張雨慧 黃萍 林靜 趙今
·牙周病學(xué)專欄·
白細(xì)胞介素-10基因型與墨玉縣維吾爾族成人慢性牙周炎易患性的相關(guān)性研究
張雨慧 黃萍 林靜 趙今
新疆醫(yī)科大學(xué)第一附屬醫(yī)院牙體牙髓病科,烏魯木齊 830054
目的 探討白細(xì)胞介素-10(IL-10)基因-597(C/A)位點單核苷酸多態(tài)性與新疆維吾爾自治區(qū)墨玉縣維吾爾族成人慢性牙周炎(CP)之間的相關(guān)性。方法 隨機選取2013年4—5月本課題組對新疆墨玉縣維吾爾族成人進行的口腔健康流行病學(xué)調(diào)查資料及采集的頰黏膜拭子樣本共300例,根據(jù)納入排除標(biāo)準(zhǔn)將其分為健康對照組、輕度CP組和中重度CP組,每組各100例。采用四引物等位基因特異性聚合酶鏈反應(yīng)擴增法檢測受試者IL-10-597位點基因型和等位基因的分布。采用卡方檢驗、有序多分類Logistic回歸等方法進行統(tǒng)計學(xué)分析。結(jié)果 IL-10-597基因型及等位基因頻率在健康對照組、輕度CP、中重度CP組分布的差異均無統(tǒng)計學(xué)意義(P>0.05);抽取樣本人群的年齡與CP具有相關(guān)性,55~65歲人群患CP的風(fēng)險是低于35歲人群的25倍(OR=25.56,P<0.001)。結(jié)論 IL-10-597(C/A)位點單核苷酸多態(tài)性與維吾爾族成人CP的發(fā)病風(fēng)險無明顯相關(guān)性。
白細(xì)胞介素-10; 慢性牙周炎; 單核苷酸多態(tài)性
牙周組織健康狀態(tài)的維持需調(diào)節(jié)促炎因子和抗菌因子的活性達到最佳平衡狀態(tài),以控制炎癥防止感染[1]。一旦這種平衡狀態(tài)被破壞,就會出現(xiàn)牙周組織病變。牙周病變進程與一系列炎癥介質(zhì)和細(xì)胞因子密切相關(guān)。與牙周支持組織破壞有關(guān)的炎癥介質(zhì),包括白細(xì)胞介素(interleukin,IL)-1β、IL-8和腫瘤壞死因子-α(tumor necrosis factor-α,TNF-α)等等,這些促炎因子和抗炎因子一起組成了復(fù)雜的信號網(wǎng)絡(luò),最終導(dǎo)致牙周附著喪失。IL-10是一種抗炎細(xì)胞因子,在控制炎癥以及防止細(xì)菌、病毒感染引起的組織損傷和炎癥反應(yīng)中起重要作用[2]。研究[3]顯示,細(xì)胞因子基因多態(tài)性可以影響個體細(xì)胞因子的產(chǎn)生水平和反應(yīng)強度。Yamazaki等[4]發(fā)現(xiàn),IL-10 mRNA在牙周炎病損區(qū)的表達呈正向調(diào)節(jié),重度牙周炎患者的外周血T細(xì)胞表達的IL-10 mRNA明顯高于正常對照組。由此推測IL-10基因多態(tài)性可能影響IL-10 mRNA的表達,并且能與牙周炎的炎癥反應(yīng)程度相關(guān)。研究[5]發(fā)現(xiàn),IL-10 基因啟動子區(qū)-1082G/A(-1087)、-819C/T(-824)和-592C/A(-597)3個位點的單核苷酸多態(tài)性(single nucleotide polymorphisms,SNP)與IL-10基因的轉(zhuǎn)錄活性及血漿中IL-10的表達水平有關(guān)。目前,在不同人群的不同研究中,對上述3個位點SNP與牙周炎相關(guān)性報道結(jié)果并不一致。本研究選擇新疆維吾爾自治區(qū)墨玉縣維吾爾族成人慢性牙周炎(chronic periodontitis,CP)患者為研究對象,探討IL-10基因SNP與CP的相關(guān)性。
墨玉縣位于新疆維吾爾自治區(qū)塔克拉瑪干沙漠南緣,是典型的封閉的維吾爾族農(nóng)村人口聚集區(qū),擁有獨特的飲食、風(fēng)俗和地域文化。有研究[6]顯示,墨玉地區(qū)的CP患病率高達65.2%。本課題組在前期研究中探討了雌激素受體[7]、維生素D受體[8]與該地區(qū)成人CP易患性的關(guān)系,本研究利用四引物等位基因特異性聚合酶鏈反應(yīng)(tetra-primer amplification refractory mutation system-polymerase chain reaction,T-ARMS-PCR)擴增法對IL-10-597位點SNP與墨玉縣維吾爾族人群CP易患性的關(guān)系進行研究。
1.1 研究對象的選擇
本課題流行病學(xué)調(diào)查組于2013年4—5月采用分層隨機抽樣方法對墨玉縣維吾爾族成人進行了流行病學(xué)調(diào)查,采集了2 007例維吾爾族成人口腔流行病學(xué)資料,其中1 604例取得口腔頰黏膜拭子樣本。本研究隨機抽取前期取得的頰黏膜拭子共300例,根據(jù)調(diào)查時臨床檢查結(jié)果將其分為輕度CP組、中重度CP組和健康對照組,進行資料分析及IL-10-597位點基因型檢測。本研究經(jīng)新疆醫(yī)科大學(xué)第一附屬醫(yī)院倫理委員會批準(zhǔn)(批準(zhǔn)號20141201-08),研究對象均簽署知情同意書。
研究對象納入標(biāo)準(zhǔn)如下。病例組:1)年齡18~65歲;2)3代均為維吾爾族;3)口內(nèi)至少存留10顆牙,其中包括4顆磨牙(不含第三磨牙);4)無明顯的錯畸形及不良修復(fù)體;5)符合CP的診斷,具體診斷標(biāo)準(zhǔn)見1.2。健康對照組:1)年齡18~65歲;2)3代均為維吾爾族;3)牙周健康,參照第三次全國口腔健康流行病學(xué)調(diào)查給出的判斷標(biāo)準(zhǔn)[9],要求口腔內(nèi)無牙齦出血、無牙周袋[探診深度(probing depth,PD)≤3 mm]、無臨床附著喪失(clinical attachment loss,CAL,要求CAL=0 mm),缺失牙不超過3顆。研究對象排除標(biāo)準(zhǔn)如下:1)患有與CP相關(guān)的系統(tǒng)性疾?。ㄌ悄虿?、心血管疾病等);2)婦女處于妊娠期或哺乳期;3)3個月內(nèi)使用過抗生素或免疫抑制劑者;4)半年內(nèi)進行過牙周治療者。
1.2 實驗分組
牙周炎分型參照Muthukumar等[10]和曹采方[11]推薦的標(biāo)準(zhǔn)。在充足的自然光線下,由3名經(jīng)過正規(guī)培訓(xùn)的口腔??迫藛T(可靠性檢驗Kappa=0.97)使用口腔CPI探針和平面口鏡對所有受試者進行牙周健康狀況檢查。按照社區(qū)牙周指數(shù)對所有受試者進行10個牙位(11、16、17、26、27、31、36、37、46、47)共60個位點(近中頰面、頰面、遠(yuǎn)中頰面、近中舌面、舌面、遠(yuǎn)中舌面)的檢查,記錄每一位點的CAL,將所有位點的CAL求和,計算平均附著喪失(average attachment loss,AAL)。AAL≤3 mm為輕度CP,AAL為3~4 mm定義為中度CP,AAL≥5 mm定義為重度CP。本實驗分為3組,分別為健康對照組、輕度CP組和中重度CP組。
1.3 樣本量的確定及抽樣方法
用樣本估算公式nij=(Z1-α/(2T)+Z1-β)2[P1(1-P1)+ P2(1-P2)]/δij2進行樣本量估計。前期流行病學(xué)調(diào)查采集樣本(頰黏膜拭子)共1 604個(輕度CP組890個,中度CP組230個,重度CP組85個,健康對照者399個),利用計算機隨機化抽樣方法在輕度、中重度CP及健康對照者樣本中每組抽取100個樣本,其中中重度CP組按樣本比例抽取,中度73個,重度27個。
1.4 DNA提取和基因分型
采用口腔拭子基因組DNA提取試劑盒[天根生化科技(北京)有限公司]提取DNA,-20 ℃保存。用T-ARMS-PCR法檢測實驗樣本IL-10基因啟動子區(qū)-597(C/A)位點的基因型和等位基因。 引物序列如下。IL-10-597-F inner:5’-GAACACATCCTGTGACCCCGCCTATA-3’,IL-10-597-R inner: 5’-TACTTTCCAGAGACTGGCTTCCTACGGG-3’,IL-10-597-F outer: 5’-GGTCATGGTGAGCACTACCTGACTAGCA-3’,IL-10-597-R outer: 5’-CCAACCT-GGGATGAATACCCAAGACTTC-3’。聚合酶鏈反應(yīng)(polymerase chain reaction,PCR)體系:模板DNA 1 μL;引物各1 μL,共4 μL;Premix 12.5 μL,用無菌去離子水補足總體積至25 μL。PCR反應(yīng)條件:預(yù)變性94 ℃ 2 min,94 ℃ 1 min, 64 ℃退火1 min,72 ℃延伸1 min,35個循環(huán),72 ℃延伸保持2 min。
PCR產(chǎn)物以DNA 50 bp Marker作為相對分子質(zhì)量標(biāo)記物,取5 μL PCR產(chǎn)物經(jīng)2%瓊脂糖凝膠電泳儀電泳30 min,電壓110 V。于凝膠成像儀上分析基因分型。IL-10-597位點等位基因為597C(210 bp)和597A(191 bp)。
1.5 PCR質(zhì)量控制
所有樣本均在盲法下進行測量;實驗中使用同一型號的儀器并定期校驗;使用同一品牌的DNA提取試劑盒及相關(guān)試劑;檢測方法統(tǒng)一,并由同一人檢測。隨機抽取10%樣本即30個樣本,在單盲情況下重復(fù)測定各位點基因型,以檢驗所測基因型的重復(fù)性和可靠性。
1.6 統(tǒng)計分析
采用SPSS 18.0軟件進行統(tǒng)計分析。IL-10-597(C/A)位點基因型和等位基因頻率經(jīng)Hardy-Weinberg遺傳平衡定律檢查樣本是否具有群體代表性?;蝾l率采用直接計數(shù)法統(tǒng)計,各基因型和等位基因頻率組間比較采用卡方檢驗。為控制可能的混雜因素,年齡、性別作為獨立變量在有序多分類Logistic回歸中進行校正。檢驗水準(zhǔn)為雙側(cè)α=0.05。
2.1 臨床資料分析
本實驗共納入300例頰黏膜拭子樣本,每組100例。臨床基本資料如表1所示,性別和年齡在健康對照組與輕度CP組,健康對照組與中重度CP組間的差異均有統(tǒng)計學(xué)意義(P<0.001);PD在健康對照組與輕度CP組,健康對照組與中重度CP組間的差異均有統(tǒng)計學(xué)意義(P<0.001)。
表1 健康對照組與CP組的基本資料Tab 1 Demographic characteristics of chronic periodontitis and control groups
2.2 IL-10-597(C/A)SNP檢測結(jié)果
IL-10-597位點基因型測定電泳圖結(jié)果如圖1所示:雜合子表現(xiàn)為3條帶,分別為外引物擴增控制條帶347 bp,C等位基因條帶210 bp,A等位基因條帶191 bp;純合子表現(xiàn)為兩條帶,即IL-10AA(347 bp和191 bp條帶)和IL-10CC(347 bp和210 bp條帶)。全部樣本中,有299例樣本清晰檢測出基因型,其中輕度CP組有1例樣本未檢出。
2.3 Hardy-Weinberg平衡檢驗
對3組中基因型頻率進行Hardy-Weinberg平衡檢驗,結(jié)果顯示IL-10-597位點基因型分布頻率符合Hardy-Weinberg平衡定律(表2),可以認(rèn)為該人群具有較好的群體代表性(P>0.05)。
圖1 IL-10-597位點SNP的T-ARMS-PCR 電泳圖Fig 1 Agarose gel electrophoresis of IL-10-597 SNP T-ARMS-PCR products
表2 基因型分布的Hardy-Weinberg平衡檢驗Tab 2 Hardy-Weinberg equilibrium test of genotype distribution
2.4 IL-10-597基因型分布及等位基因頻率
IL-10-597基因型及等位基因頻率在健康對照組、輕度CP組、中重度CP組的分布均無統(tǒng)計學(xué)意義(P>0.05,表3)。
表3 基因型與等位基因頻率的分布Tab 3 The distribution of genotype and allele frequency
2.5 CP易患因素的分析
CP的發(fā)病機制是綜合多因素造成的。由表1可知,本實驗納入樣本在年齡和性別上組間差異具有統(tǒng)計學(xué)意義,這在一定程度上會影響統(tǒng)計分析結(jié)果,因此運用有序多分類Logistic回歸分析來評估不同基因型與CP易患性的關(guān)系,通過調(diào)整患者的年齡和性別來控制可能的混雜因素的影響。分析結(jié)果見表4。
表4 CP易患因素的Logistic回歸分析Tab 4 Results of Logistic regression analysis for susceptibility to chronic periodontitis
IL-10-597位點任何一種基因型都不是CP的易患因素;但抽取樣本人群的年齡與CP具有相關(guān)性,55~65歲人群患CP的風(fēng)險是年齡低于35歲人群的25倍(OR=25.56,95%CI為12.29~53.14,P<0.001)。
牙周炎是侵犯牙齦和牙周支持組織的慢性感染性疾病,牙齦組織的炎癥性水腫、出血和牙槽骨吸收是牙周炎典型的病理改變。目前基本一致的觀點認(rèn)為,牙菌斑是牙周炎的始動因子,沒有牙菌斑就沒有牙周炎的發(fā)生。盡管如此,僅有微生物的作用尚不足以引起牙周炎,牙周炎的發(fā)生是多因素綜合作用的結(jié)果,遺傳變異可能是導(dǎo)致個體罹患牙周炎易患性的差異因素之一[12]。有研究[13]發(fā)現(xiàn),在相同的社會背景、經(jīng)濟狀態(tài)和口腔衛(wèi)生條件下,只有8%的人發(fā)生嚴(yán)重的牙周組織破壞,81%的人有輕到中度的牙周組織破壞,11%的人停留在牙齦炎階段而不發(fā)展為牙周炎,這充分說明不同的個體對牙周炎的易患性存在差異。
IL-10作為一種由多種細(xì)胞分泌的抗炎因子,可以調(diào)節(jié)其他炎癥因子分泌,并顯著抑制促炎細(xì)胞因子的釋放和抗原的遞呈,在炎癥進展及免疫調(diào)節(jié)反應(yīng)中具有重要作用[14]。有研究[15]顯示,在牙周炎炎癥牙齦組織和齦溝液中促炎癥細(xì)胞因子IL-1β、TNF-α等表達水平升高,而IL-1β/IL-10的增加與牙周炎嚴(yán)重程度密切相關(guān)。另有研究[16]證實,牙周炎患者經(jīng)過刮治和根面平整等牙周基礎(chǔ)治療后,菌斑等牙周局部刺激因子被去除,牙周局部炎癥反應(yīng)減弱,此時IL-10表達增加,提示IL-10可能參與了牙周修復(fù)過程。另外,Al-Rasheed等[17]報道,IL-10基因敲除小鼠的牙槽骨吸收加速,說明IL-10可以抑制牙槽骨的破骨細(xì)胞性骨吸收。
本實驗抽取樣本的一般情況顯示,年齡和性別在健康對照組和CP組間的差異存在著統(tǒng)計學(xué)意義,這與本課題組前期對該地區(qū)流行病學(xué)調(diào)查的結(jié)果一致[18-19],男性較女性的患病率更高,且隨著年齡增長患病率升高。在進行基因型易患性分析時,年齡和性別會對結(jié)果造成一定的影響,因此本研究運用了有序多分類Logistic回歸分析來評估IL-10-597位點不同基因型與CP易患性的關(guān)系,結(jié)果并未顯示出IL-10-597位點與墨玉縣維吾爾族成人輕、中重度CP易患性存在相關(guān)性。對于不同國家、不同地區(qū)人群,IL-10-597 SNP與CP相關(guān)性研究結(jié)果不一致。本研究結(jié)果與唐燕等[20]對四川地區(qū)漢族人群重度CP患者進行的研究,Gonzales等[16]對德國人群侵襲性牙周炎和CP的遺傳相關(guān)性的研究,Yamazaki等[4]對日本人群早發(fā)性牙周炎、侵襲性牙周炎和CP之間相關(guān)性研究的結(jié)果一致,均未發(fā)現(xiàn)IL-10-597基因與CP之間的相關(guān)性。另有部分研究結(jié)果則顯示出IL-10-597與CP具有相關(guān)性。Jaradat等[21]對約旦人群與CP、局限性侵襲性牙周炎相關(guān)性的研究結(jié)果顯示,CA、AA基因型可能是CP的易患因素。Scarel-Caminaga等[22]對巴西人與CP的遺傳相關(guān)性研究結(jié)果顯示,等位基因頻率在CP組和健康對照組間差異有統(tǒng)計學(xué)意義。Sumer等[23]對土耳其人與重度CP患者遺傳相關(guān)性研究顯示,在忽略樣本量局限性的條件下,IL-10-597位點可能與重度CP易患性相關(guān)。Hu等[24]對中國臺灣地區(qū)人群CP和侵襲性牙周炎的遺傳相關(guān)性研究顯示,IL-10-597位點的基因型頻率在CP和健康對照組明顯不同,差異有統(tǒng)計學(xué)意義。
筆者分析造成上述結(jié)果可能的原因是:1)各研究是在不同國家、不同地區(qū)進行的,人群中基因型的分布存在種族和地域的差別;2)實驗設(shè)計和分析方法不同;3)樣本量大小不同,這些因素都會對結(jié)果產(chǎn)生影響。此外,牙周炎是多因素共同作用的疾病,不能單獨考慮基因與疾病易患性之間的關(guān)系,應(yīng)將宿主遺傳因素與環(huán)境危險因素聯(lián)合起來進行分析,以探討易患基因與CP的真正聯(lián)系。本實驗只探討了IL-10一個位點的SNP,并未考慮其他細(xì)胞因子SNP的影響,對于SNP與CP之間的關(guān)系,還需要在大范圍人群中綜合多個位點進行更深入的研究。
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(本文編輯 吳愛華)
《國際口腔醫(yī)學(xué)雜志》2018年征訂啟事
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《國際口腔醫(yī)學(xué)雜志》編輯部
Correlation between interleukin-10 polymorphisms and susceptibility to chronic periodontitis among Uygur adults in the Moyu area
Zhang Yuhui, Huang Ping, Lin Jing, Zhao Jin.
(Dept. of Conservative Dentistry and Endodontics, The First Affiliated Hospital of Xinjiang Medical University, Urumqi 830054, China)
Supported by: Natural Science Foundation of Xinjiang Uygur Autonomous Region of China (2014211C065). Correspondence:Zhao Jin, E-mail: merryljin@sina.com.
Objective This study aims to investigate the association between interleukin (IL)-10-597 (C/A) single-nucleotide polymorphisms and chronic periodontitis of Moyu Uygur population in Xinjiang Uygur Autonomous Region of China. Methods In accordance with the inclusion and exclusion criteria, the buccal swabs of 300 subjects were randomly selected from the epidemiological investigation of Uygur adults in Moyu county on April and May 2013. The study was conducted on a healthy control group, a mild chronic periodontitis group, and a moderate-to-severe chronic periodontitis group, with each comprising 100 samples. The IL-10-597(C/A) site in the promoter sequences was analyzed using the tetra-primer amplification refractory mutation system-polymerase chain reaction method to test the genotype and allele distributions. Statistical analysis was performed using Chi-squared test and ordinal classification Logistic regression analysis. Results The genotype and allele frequencies of the IL-10-597(C/A) site in the healthy control group, mild chronic periodontitis group, and moderate-to-severe chronic periodontitis group exhibited no significant difference (P>0.05). The age of all the samples was associated with chronic periodontitis. The risk of chronic periodontitis in the people of 55-65 years old was 25 times in the people under the age of 35 (OR=25.56, P<0.001). Conclusion The IL-10-597 (C/A) single-nucleotide polymorphisms in the gene promoter are not associated with chronic periodontitis in Uygur adult population.
interleukin-10; chronic periodontitis; single nucleotide polymorphisms
R 781.4
A
10.7518/hxkq.2017.05.014
2017-03-05;
2017-06-02
新疆維吾爾自治區(qū)自然科學(xué)基金(2014211C065)
張雨慧,碩士,E-mail:554064748@qq.com
趙今,主任醫(yī)師,博士,E-mail:merryljin@sina.com