明膠海綿復(fù)合生長(zhǎng)因子加速頜骨骨折愈合的實(shí)驗(yàn)研究

唐彥峰 陳建霖 周云彪

明膠海綿復(fù)合生長(zhǎng)因子加速頜骨骨折愈合的實(shí)驗(yàn)研究

唐彥峰1陳建霖2周云彪1

1.包頭市中心醫(yī)院口腔頜面外科，包頭 014040；2.靈武市人民醫(yī)院口腔科，靈武 750400

目的 探索明膠海綿復(fù)合生長(zhǎng)因子緩釋系統(tǒng)加速頜骨骨折愈合的作用和機(jī)制，為臨床加速頜骨骨折愈合提供新的方法。方法 按每100 μg基因重組人骨形態(tài)發(fā)生蛋白（BMP）-2用1 mL重組牛堿性成纖維細(xì)胞生長(zhǎng)因子（bFGF）液完全溶解后，取40 μL滴加到明膠海綿（0.5 cm×0.5 cm×1.0 cm）組織塊中，凍干后制成bFGF/BMP/明膠海綿緩釋系統(tǒng)。在12只新西蘭大白兔兩側(cè)下頜制造線樣骨折，左側(cè)為對(duì)照組，只用鈦板固定；右側(cè)為實(shí)驗(yàn)組，鈦板下放置bFGF/BMP/明膠海綿。術(shù)后2、4、12周行大體觀察、X線檢查、組織學(xué)檢查。結(jié)果 術(shù)后2周，實(shí)驗(yàn)組較對(duì)照組在骨折斷端處可見(jiàn)更多纖維組織長(zhǎng)入；術(shù)后4周，實(shí)驗(yàn)組骨折間隙可見(jiàn)到纖維性骨痂，對(duì)照組可見(jiàn)纖維組織和血管長(zhǎng)入；12周后實(shí)驗(yàn)組和對(duì)照組骨折均已完全愈合。結(jié)論 bFGF/BMP/明膠海綿能加速骨折愈合，提高骨折愈合效果。

頜骨； 骨折愈合； 堿性成纖維細(xì)胞生長(zhǎng)因子； 骨形態(tài)發(fā)生蛋白-2； 明膠海綿

頜面部骨折會(huì)給人的外觀、功能和心理造成重大打擊，嚴(yán)重影響患者正常生活和工作?，F(xiàn)有的骨折治療方法，骨折愈合過(guò)程均需3～6個(gè)月，加速頜面部骨折愈合已成為研究的熱點(diǎn)。隨著骨折愈合機(jī)制研究的深入，發(fā)現(xiàn)生長(zhǎng)因子能加速骨折愈合過(guò)程，但生長(zhǎng)因子局部注射易吸收和降解，難以持久地發(fā)揮加速骨折愈合的作用。隨著生物材料學(xué)的發(fā)展，生長(zhǎng)因子和生物支架材料復(fù)合的緩釋系統(tǒng)應(yīng)運(yùn)而生。這種緩釋系統(tǒng)可在骨折局部緩慢釋放生長(zhǎng)，并使之持久作用[1]。本研究將明膠海綿復(fù)合骨形態(tài)發(fā)生蛋白（bone morphogenetic protein，BMP）/堿性成纖維細(xì)胞生長(zhǎng)因子（basic fibroblast growth factor，bFGF）制成緩釋系統(tǒng)，使其作用于兔下頜骨骨折部位，觀察骨折愈合過(guò)程，以明確其臨床應(yīng)用前景。

1 材料和方法

1.1 材料和設(shè)備

基因重組人BMP-2凍干粉（北京中科物源生物技術(shù)有限公司），重組牛bFGF液（珠海億勝生物制藥有限公司），明膠海綿（金陵藥業(yè)股份有限公司），鈦板（鄭州康德鈦制品科技有限公司），組織學(xué)切片機(jī)（Leica 公司，德國(guó)），光學(xué)顯微鏡（Nikon公司，日本）。

1.2 bFGF/BMP/明膠海綿緩釋系統(tǒng)的制備

在超凈工作臺(tái)內(nèi)按每100 μg BMP-2用1 mL bFGF液完全溶解后，用50 μL移液器移出40 μL，滴加到明膠海綿（0.5 cm×0.5 cm×1.0 cm）組織塊中，置于-70 ℃冷凍干燥機(jī)內(nèi)快速凍干，制成bFGF/BMP/明膠海綿緩釋系統(tǒng)，環(huán)氧乙烷消毒，4 ℃保存?zhèn)溆谩?/p>

1.3 動(dòng)物實(shí)驗(yàn)

健康成年新西蘭大耳白兔，由四川大學(xué)華西醫(yī)學(xué)中心實(shí)驗(yàn)動(dòng)物中心提供， 重2.5～2.7 kg，共12只。按30 mg·kg-1戊巴比妥鈉給予兔耳緣靜脈注射麻醉，在其雙側(cè)下頜制造線樣骨折，并用鈦板固定骨折部位。左側(cè)為對(duì)照組，只用鈦板固定；右側(cè)為實(shí)驗(yàn)組，鈦板下放置bFGF/BMP/明膠海綿。術(shù)后2、4、12周處死動(dòng)物。直接取出雙側(cè)下頜骨，不剝離骨折端處骨膜，4%甲醛固定1周。

1.4 大體觀察

觀察動(dòng)物術(shù)后飲食情況及術(shù)區(qū)創(chuàng)口反應(yīng)；處死動(dòng)物后，肉眼觀察下頜骨骨折部位及周?chē)浗M織的生長(zhǎng)情況。

1.5 X線檢查

對(duì)固定后的雙側(cè)下頜骨行X線攝片，觀察骨折部位的愈合情況。拍攝距離為60 cm，電壓為42 kV，電流100 mA，曝光時(shí)間0.05 s。

1.6 組織學(xué)檢查

將固定后的標(biāo)本放置在30%EDTA中脫鈣2周，中途更換脫鈣液1次，逐級(jí)乙醇脫水，浸蠟，包埋，切片厚度5 μm，進(jìn)行蘇木精-伊紅染色和觀察。

2 結(jié)果

2.1 大體觀察

術(shù)后所有動(dòng)物生命體征平穩(wěn)，體重逐漸增加，術(shù)區(qū)無(wú)紅腫、化膿，手術(shù)創(chuàng)口均為一期愈合，無(wú)1例感染，均存活至預(yù)定取材時(shí)間。

術(shù)后2周，對(duì)照組骨折處可見(jiàn)少量新生軟組織形成，骨折處活動(dòng)度較大；實(shí)驗(yàn)組骨折處可見(jiàn)較多新生軟組織，骨折斷端可活動(dòng)，骨折表面可見(jiàn)軟組織覆蓋。術(shù)后4周，對(duì)照組骨折處可見(jiàn)新生軟組織存在，骨折下緣可見(jiàn)少量的骨痂形成，骨折斷端活動(dòng)度減小；實(shí)驗(yàn)組骨折表面和下緣可見(jiàn)較多骨痂形成，骨折斷端未見(jiàn)明顯骨折動(dòng)度。術(shù)后12周，對(duì)照組骨折處有明顯骨痂，骨折無(wú)動(dòng)度，原骨折線可見(jiàn)線樣凹陷；實(shí)驗(yàn)組骨折已愈合，骨痂明顯，骨折無(wú)動(dòng)度，骨折線已消失。

2.2 X線檢查

X線檢查結(jié)果見(jiàn)圖1。

圖1 2組術(shù)后X線檢查Fig 1 Postoperative X-ray of two groups

術(shù)后2周，2組均可見(jiàn)明顯的骨折線。術(shù)后4周，對(duì)照組骨折斷端下緣模糊，下頜下緣可見(jiàn)有骨痂形成；實(shí)驗(yàn)組骨折斷端邊緣模糊，下頜下緣可見(jiàn)有骨痂形成。術(shù)后12周，2組骨折愈合良好，無(wú)明顯骨折線。

2.3 組織學(xué)檢查

2組術(shù)后組織學(xué)觀察結(jié)果見(jiàn)圖2。術(shù)后2周，對(duì)照組骨折斷端明顯，骨折端可見(jiàn)少量的纖維組織，骨折縫隙內(nèi)未見(jiàn)纖維組織長(zhǎng)入；實(shí)驗(yàn)組骨折斷端處可見(jiàn)大量的纖維組織，未見(jiàn)到破骨細(xì)胞和成骨細(xì)胞存在。術(shù)后4周，對(duì)照組骨折斷端內(nèi)可見(jiàn)大量纖維組織和血管長(zhǎng)入，可見(jiàn)到少量的破骨細(xì)胞和成骨細(xì)胞，骨折兩側(cè)可見(jiàn)骨吸收和成骨活動(dòng)；實(shí)驗(yàn)組骨折邊緣可見(jiàn)少量間斷纖維性骨痂，靠近骨折中心處仍可見(jiàn)纖維組織存在。術(shù)后12周，2組骨折處都已骨性愈合，對(duì)照組骨折間隙處骨小梁排列方向與周?chē)墙M織不同；實(shí)驗(yàn)組骨小梁方向與周?chē)墙M織方向基本一致。

圖2 2組術(shù)后組織學(xué)觀察 蘇木精-伊紅染色 × 100Fig 2 Postoperative histologic observation of two groups hematoxylin-eosin stain × 100

3 討論

隨著社會(huì)的發(fā)展，頜面部骨折呈逐年上升趨勢(shì)。因?yàn)楣钦鄣挠掀谳^長(zhǎng)，嚴(yán)重影響患者的正常生活，所以頜面部骨折的治療成為當(dāng)今研究的熱點(diǎn)問(wèn)題。在骨創(chuàng)傷愈合過(guò)程中，大量骨生長(zhǎng)因子的協(xié)同作用促進(jìn)骨折的愈合。其中，BMP和bFGF在骨形成過(guò)程中起著至關(guān)重要的作用。

BMP與誘導(dǎo)原始細(xì)胞分化為能形成軟骨樣和骨樣組織的細(xì)胞有關(guān)。BMP對(duì)軟骨細(xì)胞和成骨細(xì)胞的生長(zhǎng)、分化和凋亡有著重要的調(diào)節(jié)作用，可促進(jìn)軟骨和骨組織形成[2-3]。研究表明，BMP-2在骨形成、骨重建和骨修復(fù)中起重要作用[4-5]，能刺激骨髓間充質(zhì)干細(xì)胞的分化[6]，并可以通過(guò)增加骨涎蛋白表達(dá)來(lái)促進(jìn)下頜缺損的骨形成[7]。成纖維細(xì)胞生長(zhǎng)因子（fibroblast growth factor，F(xiàn)GF）是關(guān)節(jié)軟骨細(xì)胞最明顯的有絲分裂原，可以促進(jìn)毛細(xì)血管向骨折段長(zhǎng)入，加速軟骨細(xì)胞的增殖、分化、成熟[8-9]。bFGF可以刺激成骨細(xì)胞內(nèi)骨鈣素增加，加快骨的礦化，加快新骨形成。實(shí)驗(yàn)研究表明，F(xiàn)GF-2是骨形成的重要調(diào)節(jié)因子[10]，能加速骨祖細(xì)胞的增殖[11]，用FGF-2治療動(dòng)物腓骨骨折組的骨痂量、成骨細(xì)胞指數(shù)均較對(duì)照組有明顯增加，最大負(fù)荷、最大彎曲強(qiáng)度和最大能量吸收也明顯增加[12]。

明膠海綿是一種無(wú)毒、無(wú)抗原性的蛋白膠類(lèi)物質(zhì)，有良好的可壓縮性、可吸收性和遇水再膨脹性，無(wú)毒副作用，主要用于創(chuàng)面止血。在生產(chǎn)過(guò)程中使用氮?dú)馐蛊涑尸F(xiàn)多孔樣結(jié)構(gòu)，極大地增加了對(duì)藥物的吸收量。另外，明膠可以通過(guò)表面與細(xì)胞的接觸促進(jìn)細(xì)胞的黏附和增殖[13]。明膠海綿在組織中完全吸收需要4～6周?；谶@些原因，明膠海綿可作為緩釋系統(tǒng)的載體。

目前，復(fù)合生長(zhǎng)因子和生物支架材料的緩釋系統(tǒng)在骨折愈合的研究中愈來(lái)愈受到重視。本實(shí)驗(yàn)將明膠海綿復(fù)合BMP/bFGF制成緩釋系統(tǒng)，使其作用于兔下頜骨骨折部位，術(shù)后實(shí)驗(yàn)組和對(duì)照組均未見(jiàn)感染和排異反應(yīng)，可見(jiàn)明膠海綿有較好的生物相容性和臨床應(yīng)用性；通過(guò)與對(duì)照組進(jìn)行大體觀察、X線及組織學(xué)檢查對(duì)比發(fā)現(xiàn)，術(shù)后實(shí)驗(yàn)組較早地有纖維肉芽組織長(zhǎng)入骨折斷端，骨痂形成也明顯早于對(duì)照組。這表明實(shí)驗(yàn)組能明顯加速骨折愈合。其原因是明膠海綿在術(shù)后較長(zhǎng)時(shí)間內(nèi)可通過(guò)緩慢釋放BMP和bFGF，使其在局部持續(xù)維持較長(zhǎng)時(shí)間的藥物濃度；也能在骨折局部起到膜引導(dǎo)骨再生作用，減少局部纖維組織長(zhǎng)入骨折線內(nèi)，避免和減少了影響骨折愈合的不利因素，從而能發(fā)揮出更好的加速骨折愈合作用。

綜上所述，BMP/bFGF/明膠海綿緩釋系統(tǒng)能夠在骨折早期緩慢釋放生長(zhǎng)因子，加速骨折的愈合過(guò)程，且具有較好的生物相容性，因此，BMP/bFGF/明膠海綿緩釋系統(tǒng)在臨床骨折治療中具有較好的應(yīng)用前景。

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（本文編輯 李彩）

Experimental study on accelerated healing of jaw fracture using gelatin sponge compound growth factor

Tang Yanfeng1, Chen Jianlin2, Zhou Yunbiao1.
(1. Dept. of Oral and Maxillofacial Surgery, Baotou Central Hospital, Baotou 014040,China; 2. Dept. of Stomatology, Lingwu People’s Hospital, Lingwu 750400, China)
Supported by: Science and Technology Development Programs of Yinchuan, Ningxia Province (2008061). Correspondence:Zhou Yunbiao, E-mail: 13171208970@163.com.

Objective To explore the role and mechanism of drug delivery systems using growth factor combined with gelatin sponge on accelerating the healing of jaw fracture and to seek better treatment of accelerating the maxillofacial fracture.Methods About 100 μg recombinant human bone morphogenetic protein (BMP)-2 was completely dissolved in 1 mL recombinant bovine basic fibroblast growth factor (bFGF), and the solution (40 μL) was dropped in gelatin sponge (0.5 cm×0.5 cm×1.0 cm). Then, it was freeze dried and prepared into bFGF/BMP/gelatin sponge delivery systems. The mandibular fracture model on two sides were prepared in 12 New Zealand rabbits and randomly divided into two groups. The left side was the control group, which was only fixed with titanium plates. The right side was the experimental group, in which bFGF/BMP/gelatin sponge delivery systems were put under the titanium plates. General observation, X-ray, and histological examination were taken at 2, 4, and 12 weeks after surgery. Results After 2 weeks, more fibrous tissues were seen between the fracture ends in the experimental group than in the control group. After 4 weeks, fibrous fracture callus were seen in the fracture gap in the experimental group. The ingrowths of fibrous tissue and blood vessels were seen in the control group. The fracture healing of the experimental group was significantly faster than the control group at 2 and 4 weeks. After 12 weeks, the experimental and control groups all healed completely. Conclusion bFGF/BMP/gelatin sponge can accelerate and improve fracture healing;thus, it has better clinical application prospect.

jaw; fracture healing; basic fibroblast growth factor; bone morphogenetic protein-2; gelatin sponge

R 782.4

A

10.7518/hxkq.2017.05.012

2016-12-08；

2017-03-09

寧夏銀川市科技攻關(guān)課題（2008061）

唐彥峰，主治醫(yī)師，碩士，E-mail：tyf1983@sina.com

周云彪，副主任醫(yī)師，E-mail：13171208970@163.com