù)±標(biāo)準(zhǔn)差（±s）表示；用SPSS16.0統(tǒng)計(jì)軟件進(jìn)行Multivariate Analysis檢驗(yàn)周齡和運(yùn)動(dòng)因素對指標(biāo)影響的顯著性，0ne-way ANOVA比較均值差異顯著性，顯著性水平取P＜0.05，非常顯著性水平取P＜0.01。

2 結(jié)果

2.1 成長期及運(yùn)動(dòng)干預(yù)下大鼠腓腸肌Agrin及MuSK mRNA相對表達(dá)量

表3顯示，周齡因素和運(yùn)動(dòng)干預(yù)對Agrin mRNA表達(dá)水平均有顯著影響（P＜0.01）。正常發(fā)育下，Agrin mRNA在4周齡組較3周齡組表達(dá)減少（P＜0.01），5周齡再次出現(xiàn)表達(dá)高峰（P＜0.01），之后降低（P＜0.01），至8周齡時(shí)未檢測到表達(dá)；運(yùn)動(dòng)干預(yù)下，運(yùn)動(dòng)組和懸吊組5～8周齡的Agrin mRNA表達(dá)水平呈現(xiàn)均高于對照組的趨勢（P＜0.01）。

表3 成長期及運(yùn)動(dòng)干預(yù)下大鼠腓腸肌Agrin mRNA相對表達(dá)量（n=8）

表4顯示，周齡因素和運(yùn)動(dòng)干預(yù)對MuSK mRNA表達(dá)水平均有顯著影響（P＜0.01）。正常發(fā)育下，MuSK mRNA在4周齡時(shí)表達(dá)水平顯著低于3周齡組（P＜0.01），5周齡時(shí)未檢測到表達(dá)，6周齡以后再次出現(xiàn)表達(dá)增多（P＜0.01），且持續(xù)到8周齡（P＜0.05）；運(yùn)動(dòng)干預(yù)下，運(yùn)動(dòng)組MuSK mRNA表達(dá)水平在5周齡時(shí)顯著高于對照組（P＜0.01），其他周齡組與對照組無顯著差異；懸吊組MuSK mRNA表達(dá)水平在各周齡組均顯著低于同齡對照組（6周齡P＜0.05；4周齡、8周齡均P＜0.01）。

表4 成長期及運(yùn)動(dòng)干預(yù)下大鼠腓腸肌MuSK mRNA相對表達(dá)量（n=8）

2.2 成長期及運(yùn)動(dòng)干預(yù)下大鼠腓腸肌MuSK蛋白水平

表5 顯示，MuSK蛋白水平與其mRNA水平變化規(guī)律基本一致；在運(yùn)動(dòng)干預(yù)下，各周齡運(yùn)動(dòng)組MuSK蛋白水平均顯著高于對照組（5周齡、6周齡、8周齡均P＜0.05）；懸吊組MuSK蛋白水平則在各周齡組均呈現(xiàn)出低于同齡對照組的趨勢（4周齡P＜0.05）。

表5 成長期及運(yùn)動(dòng)干預(yù)下大鼠腓腸肌MuSK蛋白水平（n=8，U/L）

3 討論

本研究發(fā)現(xiàn)神經(jīng)源性誘導(dǎo)因子Agrin及其受體MuSK在成長期骨骼肌的表達(dá)具有一定的時(shí)間規(guī)律：Agrin mRNA在出生4周齡較3周齡表達(dá)水平顯著下降（P＜0.01），MuSK作為其受體，在出生4周后mRNA表達(dá)水平下降（P＜0.01），根據(jù)以往文獻(xiàn)，推測Agrin在大鼠出生后3周齡（離乳）以前具有一次表達(dá)高峰。Agrin廣泛存在于中樞和外周神經(jīng)系統(tǒng)，對各類神經(jīng)組織的分化成熟均具有重要作用，已證明Agrin在其他神經(jīng)組織中的表達(dá)具有一定的時(shí)間規(guī)律性，并且這種規(guī)律與該神經(jīng)組織的功能發(fā)育進(jìn)程密切相關(guān)。有研究觀察Agrin在成長期大鼠大腦皮層中的表達(dá)，發(fā)現(xiàn)Agrin在發(fā)育的不同時(shí)期表達(dá)程度不同，總體表現(xiàn)為，Agrin在出生時(shí)表達(dá)很低，隨后迅速上升，出生第1周時(shí)達(dá)高峰，以后隨著發(fā)育的成熟Agrin表達(dá)逐漸降低，4周齡時(shí)大腦皮層中Agrin的表達(dá)接近于成年水平[4]。從NMJ發(fā)育的時(shí)間進(jìn)程分析，運(yùn)動(dòng)神經(jīng)源性Agrin的最早表達(dá)時(shí)間應(yīng)該與胚胎期n-AchR（N型乙酰膽堿受體）的表達(dá)時(shí)間平行，即當(dāng)神經(jīng)末梢生長接觸到肌纖維表面時(shí)，Agrin與MuSK結(jié)合，開始誘導(dǎo)肌纖維膜上廣泛表達(dá)的n-AchR聚集，功能性突觸連接在數(shù)分鐘或數(shù)小時(shí)中建立，Agrin在這一時(shí)期的表達(dá)水平最高，隨著n-AchR的聚集完成，Agrin表達(dá)水平開始下降，這一過程一直延續(xù)到出生以后[4]。由于NMJ主要在大鼠出生后3～4周內(nèi)完成nAchR亞基向成熟型和多神經(jīng)支配向單神經(jīng)支配轉(zhuǎn)換的重要過程，因此可以推論出生后至3周齡（離乳）是NMJ成熟的第一個(gè)重要階段，Agrin及其受體MuSK在這個(gè)階段出現(xiàn)表達(dá)高峰以配合這個(gè)過程。

本研究還發(fā)現(xiàn)，Agrin及其受體MuSK在大鼠5周齡后再次出現(xiàn)顯著的表達(dá)高峰，分析顯示這個(gè)峰值與周齡因素非常顯著相關(guān)（P＜0.01）。大鼠5周齡相當(dāng)于青春期階段，已知n-AchR胚胎型γ-亞基在5周齡后的表達(dá)也有顯著增加[9]，Agrin在同一時(shí)期的表達(dá)增高可能與誘導(dǎo)γ-n-AchR表達(dá)增多有關(guān)，這個(gè)過程是與運(yùn)動(dòng)功能的增強(qiáng)相適應(yīng)的。Agrin作為誘導(dǎo)n-AchR排列和聚集的重要因子，可能誘導(dǎo)NMJ在青春期進(jìn)一步發(fā)育成熟。NMJ在青春期出現(xiàn)的發(fā)育高峰以神經(jīng)肌肉功能完善為主要過程，而結(jié)構(gòu)成分增長并不顯著，提示Agrin及其受體MuSK在此階段的表達(dá)增加可能更多地引起輔助蛋白合成的增加，通過提高NMJ結(jié)構(gòu)成分的排列密度，使運(yùn)動(dòng)終板上n-AchR的分布更加集中，從而適應(yīng)青春期逐漸過渡到成年期的運(yùn)動(dòng)需要。關(guān)于這一點(diǎn)還需要更多實(shí)驗(yàn)證據(jù)的支持。

關(guān)于運(yùn)動(dòng)干預(yù)對Agrin和MuSK表達(dá)的影響，本研究發(fā)現(xiàn)運(yùn)動(dòng)的增多和減少都可以促進(jìn)Agrin更多地表達(dá)（P＜0.01）；但對于MuSK，只有運(yùn)動(dòng)訓(xùn)練可以促使其表達(dá)增加，抑制運(yùn)動(dòng)則會(huì)減少其表達(dá)。運(yùn)動(dòng)和懸吊作為運(yùn)動(dòng)刺激增強(qiáng)和減弱的兩個(gè)相反的方面，對NMJ神經(jīng)肌肉信號傳遞具有一定的調(diào)節(jié)作用。在NMJ功能發(fā)育的敏感期，運(yùn)動(dòng)需求的改變能夠迅速通過某種途徑將功能調(diào)整的信號傳遞到NMJ，進(jìn)而通過神經(jīng)肌肉之間的信號交換，引起突觸前、后成分的改變。一些由神經(jīng)和肌肉釋放的營養(yǎng)因子參與了這個(gè)過程，結(jié)果使NMJ結(jié)構(gòu)排列更加密集，從而提高神經(jīng)肌肉信號傳遞的效率。由于NMJ在發(fā)育成熟后其結(jié)構(gòu)成分的代謝率并不很高，提示成年后NMJ對運(yùn)動(dòng)負(fù)荷的適應(yīng)主要是通過電生理特性的改變實(shí)現(xiàn)的[10]。懸吊是神經(jīng)肌肉活動(dòng)減弱的過程，本研究中在運(yùn)動(dòng)減弱的情況下Agrin的表達(dá)也升高，這可能是機(jī)體為保持NMJ的結(jié)構(gòu)完整通過維持或提高自發(fā)性神經(jīng)肌肉沖動(dòng)而出現(xiàn)的一種代償反應(yīng)。結(jié)合MuSK的蛋白水平變化表明，減少運(yùn)動(dòng)時(shí)雖然機(jī)體試圖代償，但仍然會(huì)引起Agrin受體蛋白水平的降低，從而降低NMJ功能；同時(shí)也從相反的角度說明，日?；顒?dòng)作為一種運(yùn)動(dòng)刺激，同樣可以起到維持神經(jīng)肌肉功能的作用，但顯然運(yùn)動(dòng)訓(xùn)練的效果更為顯著。

MuSK作為肌細(xì)胞膜上NMJ發(fā)育調(diào)節(jié)因子復(fù)合物的重要成分，其蛋白水平可以在一定程度上反映NMJ發(fā)育調(diào)控的程度。已知MuSK具有常規(guī)的受體絡(luò)氨酸激酶（RTK）特征，即含有1個(gè)信號肽，一個(gè)大的胞外域，1個(gè)跨膜域和1個(gè)胞漿域，其胞外域常常含有9個(gè)或10個(gè)氨基酸的插入，可能是由于MuSK mRNA被選擇剪輯而形成，這一胞外域結(jié)構(gòu)將與Agrin反應(yīng)，使MuSK被快速磷酸化，從而介導(dǎo)nAchR的聚集[2]。近年來的研究不斷提出，MuSK對于肌纖維運(yùn)動(dòng)終板的發(fā)育影響更大，MuSK基因缺失鼠的肌細(xì)胞幾乎喪失所有突觸后分化的特征，n-AchR等蛋白成分不再聚集在NMJ處，而是均勻地分布在肌細(xì)胞表面，幾乎完全看不到n-AchR的聚集現(xiàn)象，提示肌細(xì)胞膜上的MuSK是比Agrin更關(guān)鍵的因子。從本研究測定的MuSK蛋白水平看，其隨周齡的變化基本與mRNA水平的變化趨勢一致，且運(yùn)動(dòng)組MuSK蛋白水平在各周齡組均顯著高于對照組（P＜0.01），說明運(yùn)動(dòng)刺激能夠通過某種途徑影響MuSK的蛋白水平。在MuSK轉(zhuǎn)錄以后，運(yùn)動(dòng)刺激可能作為外因引起MuSK發(fā)生重要的蛋白結(jié)構(gòu)轉(zhuǎn)換過程，將Agrin對NMJ發(fā)育的誘導(dǎo)信號向下傳遞。也就是說，MuSK的最終作用不僅受其轉(zhuǎn)錄水平影響，更與功能調(diào)節(jié)及修飾后的蛋白水平有關(guān)，運(yùn)動(dòng)則可能是這個(gè)過程的主要決定因素，Ca2+和鈣調(diào)蛋白（Calmodulin，CaM）也可能參與了這個(gè)過程[11，12]。有研究顯示，低密度脂蛋白受體相關(guān)蛋白（Low Density Lipoprotein Receptor-related Pro?tein，LRP）可能表達(dá)在運(yùn)動(dòng)神經(jīng)元上，作為Agrin的直接受體參與調(diào)控[13]，有學(xué)者提出Agrin-LRP4-MuSK是以兩分子四聚體的“8字環(huán)”形式存在，起到信息交互作用[14]。LRP4可能通過結(jié)合Agrin并激活MuSK，既促進(jìn)Agrin的簇集作用，又與MuSK結(jié)合成復(fù)合物做為突觸前分化的退行性信號，發(fā)揮雙向作用調(diào)節(jié)NMJ形成[15]；后續(xù)在肌無力患者體內(nèi)陸續(xù)檢出抗LRP4抗體也進(jìn)一步證明了這一論點(diǎn)[16，17]；LRP4在Agrin及MuSK受體復(fù)合物中可能起核心作用[18]；載脂蛋白E（ApoE）作為大多數(shù)LRP4的配體，也可能在LRP4調(diào)控神經(jīng)組織發(fā)育中發(fā)揮作用[19，20]。關(guān)于運(yùn)動(dòng)干預(yù)下Agrin及其受體MuSK究竟如何受LRP4的調(diào)節(jié)，以及是否通過Ca2+CaM及ApoE作用，尚需更深入的實(shí)驗(yàn)證據(jù)支持。

4 結(jié)論

綜上所述，成長期骨骼肌Agrin及其受體MuSK的表達(dá)具有一定的時(shí)間規(guī)律，在大鼠出生3～4周（離乳）呈現(xiàn)減少趨勢，至5～6周（青春期）前后再次出現(xiàn)表達(dá)高峰，MuSK蛋白水平表現(xiàn)相應(yīng)的變化；在此期間進(jìn)行適當(dāng)負(fù)荷的運(yùn)動(dòng)訓(xùn)練可以促使Agrin及其受體MuSK更多地表達(dá)，特別能使肌纖維膜上MuSK蛋白水平升高，這可能作為一種機(jī)制，促進(jìn)NMJ在成長期的發(fā)育，具體調(diào)控過程有待進(jìn)一步研究。